未成熟蠶豆蛋白組分的分析

劉珍珍，陳友霞，楊文藝，孔霄，高春燕

（大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南大理671000）

蠶豆（Vicia faba L.），也稱胡豆、羅漢豆、佛豆、馬齒豆等，是一種一年生雙子葉豆科植物，也是我國(guó)重要經(jīng)濟(jì)作物。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and A-griculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2016 年全世界干蠶豆種植面積約為240.37 萬公頃，總產(chǎn)量高達(dá)445.97 萬噸，其中我國(guó)的種植面積為80.69 萬公頃，總產(chǎn)量為160.89 萬噸，分別占世界的33.57%和36.08%[1]。我國(guó)是世界重要的蠶豆種植大國(guó)，除山東、海南和東北三省極少種植，其余各省份均種植蠶豆，其中以云南、四川、湖北和江蘇為主，其蠶豆種植面積和總產(chǎn)量約占全國(guó)的85%[2]。在我國(guó)，大多數(shù)地區(qū)以飼料用蠶豆為主，其次是糧用蠶豆，菜用蠶豆栽培較少[3]。

蠶豆不僅來源廣泛、價(jià)格低廉，而且具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。蠶豆中平均含有24%～36%的蛋白質(zhì)[4-6]，與大豆相比，蠶豆蛋白中氨基酸種類較齊全，且脂肪含量低，其中主要以多不飽和脂肪酸為主[7]，更符合人體所需；同時(shí)其礦物質(zhì)和維生素含量相對(duì)高于禾谷類作物[8]，這些均符合現(xiàn)代人的綠色健康飲食觀念。未成熟蠶豆種子作為一種蔬菜，被越來越多的人們所喜愛，市場(chǎng)對(duì)其需求越來越高。但目前僅有少量研究報(bào)道了一些蠶豆品種的未成熟種子中的碳水化合物和酚類化合物的組成[4，9]，而蠶豆未成熟種子中蛋白質(zhì)組成動(dòng)態(tài)變化相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道較少。不同品種蠶豆的蛋白含量及其亞基組成存在顯著差異[10-11]，而蛋白組成及亞基種類對(duì)其加工品質(zhì)有一定的影響[12-13]。因此，明確不同品種蠶豆蛋白的組成和其亞基種類，為進(jìn)一步的推動(dòng)蠶豆蛋白加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重大意義。本研究通過分析5 個(gè)蠶豆品種的未成熟種子在3 個(gè)可食用階段的蛋白含量及其組成，為蠶豆相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)的進(jìn)一步研究和蠶豆蛋白產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取云南省大理農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶豆研究室培育的“鳳豆 6 號(hào)（FD6）”、“鳳豆 13 號(hào)（FD13）”、“鳳豆 15 號(hào)（FD15）”、“鳳豆 17 號(hào)（FD17）”和“鳳豆 18 號(hào)（FD18）”5個(gè)品種，在3 個(gè)可食用階段（S1 階段：播種后的第138天；S2 階段：播種后的第 156 天；S3 階段：播種后的第173 天）進(jìn)行采收，手工除去未成熟的蠶豆豆莢，將整粒蠶豆種子進(jìn)行冷凍干燥，干燥后于-4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.0%NaCl、75%乙醇、0.02 mol/L NaOH：分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)（G-250、R-250）、牛血清白蛋白：西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品：南京建成生物工程研究所；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（5×）、4×SDS-PAGE 分離膠緩沖液、4×SDS-PAGE 濃縮膠緩沖液：北京索萊寶科技有限公司；10%過硫酸銨替代物（ammonium persulfate substitute，APS）、30%丙烯酰胺-雙丙烯酰胺（acrylamide-bisacrylamide，Acr-Bis）（29 ∶1）：碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)（Scientz-ND 系列）：寧波新芝生物科技股份有限公司；可見分光光度計(jì)（722N 型）：上海菁華科技儀器有限公司；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（TGL-16M）：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超聲儀（SY2200TP）：上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司；水浴振蕩器（HZS-HA）：哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；蛋白質(zhì)電泳儀（DYCD-31DN）：北京六一儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)組分提取

參考文獻(xiàn)[14]的方法，采用Osboren 分類法連續(xù)提取蠶豆種子中的蛋白質(zhì)組分。精密稱取0.5 g 樣品，按固液比 1 ∶10（g/mL），分別用蒸餾水、2.0%NaCl、75%乙醇和0.02 mol/L NaOH，依次在25 ℃下超聲輔助提取30 min，然后將每次提取物在4 ℃12 000 g 離心5 min，獲得清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)組分的含量。以牛血清白蛋白為對(duì)照品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程為：y =0.005 2x+0.113 8（0～100 μg，R2=0.993 2），其中 y為吸光度，x 表示蛋白質(zhì)含量，單位為μg。結(jié)果表示為毫克牛血清白蛋白當(dāng)量（bovine serum albuminequivalent weight，BSAE）每克樣品干重（dry weight，DW）。

1.3.3 SDS-PAGE 電泳

參考Evangelho 等[15]的研究方法對(duì)蠶豆蛋白質(zhì)提取液進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。將50 μL 2 mg/mL 蠶豆種子蛋白質(zhì)提取液與25 μL 上樣緩沖液混合后沸水浴5 min。待冷卻后，取20 μL 進(jìn)行點(diǎn)樣。將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)（10 kDa～170 kDa）的混合物作為 Maker，使用 1×SDS緩沖液（含0.3%TrisBase、2.4%甘氨酸、0.1%SDS）進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳，凝膠厚度1.5 mm，濃縮膠濃度4%，分離膠濃度8%，恒流30 mA，待指示劑遷移至凝膠底部后結(jié)束電泳。用考馬斯亮藍(lán)（R-250）染色液染色30 min 后，用脫色液（無水乙醇∶冰醋酸∶水=10 ∶7 ∶83，體積比）進(jìn)行脫色，待條帶清晰后拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3 次，所有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0的最小顯著性差異法（the least significant difference，LSD）進(jìn)行差異顯著性分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)組分

5 個(gè)品種的未成熟蠶豆種子在3 個(gè)可食階段的蛋白質(zhì)組分含量見圖1。

圖1 5 個(gè)品種的未成熟蠶豆種子在3 個(gè)可食階段的蛋白質(zhì)組分含量Fig.1 Content of protein components of five varieties of immature broad bean seeds in three edible stages

從S1 到S3，5 個(gè)品種的清蛋白含量均顯著增加，尤其是鳳豆6 號(hào)和15 號(hào)，其清蛋白含量分別增加了75.73 和144.81 倍；同一可食階段，不同品種清蛋白含量不同，在S1，鳳豆13 號(hào)含量最高，鳳豆6 號(hào)最低；在S2 可食階段，鳳豆13 號(hào)含量最高，鳳豆15 號(hào)最低；在S3 可食階段，鳳豆13 號(hào)含量最高，鳳豆18 號(hào)最低（圖1A）。

球蛋白含量變化與清蛋白相同，從S1 到S3，5 個(gè)品種的球蛋白含量均顯著增加，鳳豆6 號(hào)、13 號(hào)、15號(hào)、17 號(hào)和 18 號(hào)分別增加了 51.09、2.62、80.22、10.00和7.6 倍；且同一可食階段，不同品種球蛋白含量具有差異，在S1 和S2 均為鳳豆13 號(hào)含量最高，鳳豆15 號(hào)最低，而到S3 階段，鳳豆15 號(hào)含量最高，鳳豆13 號(hào)最低（圖1B）。

與球蛋白和清蛋白相反，從S1 到S3，5 個(gè)品種醇溶蛋白含量均顯著降低，鳳豆 6 號(hào)、13 號(hào)、15 號(hào)、17 號(hào)和 18 號(hào)分別下降 51.11%，46.14%，53.66%，35.63%和64.50%；同一可食階段，不同品種醇溶蛋白含量不同，在S1 階段，鳳豆6 號(hào)和15 號(hào)含量相對(duì)較高，鳳豆17 號(hào)最低；在S2 階段，鳳豆15 號(hào)含量最高，鳳豆17號(hào)含量仍最低；到S3 階段，鳳豆6 號(hào)和17 號(hào)含量較高，而鳳豆18 號(hào)最低（圖1C）。

谷蛋白含量在整個(gè)可食過程中的變化呈現(xiàn)多樣性。從S1 到S3，鳳豆13 號(hào)和18 號(hào)顯著降低，而鳳豆6號(hào)、15 號(hào)和17 號(hào)谷呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；同一可食階段，不同品種谷蛋白含量不同，在S1 階段，鳳豆13 號(hào)含量最高，而鳳豆6 號(hào)和鳳豆15 號(hào)的含量相對(duì)較少；但到S2、S3 階段，鳳豆6 號(hào)的含量最高，鳳豆17號(hào)含量最少（圖1D）。

2.2 未成熟蠶豆種子的蛋白質(zhì)組分SDS-PAGE電泳

蛋白質(zhì)組分電泳結(jié)果顯示，醇溶蛋白和谷蛋白未檢測(cè)出條帶。這一現(xiàn)象與Vasconcelos 等[16]對(duì)3 種豇豆品種的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行電泳的結(jié)果相同。因此，僅對(duì)清蛋白和球蛋白的電泳圖譜進(jìn)行了分析，結(jié)果見圖2。

圖2 5 個(gè)品種的未成熟蠶豆種子在3 個(gè)可食階段的蛋白質(zhì)組分SDS-PAGE 電泳Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of protein components of five varieties of immature broad bean seeds in three edible stages

5 種未成熟蠶豆種子在3 個(gè)可食用階段的清蛋白SDS-PAGE 電泳圖譜見圖2A，可觀察到其條帶數(shù)從S1 到 S3 階段明顯增加。在 S1 階段，鳳豆 6 號(hào)、13 號(hào)、15 號(hào)、17 號(hào)和 18 號(hào)分別可清晰看到至少 1、4、1、3 和3 個(gè)條帶，且均含有分子量為40 kDa 的條帶。到S2 階段，至少可觀察到其分別有6、7、5、9 和7 個(gè)蛋白質(zhì)條帶，其中都具有15 至35kDa 的分子量的條帶。在S3階段，5 個(gè)品種均發(fā)現(xiàn)了超過10 條蛋白質(zhì)條帶，均有分子量為 15、21、24、31、35 kDa～40 kDa、55、60 kDa～65 kDa 和 70 kDa～85 kDa 的條帶。從 S1 到 S2 階段，40 kDa 的條帶變淺，新增15 kDa 至35 kDa 的條帶，說明未成熟蠶豆種子在合成小分子量的蛋白的同時(shí)大分子的蛋白發(fā)生水解，變成小分子量的蛋白；從S2 到S3 階段，15 kDa 至35 kDa 的小分子量條帶顏色變淺，其含量減少，出現(xiàn)了 60 kDa～65 kDa 和 70 kDa～85 kDa，甚至更大分子量的條帶，表明小分子量的蛋白合成高分子蛋白。

5 種未成熟蠶豆種子在3 個(gè)可食用階段的球蛋白SDS-PAGE 電泳圖譜見圖2B，可發(fā)現(xiàn)與清蛋白類似的現(xiàn)象，其條帶數(shù)從S1 到S3 階段明顯增加。在S1 階段，鳳豆6 號(hào)、鳳豆13 號(hào)、鳳豆15 號(hào)、鳳豆 17 號(hào)和鳳豆18 號(hào)分別可清晰看到至少 2、6、2、3 和 3 個(gè)蛋白質(zhì)條帶，且均含有分子量為40 kDa 的條帶。到S2 階段，至少可觀察到其分別有 6、8、4、7 和 6 個(gè)蛋白質(zhì)條帶，其中都具有20 kDa 至35 kDa 和55 kDa 分子量的條帶。在S3 階段，5 個(gè)品種均發(fā)現(xiàn)了超過10 條蛋白質(zhì)亞基條帶，均有分子量為 15、21、24、35 kDa～40、55、60 kDa～65 kDa 和 70 kDa～85kDa 的條帶。從 S1 到 S2 階段，40 kDa 的條帶變淺甚至消失，新增20 kDa 至35 kDa以及55 kDa 的條帶，說明未成熟蠶豆種子在合成小分子量的蛋白的同時(shí)40 kDa 的蛋白發(fā)生水解，變成小分子量的蛋白，或合成為更大分子蛋白；從S2 到S3 階段，15 kDa 至35 kDa 的小分子量條帶顏色變淺，40 kDa條帶再次出現(xiàn)且加深，出現(xiàn)了60 kDa～65 kDa 和70 kDa～85 kDa，甚至更大分子量的條帶，表明小分子量的蛋白合成了高分子蛋白。

3 結(jié)論與討論

3.1 未成熟蠶豆種子的蛋白質(zhì)組分含量變化

蠶豆蛋白主要由清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和其他組分構(gòu)成[10]。其中清蛋白主要為一些功能性蛋白，球蛋白為種子的貯藏蛋白[17]。采用連續(xù)分級(jí)提取蛋白的方法，分別提取了5 個(gè)未成熟蠶豆品種在3 個(gè)可食階段的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。結(jié)果表明，谷蛋白和清蛋白是相對(duì)含量最多的組分。這與之前的研究[18-19]認(rèn)為絕大多數(shù)的蠶豆成熟種子球蛋白是最主要的蛋白組分不一致。此外，隨著采收時(shí)間的延后，蠶豆種子的逐漸成熟，不同蠶豆種子清蛋白和球蛋白的含量明顯增加；醇溶蛋白含量明顯減少；谷蛋白含量因品種的不同，而表現(xiàn)出多樣性。與之前的研究[20]報(bào)道：在蠶豆種子成熟過程中，清蛋白含量先降低后升高，谷蛋白和醇溶蛋白含量先升高后降低，而球蛋白含量呈波形變化存在一定差異，其可能與蠶豆品種、采樣時(shí)間、采用的提取方法的不同等有關(guān)。

3.2 未成熟蠶豆種子的蛋白質(zhì)組分SDS-PAGE電泳分析

隨著蠶豆種子的不斷成熟，清蛋白電泳條帶逐漸增多，表明清蛋白的種類不斷豐富。不同蠶豆品種間的清蛋白分子量大小存在差異，但均具有15、21、24、31、35～40、55、60 kDa～65 kDa 和 70 kDa～85 kDa 分子量大小的蛋白，這與劉玉皎等[14]的研究所顯示的清蛋白主要有22 kDa～97 kDa 等7 個(gè)基本分子量大小的蛋白組成基本相符。另5 個(gè)蠶豆品種的球蛋白均具有15、21、24、35～40、55、60 kDa～65 kDa 和 70 kDa～85kDa分子量大小的蛋白，這與劉玉皎等[10]、宋曉敏等[11]、李雪琴等[19]的研究基本相符。隨著蠶豆種子的不斷成熟，其在每個(gè)可食用階段的蛋白組分的組成和含量變化豐富?？赏ㄟ^進(jìn)一步的研究其具體分子量的蛋白組分的功能，為根據(jù)具體需求選擇采收期提供科學(xué)依據(jù)。