甲基嘧啶磷對三種水生生物的急性毒性及安全性評價

馬紀　孔玄慶　喻快　歐陽文森　李雨露　金晨鐘　郭軍　李建明　歐曉明

摘 要 為評估甲基嘧啶磷對水生生物的毒性效應，在實驗室條件下，以斜生柵藻、大型溞和斑馬魚為試驗研究對象，參照OECD試驗指南和《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》，研究甲基嘧啶磷對這3種水生生物的急性毒性。結果：甲基嘧啶磷對斜生柵藻的生物量半抑制濃度（72 h-EyC50）為1.437 mg·L-1（a.i.）、生長率半抑制濃度（72 h-ErC50）為2.678 mg·L-1（a.i.）；對大型溞的活動半抑制濃度（48 h-EC50）為5.27×10-3 mg·L-1（a.i.）；對斑馬魚的半致死濃度（96 h-LC50）為0.496 mg·L-1（a.i.）。根據(jù)毒性等級劃分標準，甲基嘧啶磷對斜生柵藻、大型溞、斑馬魚分別為中毒、劇毒和高毒。表明甲基嘧啶磷對水生生物毒性較高，在使用過程中，應避免其進入流動水體，防止對湖泊、河流等水生生態(tài)系統(tǒng)造成危害。

關鍵詞 甲基嘧啶磷；急性毒性；斜生柵藻；大型溞；斑馬魚

中圖分類號：S181 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2023.17.002

甲基嘧啶磷（Pirimiphos-methyl）是1974年英國帝國化學工業(yè)集團開發(fā)的一種低毒、高效、低殘留的嘧啶類有機磷殺蟲殺螨劑[1]，屬于膽堿酯酶（ChE）抑制劑，其致毒機理為阻抑昆蟲神經(jīng)突觸上乙酰膽堿酯酶（AchE）的活性，引起乙酰膽堿（ACh）蓄積，使膽堿神經(jīng)受到持續(xù)沖動，導致害蟲持續(xù)興奮后死亡[2-4]。常被用于糧食倉儲防蟲，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織推薦使用的儲糧防護劑[5]。目前對甲基嘧啶磷的研究主要集中在合成開發(fā)和復配[6]、倉儲防效[7-8]、殘留[9-10]、分析方法開發(fā)[11]及廢水處理[12]。甲基嘧啶磷在農(nóng)藥登記中均為衛(wèi)生殺蟲劑或用于倉儲殺蟲，其除了對倉儲害蟲具有很好的防效外，還對田間害蟲具有一定的活性，可進行甲基嘧啶磷農(nóng)藥登記使用范圍的擴大研究。有研究表明[13]，有機磷農(nóng)藥噴灑后一般只有10%～20%的藥液在作物上附著，剩余大部分均殘存在土壤、水和大氣中，之后隨著降水、沉降和徑流的沖刷而進入地下水和江河湖泊中，進而對水生生物造成影響。因此，有必要研究甲基嘧啶磷對水生生物的毒性效應，從而更加全面、可靠地評價甲基嘧啶磷的環(huán)境安全性。

目前常用于污染物毒性評價的水生生物主要有藻類、溞類和魚類。藻類作為水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，是評價水環(huán)境質(zhì)量和污染物生態(tài)毒性的關鍵生物，如被研究者廣泛應用到水環(huán)境毒理試驗中的斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）對環(huán)境污染程度就有著高度敏銳性[14]。溞類是浮游動物的主要構成部分，對水生生態(tài)系統(tǒng)的功能、結構和生物生產(chǎn)力起著至關重要作用。溞類中研究使用最多的是大型溞（Daphnia magna），其分布范圍廣，并對毒物具有較高的敏銳性，因此常用于評價水質(zhì)的好壞，是國際上標準的試驗生物[15]。斑馬魚（Brachydanio rerio）具有易培養(yǎng)、繁殖速度快、對水體污染程度敏感等優(yōu)點，是水生毒性試驗的標準試驗生物[16]。因此，本研究參照OECD測試指南[17-19]和《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》[20]，選擇斜生柵藻、大型溞和斑馬魚3種位于水生生態(tài)系統(tǒng)中不同營養(yǎng)級的生物進行甲基嘧啶磷的急性毒性試驗，以此評價其對三種水生生物的毒性等級，為后續(xù)評價甲基嘧啶磷的環(huán)境危害和風險提供理論依據(jù)，并對其開發(fā)利用具有一定的指導意義。

1? 材料與方法

1.1? 儀器與試劑

主要儀器：萬分之一電子天平（日本島津公司，AUY220型）； 高效液相色譜儀（帶二極管陣列檢測器和化學工作站，日本島津公司，LC-20A型）；紫外可見分光光度計（日本島津，UV-1750型）；生物顯微鏡（上海光學儀器廠，XSP-2C-1型）；便攜式多參數(shù)數(shù)字化分析儀（美國哈希，HQ40d）；水總硬度測定儀（上海三信儀表廠，YD200型）。

主要試劑：丙酮（分析純）、吐溫-80（分析純）、磷酸（色譜純），購于國藥集團化學試劑有限公司；乙腈（色譜純），由美國Honeywell公司生產(chǎn)；90.0%甲基嘧啶磷原藥，由湖南海利化工股份有限公司生產(chǎn)；曝氣24 h以上的去氯自來水，由實驗室提供；水生4號培養(yǎng)基、ISO標準稀釋水根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》[20]配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2? 供試生物

大型溞，實驗室自培養(yǎng)，引種自中國疾病預防控制中心環(huán)境與健康相關產(chǎn)品安全所。試驗選用室內(nèi)孤雌繁殖3代以上、出生24 h內(nèi)健康活潑的非頭胎溞。

斑馬魚，購買于長沙市湘陽水族館。試驗前將斑馬魚置于實驗室條件下（光照與黑暗時間比例為

16 h∶8 h，溫度21～24 ℃）馴養(yǎng)7 d以上，馴養(yǎng)期間及時清除糞便及食物殘渣，死亡率在5%以下方可用于試驗。在試驗項目開展前24 h停止飼喂，挑選體長

（2.0±1.0） cm健康活潑的個體用于試驗。

斜生柵藻，實驗室自培養(yǎng)，引種于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，在實驗室條件下使用10%水生4號培養(yǎng)基（HB-4）進行轉(zhuǎn)接擴大培養(yǎng)，使用轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3次以上且達到同步生長的藻液用于試驗。

1.3? 試驗方法

1.3.1? 藻類生長抑制毒性試驗

根據(jù)預試驗結果，設置理論濃度為20.82、29.15、40.82、57.14、80.0 mg·L-1（a.i.）。稱取甲基嘧啶磷原藥，用丙酮溶解后加入吐溫80 攪勻，之后用10%水生4號培養(yǎng)液分別稀釋至2倍設置濃度，再與藻細胞濃度為2.00×104個·mL-1的藻液進行1∶1體積混合后，置于250 mL無菌三角瓶中，手動搖勻，試驗中同時設置空白對照和溶劑對照，各處理配制3個重復。試驗藻液搖勻后放入人工氣候箱中培養(yǎng)觀察72 h（設置溫度為23 ℃，光照與黑暗時間比例為6 h∶6 h，光強為7 200 lx），每天人工搖勻3～5次。每間隔24 h 測定藻液中藻細胞數(shù)和記錄中毒癥狀，并計算生長半抑制濃度EC50。

1.3.2? 溞類急性活動抑制試驗

根據(jù)預試驗結果，試驗采用半靜態(tài)法，每隔24 h更換試驗藥液，設置濃度為7.00×10-3、9.10×10-3、0.011 8、0.015 4、0.02 mg·L-1（a.i.）。稱取甲基嘧啶磷原藥，用丙酮溶解后加入吐溫80攪勻，然后用ISO 標準稀釋水分別配制成上述濃度，試驗過程中同時設置空白對照組和溶劑對照組，每處理設置5個重復，其中4個重復中接入10只試驗用溞，1個重復進行水體環(huán)境的檢測，染毒完成后放入恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h（設置溫度為20 ℃，全黑暗），每間隔24 h觀察幼溞的中毒癥狀和記錄受抑制數(shù)，并計算活動半抑制濃度EC50。

1.3.3? 魚類急性毒性試驗

根據(jù)預試驗結果，試驗采用半靜態(tài)法，每隔24 h更換試驗藥液。設置濃度為0.965、1.16、1.39、1.67、2.0 mg·L-1（a.i.）。稱取甲基嘧啶磷原藥，用丙酮溶解后加入吐溫80攪勻，用去氯處理24 h以上曝氣自來水稀釋成設置濃度，分別投入10尾魚，在水浴溫度為24 ℃，全黑暗的條件下培養(yǎng)96 h，試驗同時設置空白對照和溶劑對照，各處理不設重復。每日觀察并記錄各處理中斑馬魚的死亡情況和中毒癥狀，并計算半致死濃度LC50值。

1.4? 藥液濃度質(zhì)量檢測

為確保試驗結果的準確可靠，參照張國生等[21]的分析方法并加以調(diào)整，建立了甲基嘧啶磷在不同試驗生物培養(yǎng)溶液體系中的濃度分析方法，并對該方法進行驗證。綠藻試驗0 h、24 h、48 h、72 h取樣檢測，大型溞試驗0 h、24 h換藥前、48 h取樣檢測，斑馬魚試驗0 h、24 h換藥前和96 h取樣檢測。高效液相色譜儀的分析條件為色譜柱：InertSustain C18，250 mm×4.6 mm（i.d）不銹鋼柱，5 μm；柱溫：40 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流動相：V（甲醇）∶V（純水）＝80∶20。在上述條件下，甲基嘧啶磷的保留時間約10.4 min；采用外標法定量。

1.4.1? 標準曲線繪制

采用萬分之一電子天平準確稱取0.052 4 g甲基嘧啶磷標準品置于小燒杯中，用甲醇配制成濃度為500 mg·L-1（a.i.）的標準溶液100 mL。再用甲醇稀釋成甲基嘧啶磷0.02、0.05、0.2、0.5、2.0、5.0 mg·L-1（a.i.）濃度的系列標準溶液，取樣上機檢測。以峰面積總和y、進樣濃度（mg·L-1）x作標準曲線，得到標準曲線方程為y=56 796.43x+554.40（R2=0.999 9），結果表明甲基嘧啶磷在2個濃度區(qū)間內(nèi)線性均為良好。

1.4.2? 樣品前處理方法

藻試驗和魚試驗水樣：量取20 mL試驗水樣，轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管中，加入20 mL乙腈和3 g氯化鈉，用手劇烈震蕩5 min，然后靜止3 min，取上層乙腈相，過0.45 μm濾膜待測。溞試驗水樣：由于對大型溞急性毒性試驗組濃度較低，故需對水樣進行濃縮，量取100 mL試驗水樣，轉(zhuǎn)移至250 mL的分液漏斗中，加入5.0 g氯化鈉，分別用50 mL二氯甲烷萃取3次，過無水硫酸鈉，轉(zhuǎn)移至三角瓶中，旋蒸（50 ℃）濃縮至近干，用2 mL甲醇溶液定容，過0.45 μm濾膜待測。

1.4.3?; 添加回收

分別向綠藻培養(yǎng)液、大型溞培養(yǎng)液和曝氣自來水中添加甲基嘧啶磷標準品配制的溶液，使其濃度分別為0.05、0.1、1.0、10 mg·L-1（a.i.）；0.002 mg·L-1（a.i.）和0.02 mg·L-1（a.i.）；0.05、0.5、5.0 mg·L-1（a.i.），每個濃度設置5個重復，上機檢測，結果見表1。綠藻培養(yǎng)液中，添加回收率在92.50%～103.72%范圍內(nèi)，相對標準偏差分別為0.86%、2.75%、0.63%和0.39%；在大型溞培養(yǎng)液中，添加回收率在82.84%～95.28%，相對標準偏差為1.30%和0.60%；在曝氣自來水中，添加回收率在97.66%～105.20%，相對標準偏差為1.80%、0.92%和0.41%。本分析方法符合各驗證內(nèi)容的質(zhì)量控制要求，可用于分析檢測甲基嘧啶磷在各基質(zhì)中的濃度。

1.5? 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，根據(jù)質(zhì)量濃度的對數(shù)和抑制數(shù)/死亡數(shù)進行線性擬合，分別計算甲基嘧啶磷對斜生柵藻、大型溞、斑馬魚的毒力方程、EC50/LC50 及其95%置信限。

2? 結果與分析

2.1? 中毒癥狀

在試驗周期內(nèi)，各試驗條件均符合試驗要求。斜生柵藻試驗中，為減少光解，將光照時間進行了調(diào)整，采用6 h光照和6 h黑暗交替，溫度范圍為21.2～23.7 ℃，光強為6 881～7 193 lx，pH值為7.19～8.01；大型溞試驗中，試驗用水的硬度為141 mg·L-1，試驗期間溫度范圍為19.0～21.7 ℃，溶解氧范圍為7.75～8.22 mg·L-1，pH值范圍為7.38～7.61，全黑暗處理；斑馬魚試驗中，試驗用水的水質(zhì)硬度為107 mg·L-1，溫度范圍為22.0～24.6 ℃，溶解氧范圍為7.58～8.42 mg·L-1，pH值范圍為7.54～8.15，全黑暗處理。

試驗期間，3種供試生物的空白對照組與溶劑對照組未出現(xiàn)異常，大型溞和斑馬魚中未出現(xiàn)死亡。斜生柵藻試驗中，隨著甲基嘧啶磷濃度升高，藻液中藻細胞數(shù)量減少，通過鏡檢觀察可發(fā)現(xiàn)高濃度處理中藻細胞個體偏小，72 h時觀察發(fā)現(xiàn)高濃度處理中的藻液顏色明顯淺于低濃度，具有明顯的梯度；大型溞試驗中，藥劑處理中的大型溞均出現(xiàn)了活動抑制的個體，且抑制數(shù)與藥劑濃度呈正相關，部分大型溞游動遲緩、沉于杯底或漂浮于水面；斑馬魚試驗中，主要癥狀表現(xiàn)為活動能力變?nèi)?、部分浮于水面游動且游動緩慢，高濃度組中毒斑馬魚部分失去平衡、鰓部充血，試驗過程中斑馬魚死亡數(shù)與染毒濃度呈正相關。

2.2? 毒性效應

各試驗中藥液的濃度分析結果見表2。斜生柵藻試驗中，每24 h進行藥液濃度檢測，試驗結束時，濃度變化率為29.86%～41.11%，因此在數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析中以實測濃度的幾何平均值進行計算；大型溞和斑馬魚試驗中每24 h更換試驗藥液，其濃度變化率均未超過20%，在數(shù)據(jù)分析中，采用0 h時的實測濃度。

甲基嘧啶磷對3種水生生物的毒性濃度詳見表3。對斜生柵藻生長率的72 h半抑制濃度（72 h-ErC50）為2.678 mg·L-1（a.i.），95%置信區(qū)間為2.419～3.060 mg·L-1（a.i.）；對斜生柵藻生物量72 h-EyC50為1.437 mg·L-1（a.i.），95%置信區(qū)間為1.338～1.539 mg·L-1（a.i.）。72 h-EyC50數(shù)據(jù)較72 h-ErC50數(shù)據(jù)小，其毒性更高，因此，利用72 h-EyC50值對斜生柵藻的毒性等級進行判定。對大型溞48 h-EC50為5.27×10-3 mg·L-1（a.i.），95%置信區(qū)間為4.76×10-3～5.83×10-3 mg·L-1（a.i.）。對斑馬魚96 h-LC50為32.69 mg·L-1（a.i.），95%置信區(qū)間為0.428～0.584 mg·L-1（a.i.）。根據(jù)毒性分析結果可知，隨著暴露時間的延長，甲基嘧啶磷對大型溞和斑馬魚的LC50/EC50數(shù)值越小，可見甲基嘧啶磷暴露對這兩種生物的毒性隨時間推移越高。根據(jù)《化學農(nóng)藥環(huán)境安全評價試驗準則》[20]，可判定甲基嘧啶磷對斜生柵藻為中毒，對大型溞為劇毒，對斑馬魚為高毒。

3? 結論與討論

本研究中，甲基嘧啶磷對3種水生生物的毒性具有一定的差異，對大型溞毒性最高，斑馬魚次之，斜生柵藻最低。甲基嘧啶磷屬于有機磷硫代磷酸酯類化合物，有研究表明有機磷類殺蟲劑會對水生動物神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，其主要原因是水生動物的AChE更容易與有機磷結合形成穩(wěn)固的磷?；憠A酯酶，導致ACh代謝紊亂，在水生動物體內(nèi)大量堆積，使其受體持續(xù)興奮，引起動物體抽搐麻痹，最終死亡[22-24]，因此，甲基嘧啶磷對大型溞和斑馬魚的活性高于斜生柵藻；同時，還有研究表明硫代磷酸酯類有機磷殺蟲劑在短時間暴露下會影響魚類嗅覺，造成嚴重的行為障礙[25]，本研究結果與此結論相符。同時，Berntssen等還從染毒甲基嘧啶磷的大西洋鮭魚的肝臟、肌肉、腎臟和膽汁中鑒定出甲基嘧啶磷代謝物[26]。綜上所述，在甲基嘧啶磷的使用中，應避免其進入施用地周邊的流動水體，防止藥液進入湖泊、河流對水生生態(tài)系統(tǒng)造成危害。

本研究結果表明，甲基嘧啶磷對斜生柵藻為中毒、對大型溞為劇毒、對斑馬魚為高毒，可見其對水生生物的毒性較高，但只根據(jù)急性毒性數(shù)據(jù)不能全面、準確地反映甲基嘧啶磷對水生生態(tài)系統(tǒng)存在的風險。在農(nóng)藥登記資料中，環(huán)境影響部分需提供化學農(nóng)藥對水生生物的毒性資料，結合PPDB、EPA、EFSA等數(shù)據(jù)庫所得的甲基嘧啶磷的理化性質(zhì)、環(huán)境歸趨和GAP使用方法等方面的數(shù)據(jù)信息，采用TOP-RICE模型[27]和《環(huán)境風險評估指南》[28]進行甲基嘧啶磷對水生生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境風險評估，利用模型計算出的預測環(huán)境濃度（PEC）和毒性終點數(shù)據(jù)、不確定因子計算出預測無效應濃度（PNEC）比值，判斷風險的可接受程度，以此評價農(nóng)藥對水生生態(tài)系統(tǒng)的風險性。本研究為甲基嘧啶磷進一步的風險評估提供了生態(tài)毒理方面的數(shù)據(jù)支撐。

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（責任編輯：丁志祥）

收稿日期：2023-03-09

作者簡介：馬紀（2000—），女，湖南汨羅人，在讀碩士，主要研究方向為農(nóng)藥生態(tài)毒理。E-mail：2176466048@qq.com。

*為通信作者，E-mail：xmouhn@163.com。