基于響應(yīng)面法優(yōu)化四氫嘧啶羥化酶體外催化合成5-羥基四氫嘧啶條件※

王詩瑞,繆增強(qiáng),邢江娃,沈國平,朱德銳,李永臻

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心,西寧 810016)

相容性溶質(zhì)是耐鹽或嗜鹽菌為抵抗高鹽等外界極端條件而在體內(nèi)合成的有機(jī)小分子。四氫嘧啶類相容性溶質(zhì)具有耐高溫、抗干燥等特性,其中四氫嘧啶羥化酶(ectoine hydroxylase,EctD)是5-羥基四氫嘧啶(5-Hydroxyectoine,5-HE)在體內(nèi)合成的關(guān)鍵酶[1],是非含血紅素依賴的Fe2+與α-酮戊二酸(α-ketoglutarate)輔助的雙加氧超家族酶。本研究基于影響EctD催化合成5-HE的溫度、酸堿度、底物濃度和酶濃度等單因素實(shí)驗(yàn),利用響應(yīng)面法探索用EctD于體外催化合成5-HE的最優(yōu)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EctD為課題組自制品。α-ketoglutarate購自上海麥克林生化科技有限公司,FeSO4、KCl、SDS、Tris和EDTA均購自天津市大茂化學(xué)試劑廠,四氫嘧啶(Ectoine,Ect)標(biāo)準(zhǔn)品、5-羥基四氫嘧啶(5-Hydroxyectoine,5-HE)標(biāo)準(zhǔn)品購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

酶標(biāo)儀(Bio-Rad,XmarkTM)購自美國BioRad公司,恒溫水浴鍋(EYELA OSB-2200)購自日本東京理化公司,酸堿度計(jì)(PHS-25-3C-2F)購自上海雷磁公司,高效液相色譜儀(HPLC,Agilent 1260II)購自美國安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 5-HE標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.2.2 EctD反應(yīng)體系的建立

參照文獻(xiàn)[4]建立EctD反應(yīng)體系。配制10 mM TES緩沖液和0.5 mM Ect、1 mM Fe2+、10 mM α-ketoglutarate溶液,依次向反應(yīng)管中加入各溶液30 μL及酶液50 μL,得到最終酶反應(yīng)體系的總量為200 μL。反應(yīng)25 min后,利用HPLC檢測(cè),并根據(jù)2.1.1所示標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)方程計(jì)算5-HE合成量。

1.2.3 pH對(duì)EctD催化反應(yīng)的影響

將反應(yīng)溶液的pH分別調(diào)至5、6、7、8、9,在室溫下根據(jù)1.2.2所示反應(yīng)條件進(jìn)行催化反應(yīng)實(shí)驗(yàn),研究酸堿性對(duì)酶催化反應(yīng)的影響。

1.2.4 溫度對(duì)EctD催化反應(yīng)的影響

在最適酸堿度下,將酶反應(yīng)混合液分別置于25、30、35、40、45℃下,根據(jù)1.2.2所示反應(yīng)條件進(jìn)行催化反應(yīng)實(shí)驗(yàn),研究溫度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響。

1.2.5 底物濃度對(duì)EctD催化反應(yīng)的影響

在最適酸堿度和溫度下,在酶反應(yīng)混合液中分別加入不同濃度(0.25、0.50、1.00、1.25、1.50 mM)Ect,根據(jù)1.2.2所示反應(yīng)條件進(jìn)行催化反應(yīng)實(shí)驗(yàn),研究Ect濃度對(duì)酶催化反應(yīng)的影響。

1.2.6 響應(yīng)面Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),選擇X1(溫度)、X2(酸堿度)、X3(Ect濃度)、X4(EctD濃度)為影響因素,以5-HE產(chǎn)量為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)29組,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,其數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用Design-Expert 12.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并得到相關(guān)回歸方程。EctD反應(yīng)體系響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1,響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見表2。

表1 EctD酶反應(yīng)體系響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 酶促反應(yīng)單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 5-HE標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按1.2.1所示方法得到5-HE濃度與峰面積的對(duì)應(yīng)關(guān)系。不同濃度5-HE的HPLC峰面積見表3。以峰面積為縱坐標(biāo)、5-HE標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。5-HE標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖1。擬合得到回歸方程y=3874.9x+63.754,R2=0.9999,說明回歸方程可靠,可用以EctD反應(yīng)產(chǎn)物5-HE的定量分析。

表3 不同濃度5-HE的HPLC峰面積

2.1.2 pH對(duì)EctD催化反應(yīng)的影響

pH對(duì)EctD催化反應(yīng)的影響見表4、圖2。5-HE的產(chǎn)量隨著pH的增大呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),且pH在5～6及6和9之間時(shí)無差異,其余各指標(biāo)間的5-HE產(chǎn)量均有差異(P<0.05)。在pH為7時(shí)5-HE的產(chǎn)量達(dá)到最高值,說明EctD催化反應(yīng)的最適pH為7。

圖2 pH對(duì)EctD催化反應(yīng)影響圖

表4 不同pH下EctD酶催化合成5-HE的產(chǎn)量

2.1.3 溫度對(duì)EctD催化反應(yīng)的影響

溫度對(duì)EctD催化反應(yīng)的影響見表5、圖3。5-HE的產(chǎn)量隨著溫度的增加呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),且溫度在35℃～40℃之間時(shí)無差異,其余各指標(biāo)間5-HE產(chǎn)量均有差異(P<0.05)。在溫度為35℃～40℃之間時(shí),5-HE的量達(dá)到最高值,但在40℃～45℃之間時(shí),5-HE的產(chǎn)量快速降低。

圖3 溫度對(duì)EctD催化反應(yīng)影響圖

表5 不同溫度下EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量

2.1.4 Ect濃度對(duì)EctD催化反應(yīng)的影響

Ect濃度對(duì)EctD催化反應(yīng)的影響見表6、圖4。5-HE的產(chǎn)量隨著Ect濃度的增加呈現(xiàn)先增高后逐漸穩(wěn)定的趨勢(shì),且濃度在1.25～1.5 mM之間時(shí)無差異,其余各指標(biāo)間5-HE產(chǎn)量均有差異(P<0.05)。當(dāng)Ect濃度在1.25～1.5 mM之間時(shí),隨著Ect濃度的增加5-HE的產(chǎn)量幾乎不再增加,說明此時(shí)底物Ect與酶催化活性中心的結(jié)合達(dá)到飽和,酶促反應(yīng)效果達(dá)到最佳。

圖4 Ect濃度對(duì)EctD催化反應(yīng)影響圖

表6 不同Ect濃度下EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量

2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立及分析

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2,利用Design-Expert12.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,經(jīng)方差分析結(jié)果可知,X1(溫度)、X2(酸堿度)、X3(底物Ect濃度)、X4(EctD濃度)的單獨(dú)作用及X1(溫度)與X4(EctD濃度)的交互作用對(duì)EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而X1(溫度)與X2(酸堿度)、X1(溫度)與X3(底物Ect濃度)、X2(酸堿度)與X3(底物Ect濃度)、X2(酸堿度)與X4(EctD濃度)及X3(底物Ect濃度)與X4(EctD濃度)的交互作用對(duì)EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。二次多項(xiàng)式模型的回歸方程:

Y=19.63-2.74X1-0.6845X2+2.46X3+4.35X4-4.13X1X4-7.06X12-10.87X22-4.20X32-5.16X42

由方差分析得出,所選模型的F為9.41,P<0.0001,表明模型具有顯著性,各因素對(duì)其響應(yīng)值的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[2]。失擬項(xiàng)P為0.0634,不具有顯著性,因此該回歸方程可用于預(yù)測(cè)EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的結(jié)果。影響EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的最顯著因素是X4(EctD濃度),其次是X3(底物Ect濃度)和X1(溫度),而X2(酸堿度)的影響不大。X1(溫度)與X4(EctD濃度)的交互作用對(duì)EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量具有顯著影響(P<0.05),其他交互項(xiàng)對(duì)EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量影響相對(duì)較小。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

三維響應(yīng)面圖和等高線圖可分析各因素之間對(duì)EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的影響,每個(gè)響應(yīng)面圖都代表著其中任意一個(gè)因素保持零水平時(shí),其余兩個(gè)獨(dú)立因素之間的相互作用對(duì)響應(yīng)值影響的變化趨勢(shì)。響應(yīng)曲面坡度平緩,表明響應(yīng)值可以耐受處理因素的變異,不影響響應(yīng)值的大小;響應(yīng)面坡度陡峭,表明響應(yīng)值對(duì)處理因素敏感[3]。響應(yīng)面三維立體圖曲面的最高點(diǎn)表示各因素相互作用后的最佳反應(yīng)結(jié)果。根據(jù)回歸方程可做三維響應(yīng)面圖和等高線圖,見圖5,A1A2、B1B2、C1C2分別是溫度與酸堿度、Ect濃度與EctD濃度、溫度與EctD濃度相互作用對(duì)EctD催化合成5-HE產(chǎn)量影響的三維立體圖和等高線圖。其中溫度與EctD濃度交互作用的等高線圖見圖5C2(接近橢圓形),表明兩者交互作用顯著,其余交互作用不顯著,與方差分析結(jié)果一致。由圖5C1和A1可知當(dāng)酶濃度介于(0.4～1) U/mL、溫度介于30℃～45℃、酸堿度介于5～9之間時(shí),EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量可達(dá)到最大值。

圖5 響應(yīng)面分析圖

由Box-Benhnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得到了EctD體外催化反應(yīng)的最優(yōu)條件:溫度為35℃、pH為7、底物Ect濃度為1 mM、EctD濃度為0.6 U/mL。此條件下EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值為19.83/mg·L-1,實(shí)驗(yàn)測(cè)得EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量為(20.69±1.63) mg·L-1,與預(yù)測(cè)值接近(相對(duì)誤差=4.2%)。說明所得最優(yōu)條件可用于5-HE體外酶法合成。

3 討論

5-HE不僅具有抵抗高滲透壓、高溫、冷凍及干燥等作用[4],而且具有對(duì)生物大分子的保護(hù)功能[5],在生物醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[6]。但現(xiàn)有5-HE生產(chǎn)工藝產(chǎn)量偏低,限制了其在各領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。ectD是嗜鹽菌應(yīng)對(duì)極端環(huán)境時(shí)合成相容性溶質(zhì)5-HE的關(guān)鍵基因,廣泛存在于Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria等嗜鹽微生物中。目前提高5-HE產(chǎn)量的合成策略有工程菌的構(gòu)建和體外酶催化合成,但在工程菌胞內(nèi)合成5-HE的調(diào)控機(jī)制復(fù)雜,且后期5-HE與其前體物Ect分離純化困難。因此,本研究主要從EctD體外催化合成5-HE的方向研究酸堿度、溫度、底物濃度、酶濃度對(duì)EctD催化合成5-HE產(chǎn)量的影響。

源自Sphongopyxisalaskensis[7]、Paenibacilluslautus[8]、Alkalilimnicolaehrlichi[9]、Acidiphiliumcryptum[10]、Halomonaselongata[11]和Paenibacillusstutzeri[12]等菌株的EctD催化機(jī)制研究顯示,與Fe2+結(jié)合的His146、Asp148、His248,與α-ketoglutarate結(jié)合的Arg259、Ser250、Phe143、Arg131、Asn133、Phe95,及與Ect結(jié)合的Gln129、Trp152、Ser165、Phe242、Phe263等氨基酸殘基是保持EctD活性的必須結(jié)構(gòu)[13]。EctD催化合成5-HE的機(jī)理是,先由共底物α-ketoglutarate脫去羧基形成琥珀酸并釋放一分子二氧化碳,與此同時(shí),氧分子中的一個(gè)氧原子被納入琥珀酸鹽,而另一個(gè)氧原子取代四氫嘧啶芳香環(huán)上的5-位氫原子形成羥基,得到產(chǎn)物5-HE[14]。

響應(yīng)面優(yōu)化法是一種實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)方法,通過連續(xù)對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中各個(gè)因素水平進(jìn)行分析,構(gòu)建預(yù)測(cè)模型,找出實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件。本實(shí)驗(yàn)利用此方法來優(yōu)化EctD催化反應(yīng)條件,通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型的F為9.41,P小于0.0001,失擬項(xiàng)P為0.0634時(shí),模型具有顯著性而失擬項(xiàng)不具有顯著性,說明該回歸方程可信。X1(溫度)、X3(底物Ect濃度)、X4(EctD濃度)的單獨(dú)作用及 X1(溫度)與X4(EctD濃度)的交互作用對(duì)EctD催化合成5-HE的產(chǎn)量影響顯著,回歸方程一次項(xiàng)系數(shù)的絕對(duì)值的大小依次為X4(EctD濃度)>X3(底物Ect濃度)>X1(溫度)>X2(酸堿度),說明X4(EctD濃度)對(duì)EctD催化反應(yīng)的影響最大。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)主要篩選了對(duì)酶催化反應(yīng)影響較大的溫度、酸堿度和Ect、EctD濃度四個(gè)因素,利用Box-Benhnken法設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)EctD體外催化合成5-HE的體系進(jìn)行優(yōu)化,獲得了EctD體外催化反應(yīng)的最優(yōu)條件,為5-HE的相關(guān)研究及工業(yè)利用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。