氮肥對大豆根際土壤微生物群落和代謝的影響

高瑞敏 ，嚴(yán)君 ，鄒獅 ，韓曉增 ，鄒文秀 ，陳旭 ，陸欣春 ，楊舒純 ，許夢琪

（1.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所, 黑龍江 哈爾濱 150081； 2.中國科學(xué)院大學(xué), 北京100049）

0 引言

土壤代謝產(chǎn)物主要來源于植物的根系分泌、根際微生物代謝以及土壤有機(jī)質(zhì)的分解過程等[1]，它們通過充當(dāng)根際微生物的碳源、信號分子等對根際微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而對土壤理化性質(zhì)、作物生長發(fā)育等起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[2]。大豆具有共生固氮功能，同時也是需氮較高的作物，施用氮肥會改變土壤微生物代謝及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)等微生物學(xué)過程，從而直接或間接影響土壤養(yǎng)分和大豆的生長發(fā)育[3-4]。因此，闡明氮肥施用條件下大豆根際土壤微生物群落和代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律至關(guān)重要。

土壤微生物群落及代謝產(chǎn)物對氮肥的響應(yīng)是復(fù)雜的，目前其影響機(jī)制仍有爭論[5-7]。長期施氮顯著降低農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中固氮微生物的豐度和多樣性，而慢生根瘤菌屬的相對豐度有所增加[8]。高氮處理使得小麥中參與氮代謝的氨基酸、碳水化合物、有機(jī)酸及脂質(zhì)含量顯著上調(diào)。此外，施氮引起野生大豆根系中氨基酸類代謝物下調(diào)，糖醇、有機(jī)酸以及次生代謝類物質(zhì)上調(diào)[9]。以往的研究已證實(shí)：施氮會顯著改變了土壤代謝產(chǎn)物和土壤微生物群落組成，但目前有關(guān)植物根際土壤代謝物研究較少，且缺乏根際土壤代謝組學(xué)同根際土壤固氮菌群落的聯(lián)合研究。本研究選擇東北典型黑土與本地主栽大豆品種，通過對大豆施用不同量氮肥，研究不同施氮水平下土壤根際代謝物和固氮微生物群落差異，揭示不同施氮水平下根際土壤代謝物同土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系，將有助于我們認(rèn)識不同氮素水平下根系分泌物介導(dǎo)的植物-土壤微生物間相互作用過程，對于合理有效的調(diào)控根際生態(tài)系統(tǒng)、促進(jìn)作物增產(chǎn)、提高土壤養(yǎng)分利用效率以及生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展等方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2021 年5 月至10 月在中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所試驗場（45°38′N，126°39′E）進(jìn)行。供試土壤為黑土。供試大豆品種為東生35。試驗設(shè)置兩個施氮水平：（1）CK，不施氮；（2）SN，施氮量為100 mg·kg-1土。采用盆栽試驗，每盆（PVC 材料，直徑20 cm，高45 cm）裝土5.5 kg。氮肥在大豆生長發(fā)育的V2 期，以水溶液的形式隨灌溉水施入，每個處理4 次重復(fù)，隨機(jī)排列。供試氮肥為尿素（46%N），磷鉀肥在土壤裝盆前與土壤充分混勻作為基肥，磷肥為過磷酸鈣（15% P2O5），鉀肥為硫酸鉀（52% K2O），施用量均為3 mg·kg-1土。

1.2 樣品采集

在大豆播種后第37 d（第4 節(jié)復(fù)葉全展期），即施氮肥后第10 天，將完整的大豆根系從盆栽土壤中取出，輕輕抖落以去除松散粘附在根系的根區(qū)土壤，將未抖落緊密粘附在根系的土壤（＜ 2 mm 厚度）用毛刷刷下即為根際土壤。將獲得的不同處理下的根際土壤樣品用無菌袋迅速帶回實(shí)驗室過2 mm 篩后保存在-80 ℃冰箱，用于土壤代謝物和固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)的分析。

1.3 固氮微生物群落結(jié)構(gòu)測定

固氮微生物群落結(jié)構(gòu)測定參照J(rèn)onathan 等[10]實(shí)驗方法。稱取0.5 g 新鮮土壤，采用FastDNA SPIN 試劑盒（MP Biomedicals，USA）提取土壤總DNA[11]。使用引物對nifH-F/nifH-R（5'-AAAGGYGGYGGWATCGGYAARTCCAC-3'）/（5'-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATSGCCAT-3'）擴(kuò)增nifH 基因。PCR在含有4 μL 5×FastPfu 緩沖液、2 μL dNTPs、正向引物與反向引物各0.8 μL、0.4 μLFastPfu 聚合酶、10 ng模板DNA 和雙蒸水的20 μL 反應(yīng)體系中進(jìn)行。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)，72 ℃ 10 min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物在Illumina MiSeq PE 300 上測序[12]。

測序后，使用QIIME Pipeline（Version 1.9.0）處理原始數(shù)據(jù)，去除長度小于200 bp 或平均堿基質(zhì)量得分小于20 的序列后使用Fun Gene Pipeline 工具轉(zhuǎn)化為氨基酸序列，質(zhì)控后使用UPARSE 軟件按照97%的相似性水平，將高質(zhì)量序列進(jìn)行OTU 聚類，從每個OTU 中選取具有代表性的序列翻譯成氨基酸序列，在NCBI 網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/）進(jìn)行分類鑒定。

1.4 土壤代謝物提取及測定

代謝物質(zhì)提取參照Ma 等[13]提出的試驗方法，具體如下：稱取0.2 g 新鮮土樣放入2 mL Eppendorf 管中，加入80%的甲醇800 μL 和800 μL 乙酸乙酯，震蕩，超聲15 min，4 ℃，12 000 g 離心20 min，取上清液，真空濃縮，濃縮后，每管加入80%甲醇100 μL 復(fù)溶，取10 μL 上清液測定。

液相色譜分離在Dionex Ulti Mate 3000 系統(tǒng)上進(jìn)行。在正/負(fù)極性切換模式下，采用了反相液相色譜（Reverse Phase Liquid Chromatography，RPLC）和親水作用色譜（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）兩種單獨(dú)的檢測方法，兩種方法的色譜條件見表1。

表1 液相色譜條件Table 1 Liquid chromatography conditions

質(zhì)譜儀設(shè)定參照Ma 等[13]的質(zhì)譜儀設(shè)定參數(shù)F。使用了配備有加熱的電噴霧電離源的Q Exactive 質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司）。正模式噴霧電壓3.5 kV，負(fù)模式噴霧電壓3.0 kV。毛細(xì)管溫度設(shè)定為320 ℃。鞘氣和輔助氣體分別設(shè)置為40 個和5 個任意單位的流量，采用了兩種采集模式。HILIC 分析在m/z 范圍為70 ～ 1000 的全掃描模式下分析質(zhì)控（Quality Control，QC）樣本，土樣和空白對照樣品，分辨率為70,000 半峰全寬（FWHM），自動增益控制（AGC）目標(biāo)為1e5，最大注入時間為50 ms，以隨機(jī)順序注射土壤樣品，減少系統(tǒng)偏差。RPLC 分析參數(shù)如下：分辨率為17 500 （FWHM）、AGC 目標(biāo)為1e5、最大注入時間50 ms、階梯式碰撞（NCE15、40、60）和前10 個峰值的循環(huán)計數(shù)。為QC 設(shè)置了不同的m/z范圍（70-125，120-175，170-225，220-275，270-325，320-405，400-1000，70-1000）以最大化MS2 光譜。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

固氮微生物組間差異統(tǒng)計分析（STAMP）采用doBy 包和ggplot2 包（R version 4.1.3）；對于使用RPLC 和HILIC 測定法檢測到的代謝物，使用具有較高保留時間的方法的峰面積進(jìn)行定量，采用SIMCA 14.1（Umetrics，Umea，瑞典）對代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行Pareto 標(biāo)準(zhǔn)化處理、無監(jiān)督主成分分析（PCA，Principal Component Analysis）、正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA，Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis），OPLS-DA 模型的驗證使用200 次迭代的置換測試測試[14]，判斷模型是否“過擬合”，能否能較好的描述樣本，作為模型生物標(biāo)記物群尋找的前提。SPSS22.0 進(jìn)行t 檢驗（Student's t-text），采用OPLS-DA 中的S-plot、變量權(quán)重值（VIP，variable important in projection）結(jié)合t 檢驗p值與差異倍數(shù)（FC，fold change）篩選出不同施氮水平下大豆根際土壤中的差異性代謝物；采用MetaboAnalyst 5.0 進(jìn)行聚類分析和KEGG 通路分析[15]；采用scipy（Python）Version1.0.0 進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)組成

不同施氮處理下的固氮微生物在屬水平上的優(yōu)勢固氮菌均為慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、固氮?dú)渥责B(yǎng)單胞菌屬（Azohydromonas）、甲基胞囊菌屬（Methylocystis）、纖發(fā)菌屬（Leptothrix）、固氮彎曲菌屬（Azoarcus）、鐵氧化菌屬（Sideroxydans）、厭氧黏桿菌屬（Anaeromyxobacter）、甲基桿狀菌屬（Methylobacter）、弗蘭克氏菌屬（Frankia）、中華根瘤菌屬（Sinorhizobium），其中Bradyrhizobium為絕對優(yōu)勢菌屬相對豐度＞15%（圖1）。但SN 處理下的不同優(yōu)勢固氮菌屬的相對豐度均顯著低于對應(yīng)的CK 處理（P＜ 0.05）。

圖1 不同施氮處理下土壤固氮微生物屬水平群落組成及差異Fig. 1 Difference test histogram of community composition of diazotrophic in genus level under different nitrogen fertilizations

2.2 土壤代謝物代謝圖譜及主成分分析

不同施氮處理下檢測出的大豆根際土壤代謝物共有10 類83 種，包括17 種有機(jī)酸、13 種有機(jī)雜環(huán)化合物、13 種脂肪?；?、6 種有機(jī)含氮化合物、6 種聚酮類化合物、5 種苯環(huán)型化合物、4 種核酸及其衍生物、2 種碳水化合物、1 種生物堿及16 種其它類化合物。有機(jī)酸、有機(jī)雜環(huán)化合物和脂肪酰基為占比最多的類別，分別占代謝物總數(shù)的15.7% ～ 20.5%，其次為有機(jī)含氮化合物（7.23%）、聚酮類化合物（7.23%）和苯環(huán)型化合物（6.02%）。

將所有土壤樣本及質(zhì)控樣本QC 提取得到的峰，經(jīng)Pareto-scaling 處理后進(jìn)行PCA 分析（圖2），SN與CK 處理的根際土壤代謝物明顯分離，QC 樣本聚類，模型R2X = 0.949，其余參數(shù)數(shù)值均＞0.5，且均在置信區(qū)間，表明該研究數(shù)據(jù)集具有較高的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，可用于不同施氮處理下的大豆根際土壤代謝物差異分析。

圖2 無監(jiān)督主成分分析（PCA）圖Fig. 2 Unsupervised principal component analysis (PCA)

2.3 土壤差異代謝物

采用OPLS-DA 模型篩選差異代謝物，累計解釋能力參數(shù)R2X 和R2Y 分別為0.922 和0.978，預(yù)測能力參數(shù)Q2= 0.961，參數(shù)均大于0.4，表明此模型可靠，對模型進(jìn)行隨機(jī)分組200 次的置換檢驗（Permutation text），Q2回歸直線與Y 軸的截距小于0，該模型不存在過擬合現(xiàn)象（圖3）。基于OPLS-DA 模型，采用變量權(quán)重值VIP 并結(jié)合t 檢驗P值與差異倍數(shù)FC 進(jìn)行差異性表達(dá)代謝物篩選。設(shè)置VIP 閾值≥ 1，P＜ 0.05且FC ＞ 1.2 或FC ＜ 0.83，在CK 和SN 處理下根際土壤中篩選出29 種顯著性差異的代謝物。與CK 處理相比，SN 處理的大豆根際土壤有28 種代謝物表達(dá)量上調(diào)，其中包括8 種有機(jī)酸、7 種聚酮類化合物、6種脂肪?；惢衔?、2 種核酸及其衍生物、2 種有機(jī)含氮化合物、1 種有機(jī)雜環(huán)化合物、1 種碳水化合物和1 種其它類化合物（表2）。其中，油酸酰胺（Oleamide）、9,12-十八碳二烯醛（9,12-Octadecadienal）、?；撬幔═aurine）、月桂酰胺（Lauramide）、谷氨酸（Glutamic acid）、膽堿（Choline）、亞油酰胺（Linoleamide）、大豆苷（Daidzin）、腺嘌呤（Adenine）等代謝物差異倍數(shù)FC ≥ 1.5 倍。此外，脂肪?；惢衔锝嫠狨０罚‥rucamide）相對含量顯著下降（P＜ 0.05），其差異倍數(shù)FC 介于1.2 ～ 1.5 倍之間（圖4 和圖5）。

圖3 OPLS-DA 分析得分圖及置換檢驗圖Fig. 3 OPLS-DA analysis score chart and permutation test

圖4 差異代謝物火山圖Fig. 4 Volcano of differential metabolites

圖5 差異代謝物聚類分析熱圖Fig. 5 Heatmap of cluster analysis for differential metabolites

表2 不同施氮處理下大豆根際土壤差異代謝物Table 2 Differential metabolites in soybean rhizosphere soil under different nitrogen fertilizations

2.4 土壤代謝物代謝途徑

不同施氮水平影響大豆根際不同土壤代謝物相互作用，形成不同的代謝途徑（圖6）。不同處理的代謝相關(guān)通路包括：精氨酸生物合成（Arginine biosynthesis）、精氨酸和脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）、谷胱甘肽代謝（Glutathione metabolism）、氨基?；?tRNA 生物合成（Aminoacyl-tRNA biosynthesis）、?；撬岷蛠喤；撬岽x（Taurine and hypotaurine metabolism）、嘌呤代謝（Purine metabolism）、氮代謝（Nitrogen metabolism）、丁酸鹽代謝（Butanoate metabolism）、玉米素生物合成（Zeatin biosynthesis）、丙酮酸代謝（Pyruvate metabolism）、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（Phenylalanine, tyrosine and tryptophan biosynthesis）、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（Glycine, serine and threonine metabolism），這些通路主要參與大豆根際土壤氨基酸合成與碳水化合物代謝途徑，其中精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝差異顯著（P ＜0.05）。由表2 可知，SN 處理下精氨酸生物合成途徑中谷氨酸（L-Glutamate）、瓜氨酸（L-Citrulline）和精氨酸（L-Arginine）相對含量顯著上升；精氨酸和脯氨酸代謝途徑中除了精氨酸（L-Arginine）和谷氨酸（L-Glutamate）相對含量顯著上升外，4-胍基丁酸（4-Guanidinobutanoate）的相對含量亦顯著上升。

圖6 特異代謝物代謝途徑富集Fig. 6 Enrichment of metabolic pathway of specific metabolites

2.5 土壤固氮微生物群落與差異代謝產(chǎn)物的相關(guān)性

慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、固氮?dú)渥责B(yǎng)單胞菌屬（Azohydromonas）與超85%的上調(diào)差異代謝物呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜ 0.05），其中與上調(diào)代謝物9,12-十八碳二烯醛（9,12-Octadecadienal）、油酸酰胺（Oleamide）、瓜氨酸（Citrulline）、月桂酰胺（Lauramide）、谷氨酸（Glutamic acid）、?；撬幔═aurine）等超60%的上調(diào)差異代謝物呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜ 0.01，圖7）。

鐵氧化屬細(xì)菌（Sideroxydans）與超90%的上調(diào)差異代謝物呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P ＜0.05），其中與乳酸（Lactic Acid）、膽堿（Choline）、月桂酰胺（Lauramide）、大豆苷（Daidzin）、腺嘌呤（Adenine）、谷氨酸（Glutamic acid）等超70%的上調(diào)差異代謝物呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。弗蘭克氏菌屬（Frankia）與超80%的上調(diào)差異代謝物呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜ 0.05），其中與3-羥基丁酸（3-Hydroxybutyric acid）、染料木素（Genistein）、乳酸（Lactic Acid）、9,12-十八碳二烯醛（9,12-Octadecadienal）、谷氨酸（Glutamic acid）等超55%的上調(diào)差異代謝物呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜ 0.01）。

纖發(fā)菌屬（Leptothrix）同超65%的上調(diào)差異代謝物顯著負(fù)相關(guān)（P ＜0.05），其中同精氨酸（Arginine）、芒柄花素（Formononetin）、十六碳酰胺（Hexadecanamide）、大豆苷（Daidzin）等超10%的上調(diào)代謝產(chǎn)物呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P ＜0.01）。

固氮彎曲菌屬（Azoarcus）、中華根瘤菌（Sinorhizobium）與超60%的上調(diào)差異代謝物呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P ＜0.05），其中與4-胍基丁酸（4-Guanidinobutyric acid）、9,12-十八碳二烯醛（9,12-Octadecadienal）、油酸酰胺（Oleamide）、亞油酰胺（Linoleamide）、膽堿（Choline）等超25%的上調(diào)差異代謝物呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P ＜0.01）。厭氧黏桿菌屬（Anaeromyxobacter）與超60%的上調(diào)代謝物呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P ＜0.05），其中與4-胍基丁酸（4-Guanidinobutyric acid）、白楊黃素（Chrysin）、9,12-十八碳二烯醛（9,12-Octadecadienal）、油酸酰胺（Oleamide）、瓜氨酸（Citrulline）等超30%的上調(diào)差異代謝物呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P ＜0.01）。

甲基胞囊菌屬（Methylocystis）、甲基桿狀菌屬（Methylobacter）與超55%的上調(diào)差異代謝物呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P ＜0.05），其中與9,12-十八碳二烯醛（9,12-Octadecadienal）、油酸酰胺（Oleamide）、月桂酰胺（Lauramide）、癸酰胺（Decanamide）、焦谷氨酸（Pyroglutamic acid）、?；撬幔═aurine）等超25%的上調(diào)差異代謝物呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P ＜0.01）。

慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、固氮?dú)渥责B(yǎng)單胞菌屬（Azohydromonas）與下調(diào)差異代謝物芥酸酰胺（Erucamide）呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜ 0.01）；鐵氧化屬細(xì)菌（Sideroxydans）、弗蘭克氏菌屬（Frankia）、固氮彎曲菌屬（Azoarcus）、甲基胞囊菌屬（Methylocystis）、甲基桿狀菌屬（Methylobacter）與下調(diào)差異代謝物芥酸酰胺（Erucamide）呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜ 0.05）。

3 討論

3.1 不同施氮處理對大豆根際代謝物質(zhì)的影響

土壤中的氨基酸、脂質(zhì)、黃酮以及苯基丙類化合物等代謝產(chǎn)物對氮較敏感[16]。Shi 等[17]研究表明，施氮對枸杞中黃酮類、氨基酸、多糖等代謝產(chǎn)物有顯著影響，其中黃酮類化合物隨著施氮量的增加而顯著上調(diào)。Zhen 等[18]研究表明，小麥高氮處理下參與氮代謝的氨基酸、碳水化合物、有機(jī)酸及脂質(zhì)含量顯著上調(diào)。Liu 等[9]研究表明，施氮處理下野生大豆根系中氨基酸類代謝物下調(diào)，糖醇、有機(jī)酸以及次生代謝類物質(zhì)上調(diào)。本研究中SN 處理相較于CK 處理，96.6%（28/29）的差異代謝物上調(diào)，且以有機(jī)酸及其衍生物含量最高，而下調(diào)代謝物僅1 種為脂肪?；惢衔铩嫠狨０罚‥rucamide）。對于豆科作物，脂類物質(zhì)對根瘤的形成和發(fā)育至關(guān)重要，脂肪酰胺類物質(zhì)是一類含氮的脂溶性化合物，在豆科作物根部氮循環(huán)過程中充當(dāng)碳底物以及復(fù)雜的信號傳導(dǎo)功能[19-20]，脂肪?；惢衔锒酁橹觉０奉惢衔铮谑┑幚硐略擃惢衔锝^大多數(shù)情況下是上調(diào)的，是調(diào)節(jié)大豆根際與土壤關(guān)系的重要物質(zhì)[21]。本研究中將差異倍數(shù)（FC）上調(diào)至1.5 倍以上后，上調(diào)差異代謝物主要為脂肪?；惢衔铮鵁o下調(diào)差異代謝物，有關(guān)脂肪?；惢衔锏恼{(diào)節(jié)作用需要在以后的研究中開展深入研究。

3.2 不同施氮處理對大豆根際代謝通路的影響

同一植物在響應(yīng)不同環(huán)境條件時采取的策略往往不同，即根際代謝產(chǎn)物的途徑和通路有差異[22-24]。本研究通過對不同施氮水平的大豆根際土壤代謝物分析，共得到16 條相關(guān)代謝通路，其中有7 條代謝通路同氨基酸合成有關(guān)，4 條同碳水化合物代謝相關(guān)，表明大豆根際土壤氨基酸合成與碳水化合物代謝受氮肥的影響較大。其中，精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝兩條通路差異最為明顯，參與該代謝通路的特異性代謝物均顯著上調(diào)，谷氨酸、瓜氨酸、精氨酸均被富集到了該通路上。谷氨酸可為植物中含氮化合物的生物合成提供前體，精氨酸具有貯藏氮素營養(yǎng)的功能[25-26]。有研究表明在高硝態(tài)氮水平下，煙草根系中與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成的相關(guān)基因表達(dá)量上調(diào)[27]。在本研究中SN 處理下，富集至苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成等代謝通路的代謝物含量顯著上調(diào)，因此氮素是調(diào)控根際氨基酸生物合成的重要因素[28]。

3.3 不同施氮處理對大豆根際土壤差異代謝產(chǎn)物與固氮微生物群落相關(guān)性的影響

根際土壤中的代謝物來源多樣，其中植物根系分泌物和微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物是根際土壤代謝產(chǎn)物的最主要來源[1]，而根系分泌物作為植物-根際微生物相互作用的介質(zhì)，是微生物的重要營養(yǎng)來源[29-30]，其含量及其組成的變化能對根際微生物造成影響，同時根際微生物群落構(gòu)成的不同又會對根系分泌物造成影響，二者相互作用，彼此影響[4]。

以往的研究已證實(shí)，施氮會導(dǎo)致固氮微生物群落更容易受到外部環(huán)境的影響，從而改變共生關(guān)系[5-7]。慢生根瘤菌屬、中華根瘤菌、固氮?dú)渥责B(yǎng)單胞菌屬為屬于革蘭氏陰性變形菌，弗蘭克氏菌屬為絲狀革蘭氏陽性放線菌，這些固氮微生物均可作為土壤腐生菌或植物內(nèi)生菌（根瘤內(nèi)部）參與根際土壤氮循環(huán)[31]，對氮較為敏感，目前普遍認(rèn)為在高氮水平下其豐度隨供氮水平的增加而顯著降低[32-34]。本研究中施氮SN 處理與CK 相比，顯著降低了慢生根瘤菌屬、固氮?dú)渥责B(yǎng)單胞菌屬、中華根瘤菌屬以及弗蘭克氏菌屬的相對豐度），主要是由于施氮肥改變了土壤理化性質(zhì)或影響固氮微生物與其它土壤微生物間的競爭關(guān)系，從而直接或間接影響根際固氮微生物的豐度與組成[35]。

進(jìn)一步分析固氮微生物菌群與代謝物之間的相互關(guān)系表明，慢生根瘤菌屬、固氮?dú)渥责B(yǎng)單胞菌屬以及弗蘭克氏菌屬同大多數(shù)上調(diào)代謝物顯著負(fù)相關(guān)，同下調(diào)差異代謝物顯著正相關(guān)；中華根瘤菌屬同大多數(shù)上調(diào)代謝物顯著負(fù)相關(guān)（圖7）。SN 處理根際土壤代謝產(chǎn)物相對豐度增加，可能是由于施氮增加了土壤的速效氮含量，促使大豆向根系分泌更多有機(jī)物質(zhì)，而這類有機(jī)物質(zhì)可以通過充當(dāng)根際微生物的簡單碳底物、信號分子以及促進(jìn)微生物活性等途徑對根際微生物代謝以及群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[2]。結(jié)合代謝物與根際固氮微生物變化趨勢表明，施氮處理可能通過提高土壤養(yǎng)分，影響根系分泌物，從而直接或間接對根際土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。

4 結(jié)論

不同施氮處理對大豆根際土壤固氮微生物群落結(jié)構(gòu)組成和代謝物影響顯著，施氮顯著降低優(yōu)勢固氮菌的相對豐度，但有利于根際土壤中有機(jī)酸及其衍生物、脂肪?；惢衔铩⒕弁惢衔锏却x物的積累。施氮處理下的優(yōu)勢固氮菌屬同大多數(shù)特異性代謝物均有顯著相關(guān)關(guān)系，其中慢生根瘤菌屬、固氮?dú)渥责B(yǎng)單胞菌屬以及弗蘭克氏菌屬同大多數(shù)上調(diào)代謝物呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，同下調(diào)差異代謝物呈顯著正相關(guān)關(guān)系；而中華根瘤菌屬同大多數(shù)上調(diào)代謝物呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究有利于增加對根系分泌物和根際土壤固氮微生物在大豆生長發(fā)育過程中相互作用的了解，但施氮處理后，大豆根際土壤代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化及其與根際土壤固氮微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系仍需進(jìn)行更加系統(tǒng)的研究。