磷對(duì)甘藍(lán)型油菜幼苗鎘吸收及土壤酶活性的影響

張蓓蓓, 王薪琪, 李卓晴, 吳嘉儀, 吳家萌, 謝華,陳媛, 杜輝輝, 劉孝利, 雷鳴*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128;2.湖南省郴州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,湖南郴州 424108)

隨著工業(yè)的快速發(fā)展,化肥、農(nóng)藥的濫用使重金屬大量積存于農(nóng)田中,其中鎘因影響范圍廣、污染程度重,成為制約我國(guó)農(nóng)田安全利用的主要重金屬污染物[1]。鎘通過作物吸收進(jìn)入食物鏈,會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生極大的危害[2]。因此,作物吸收積累鎘的規(guī)律是一個(gè)值得關(guān)注的問題。

油菜是我國(guó)大宗的油料作物,具有產(chǎn)油、提供生物質(zhì)能源、觀賞等作用。同時(shí),油菜因生物量大,鎘吸附能力強(qiáng)而被認(rèn)為是修復(fù)鎘污染土壤的良好選擇[3]。研究表明,油菜對(duì)鎘的富集能力受施加的無機(jī)肥的影響[4]。磷是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育的重要養(yǎng)分元素,施磷能為油菜提供充足的養(yǎng)分,促進(jìn)油菜生長(zhǎng),從而影響油菜對(duì)鎘的吸收。鎘脅迫下施用納米羥基磷灰石和鈣鎂磷肥減弱了鎘對(duì)油菜生長(zhǎng)發(fā)育的影響,通過提高油菜的株高、根長(zhǎng)、葉片數(shù)目和生物量,使油菜的鎘積累量增加[5]。施加磷肥會(huì)通過影響土壤有效鎘含量來影響植物吸收積累鎘,如施用磷酸氫二銨等,可使土壤pH降低,從而增加有效鎘含量[6];施用磷酸氫鈣等,可增加土壤對(duì)鎘的吸附,使有效鎘含量降低[7]。土壤酶參與土壤物質(zhì)的循環(huán)過程,對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要意義。崔紅標(biāo)等[8]的研究表明施用羥基磷灰石增加了脲酶活性,降低了酸性磷酸酶活性。Wu等[9]研究表明,在鎘污染土壤施用磷酸鈣顯著增加了土壤的蔗糖酶和脲酶活性,降低了土壤的過氧化氫酶的活性,表明土壤酶活性對(duì)磷有顯著響應(yīng)。油菜對(duì)鎘的吸收積累受多種因素影響[10],研究施磷對(duì)有效鎘和酶活性的影響對(duì)理解油菜吸收積累鎘的機(jī)制具有重要意義。

本研究結(jié)合土壤鎘形態(tài)、磷形態(tài)和土壤酶活性的變化,研究磷添加對(duì)油菜吸收積累鎘的影響,為鎘污染農(nóng)田的修復(fù)與治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以甘藍(lán)型油菜‘油研52’為材料,在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院光照培養(yǎng)室育苗后移栽。育苗環(huán)境為:相對(duì)濕度70%,溫度22℃,光照強(qiáng)度300～320 μmol/(m2·s),光周期為光照14 h/黑暗10 h,所用營(yíng)養(yǎng)液為改良的霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液。

供試土壤為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地的旱作農(nóng)田耕作層(0～20 cm)土壤。土壤取回后剔除石子和枯葉等異物,自然風(fēng)干,過10目尼龍篩,混勻備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)置

實(shí)驗(yàn)設(shè)置了3個(gè)鎘含量和3個(gè)磷含量的交互作用模式,共9個(gè)處理,每個(gè)處理設(shè)置6個(gè)平行。使用上口直徑10.6 cm,下口直徑8.5 cm,高9.5 cm的聚乙烯花盆,每盆裝5 kg土樣,以CdCl2·5H2O溶液的方式向土壤中加鎘,使土壤鎘含量達(dá)到0.3、3.0和5.0 mg/kg,穩(wěn)定30天(穩(wěn)定后測(cè)定各處理土壤總鎘含量,其值為0.28±0.05、2.82±0.12、4.78±0.25 mg/kg)。穩(wěn)定后,以KH2PO4溶液形式向土壤中加磷,含量為5.0、75.0、150.0 mg/kg(引入的鉀以KCl進(jìn)行平衡)。氮肥和鉀肥以(NH4)2SO4、KCl溶液形式于移栽前一周加入。

油菜長(zhǎng)出3～4片真葉、高度約6～10 cm時(shí),選擇大小一致的幼苗進(jìn)行移栽,每盆移栽1株,油菜置于自然環(huán)境中生長(zhǎng)至抽薹期進(jìn)行收獲。

1.3 樣品采集與測(cè)定

采用抖土法收集根際土壤,置于陰涼的地方風(fēng)干。分離油菜和土壤后,于油菜根、莖、葉連接部位剪下,依次使用流動(dòng)的自來水、超純水沖洗。洗凈的植物樣品放入烘箱110 ℃殺青30 min,65 ℃烘至恒重用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),油菜生物量以干重表示。

1.3.1 油菜各部位鎘含量測(cè)定

油菜各部位樣品鎘含量采用硝酸-高氯酸(體積比4∶1)濕法消解,以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW—10049)和空白進(jìn)行質(zhì)量控制,用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS,NexIONTM 350X,PerkinElmer,MA,USA)測(cè)定消解液鎘含量[10]。

1.3.2 油菜根際羧酸釋放量測(cè)定

室內(nèi)和田間實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明,植物葉片錳含量可以反映根際羧酸鹽的釋放量[11]。油菜葉片錳含量采用硝酸-高氯酸(體積比4∶1)濕法消解,以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW—10049)和空白進(jìn)行質(zhì)量控制,用電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS,NexIONTM 350X,PerkinElmer,MA,USA)測(cè)定消解液錳含量[10]。

1.3.3 土壤pH和有效鎘含量測(cè)定

土壤pH采用pH計(jì)(SevenCompactS220,梅特勒-托利多)測(cè)定,土水比為1∶2.5(w∶v)[12]。土壤有效鎘(DTPA-Cd)采用DTPA提取劑浸提,電感耦合等離子質(zhì)譜(ICP-MS,NexIONTM 350X,PerkinElmer,MA,USA)測(cè)定提取液鎘濃度[10]。

1.3.4 土壤不同磷形態(tài)含量測(cè)定

采用Deluca等[13]提出的BBP(Biologically-based P extraction approach)法測(cè)定生物有效磷(Bioavailable-P)、活性無機(jī)磷(Exchangeable-P)、活性有機(jī)磷(Hydrolysable-P)和礦物質(zhì)磷(Ligand-P)。其中,Bioavailable-P用10 mmol/L CaCl2溶液提取;Exchangeable-P用10 mmol/L檸檬酸提取;Hydrolysable-P用磷酸酶和植酸酶的酶混合溶液提取;Ligand-P用1.0 mmol/L HCl溶液提取。最后使用孔雀石綠的方法在630 nm的波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀(TECANSpark 20M)測(cè)定提取液的吸光度值,計(jì)算各種形態(tài)的磷含量。

1.3.5 土壤酶活性測(cè)定

采用對(duì)硝基苯酚比色法測(cè)定β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase,BG)活性。β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-1,4-N-acetylglucosaminidase,NAG)活性利用硝基苯酚比色法測(cè)定,亮氨酸氨基肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)活性使用對(duì)硝基苯胺比色法測(cè)定?；诹姿岜蕉c比色法測(cè)定酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,采用鉬酸銨顯色法測(cè)定植酸酶(phytase)活性。具體測(cè)定步驟均按照蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供的相應(yīng)酶活性試劑盒說明書操作,樣品使用多功能酶標(biāo)儀(TECAN-Spark 20M)比色測(cè)定。

1.3.6 油菜各部位鎘積累量的計(jì)算

油菜各部位鎘積累量=各部位鎘含量×生物量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)使用Excel 2019整理,IBM SPSS Statistics 26進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本文中所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6),并用單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯顯著性差異檢驗(yàn),用Origin進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷添加對(duì)油菜各部位生物量的影響

鎘含量為0.3 mg/kg時(shí),磷添加對(duì)油菜生物量的影響不顯著。鎘含量為3.0 mg/kg和5.0 mg/kg時(shí),油菜植株生物量隨著磷添加量的增加而增加,磷添加量由5.0 mg/kg增加至150.0 mg/kg時(shí),油菜植株平均生物量分別由1.59 g增加至2.68 g,由1.61 g增加至2.03 g(圖1)。

2.2 磷添加對(duì)油菜各部位鎘含量的影響

由圖2a～c可知,土壤鎘含量為0.3、3.0 mg/kg時(shí),油菜各組織鎘含量隨著磷濃度的增加而呈增加的趨勢(shì),土壤鎘含量為5.0 mg/kg時(shí),油菜各組織鎘含量隨著磷濃度的增加而呈減少的趨勢(shì)。隨著磷含量的增加,鎘含量為0.3 mg/kg時(shí),油菜根、莖和葉片的平均鎘含量分別由0.73、2.53和3.12 mg/kg增加至0.85、2.88和3.62 mg/kg;鎘含量為3.0 mg/kg時(shí),油菜根、莖和葉片的平均鎘含量分別由13.80、42.20和77.14 mg/kg增加至17.02、57.12和93.69 mg/kg。鎘含量為5.0 mg/kg時(shí),與5.0 mg/kg磷添加量相比,75.0 mg/kg和150.0 mg/kg的磷添加分別使根部鎘含量降低了9.2%和11.8%,莖部鎘含量降低了13.5%和21.2%,葉片鎘含量降低了6.2%和8.3%。

2.3 磷添加對(duì)油菜各部位鎘積累量的影響

由圖3可知,磷添加顯著增加了油菜根和葉片的鎘積累量,而莖鎘積累量?jī)H在鎘含量為3.0 mg/kg時(shí)發(fā)生顯著變化。土壤鎘含量為0.3、3.0、5.0 mg/kg時(shí),油菜植株鎘積累量隨著磷添加量的增加而呈增加趨勢(shì)。150.0 mg/kg磷添加時(shí),油菜的鎘積累量分別為4.75、164.00、165.62微克/盆。

圖2 磷添加對(duì)油菜根(a)、莖(b)、葉(c)鎘含量的影響Figure 2 Effect of P addition on Cd content of rapeseed root (a), stem (b), and leaf (c)注:不同的小寫字母表示在P<0.05的水平上差異顯著,下同。

2.4 磷添加對(duì)油菜根際pH和有效鎘含量的影響

圖4a反映了外源磷添加量對(duì)不同鎘含量土壤pH的影響。在土壤鎘含量為0.3、3.0和5.0 mg/kg時(shí),與5.0 mg/kg磷添加相比,150.0 mg/kg磷添加分別使土壤pH降低了0.10、0.11和0.06個(gè)單位。

如圖4b所示,土壤鎘含量為0.3 mg/kg時(shí),磷添加對(duì)土壤有效鎘含量無顯著影響。當(dāng)土壤鎘含量為3.0和5.0 mg/kg時(shí),與5.0 mg/kg的磷添加量相比,75.0 mg/kg的磷添加使土壤有效鎘降低了9.5%和11.4%,150.0 mg/kg的磷添加使土壤有效鎘含量降低了7.5%和15.2%。

圖3 磷添加對(duì)油菜根(a)、莖(b)、葉(c)和油菜植株(d)鎘積累量的影響Figure 3 Effect of P addition on Cd accumulation of rapeseed root (a), stem (b), leaf (c) and the plant (d)

圖4 磷添加對(duì)pH(a)和有效鎘含量(b)的影響Figure 4 Effect of P addition on pH (a) and DTPA-Cd (b) of soil

2.5 磷添加對(duì)油菜根際磷形態(tài)的影響

在不同鎘和磷處理中土壤磷含量大小的順序依次為L(zhǎng)igand-P>Exchangeable-P>Hydrolysable-P>Bioavailable-P(圖5)。土壤鎘含量為0.3 mg/kg時(shí),磷添加量由5.0 mg/kg增加至150.0 mg/kg時(shí),土壤Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P的含量分別由1.08、50.80、1.48 mg/kg增加至1.38、53.51、1.87 mg/kg,Ligand-P的濃度由16 257.00 mg/kg減少至13 503.20 mg/kg;土壤鎘含量為3.0 mg/kg時(shí),與5.0 mg/kg磷添加相比,150.0 mg/kg磷添加量使Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P含量增加了48.7%、4.8%、9.4%,Ligand-P含量減少了10.2%;土壤鎘含量為5.0 mg/kg時(shí),與5.0 mg/kg磷添加相比,磷添加量為150.0 mg/kg時(shí)土壤的Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P含量增加了35.9%、5.7%、8.9%,Ligand-P的含量減少了10.3%。

圖5 磷添加對(duì)土壤生物有效磷(a)、活性無機(jī)磷(b)、活性有機(jī)磷(c)和礦物質(zhì)磷(d)的影響Figure 5 Effect of P addition on soil Bioavailable-P (a), Exchangeable-P (b), Hydrolysable-P (c) and Ligand-P (d)

2.6 磷添加對(duì)油菜根系釋放羧酸的影響

圖6表明磷添加降低了油菜葉片Mn含量。土壤鎘含量為0.3、3.0、5.0 mg/kg時(shí),與5.0 mg/kg磷添加量相比,75.0 mg/kg外源磷添加時(shí)油菜葉片Mn含量分別降低了5.3%、7.2%、10.8%,相比外源磷添加為150.0 mg/kg時(shí)分別降低了10.7%、20.2%、10.0%。

2.7 磷添加對(duì)油菜根際酶活性的影響

圖7為磷添加對(duì)油菜根際土壤酶活性的影響。土壤鎘含量為0.3 mg/kg時(shí),與外源磷添加量為5.0 mg/kg相比,外源磷添加量為150.0 mg/kg時(shí), NAG和UE的酶活性表現(xiàn)為增加,增幅分別為2.4%、49.12%和20.5%(圖7b、圖7e);ACP、Phytase和ALP的酶活性表現(xiàn)為降低,降幅分別為11.5%、17.5%、11.8%(圖7f～h)。土壤鎘含量為3.0 mg/kg時(shí),磷添加量的增加顯著提高了NAG、UE的酶活性,顯著降低了BG、ACP和ALP的活性。土壤鎘含量為5.0 mg/kg時(shí),外源磷的施入,提高了BG(1 626.11～2 038.82 nmol/g·h)、NAG(309.50～420.97 nmol/g·h)、LAP(31.69～33.60 nmol/g·h)、UE(165.05～202.79 nmol/g·h)的活性,但是降低了ACP(1 268.75～1 385.06 nmol/g·h)、ALP(211.45～229.28 nmol/g·h)的活性。

圖6 不同鎘、磷添加時(shí)油菜葉片錳的變化Figure 6 Changes of Mn in leaves of Brassica napuswith different Cd and P addition

圖7 不同鎘、磷添加時(shí)油菜根際酶活性的變化Figure 7 Changes of enzyme activity in rhizosphere of Brassica napus with different Cd and P addition注:a.BG,β-葡萄糖苷酶;b.NAG,β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶;c.LAP,亮氨酸氨基肽酶;d.NAG+LAP,β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶+亮氨酸氨基肽酶;e.UE,脲酶;f.ACP,酸性磷酸酶;g.為Phytase,植酸酶;h.ALP,堿性磷酸酶。

3 討 論

本研究表明,鎘含量為3.0和5.0 mg/kg時(shí),油菜生物量隨著磷的增加而增加(圖1)。施磷對(duì)其他作物也有相同的影響,趙羽楠等[14]的研究表明,在50.0 mg/kg鎘脅迫下,磷添加顯著增加結(jié)縷草葉片的生物量。Carvalho Bertoli等[15]的研究也表明施磷能增加鎘脅迫環(huán)境下的番茄果實(shí)的生物量。生物量是植物生長(zhǎng)狀況最直接的體現(xiàn),說明鎘含量較高時(shí)磷對(duì)促進(jìn)油菜生長(zhǎng)有重要的意義[16]。鎘含量為0.3 mg/kg和3.0 mg/kg時(shí),油菜各部位鎘含量隨施磷量的增加而顯著增加(圖2、圖3)?；粞蟮萚17]和劉文菊等[18]的研究結(jié)果表明水稻地上部分鎘含量隨著磷添加量的增加而增加,認(rèn)為這是由于在一定的鎘含量下,磷添加促進(jìn)作物根系發(fā)育,同時(shí)磷添加提高了植物的光合速率,從而促進(jìn)作物對(duì)鎘的吸收。但是土壤鎘含量為5.0 mg/kg時(shí),油菜各部位鎘含量隨著施磷量的增加而減少,鎘積累量隨著施磷量的增加而增加(圖2c、圖3c),這一現(xiàn)象可能是稀釋作用導(dǎo)致的[19],外源磷添加量的增加提高了其生物量,油菜各部位的鎘含量表現(xiàn)為降低,油菜的鎘積累量表現(xiàn)為增加。

本研究結(jié)果表明,磷添加顯著降低了土壤pH。本試驗(yàn)添加的磷為KH2PO4,溶解后呈酸性,這可能是土壤pH降低的主要原因[6]。土壤磷形態(tài)的變化與土壤理化性質(zhì)和酶活性有關(guān)。在不同鎘處理的土壤中,隨著磷添加量的增加,Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P含量表現(xiàn)為增加,Ligand-P含量表現(xiàn)為降低(圖5)。Bioavailable-P是土壤溶液中的活性磷庫,磷添加量的增加可能使土壤中Bioavailable-P含量增加。Exchangeable-P是指吸附于土壤顆粒表面或與Ca、Fe、Al等形成化合物的磷,當(dāng)土壤有機(jī)酸含量增加時(shí),這種形態(tài)的磷可交換釋放至土壤溶液中。油菜葉片錳含量與油菜根系羧酸鹽釋放量呈正相關(guān)[11],結(jié)果表明,在0.3、3.0、5.0 mg/kg土壤鎘含量下,油菜葉片錳含量隨著外源磷添加量的增加而減少,這意味著磷添加量低時(shí)油菜釋放了更多的羧酸鹽來促進(jìn)Exchangeable-P的釋放以增加油菜對(duì)磷的吸收,導(dǎo)致磷添加量低時(shí)土壤的Exchangeable-P含量更低。Hydrolysable-P是指能夠被土壤酶活化的有機(jī)磷,Hydrolysable-P的礦化依賴于磷酸酶和植酸酶的活性[20]。在0.3、3.0和5.0 mg/kg的鎘含量背景下,土壤ACP、ALP酶的活性均隨磷添加量的增加而降低,導(dǎo)致Hydrolysable-P釋放量降低,進(jìn)而增加了土壤中可被酶活化的Hydrolysable-P的含量。Ligand-P是難被植物利用的磷,它的含量與土壤pH相關(guān)[21],磷添加量的增加降低了土壤pH,這有利于Ligand-P的活化,從而使Ligand-P含量降低。本研究土壤有效鎘含量隨著磷添加量的增加而降低,而未隨土壤pH的降低而增加,可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)土壤pH較低,所以pH不是影響土壤有效鎘含量的主要因素。土壤有效鎘含量降低可能與Ligand-P的釋放有關(guān)[22]。

酶參與土壤中多種重要的生物化學(xué)和物質(zhì)循環(huán)過程,其活性是土壤微生物代謝和養(yǎng)分循環(huán)動(dòng)態(tài)變化的敏感指標(biāo),可以反映磷添加對(duì)鎘污染土壤功能的影響[23]。隨著磷含量的增加,土壤中ACP和ALP的活性表現(xiàn)為降低(圖7f、圖7h),NAG和UE的活性表現(xiàn)為增加(圖7b、圖7e)。有研究表明施磷會(huì)降低ACP和ALP的活性[24-25]。Wu等[26]發(fā)現(xiàn)施加無機(jī)磷肥使土壤UE的活力比空白對(duì)照提高了3.2倍。這可能是由于外源添加磷緩解油菜-土壤系統(tǒng)的磷限制,使微生物將更多的資源分配給氮循環(huán)相關(guān)酶類[27-28]。因此,外源磷可能會(huì)通過緩解油菜根際的磷限制促進(jìn)氮養(yǎng)分循環(huán),改善油菜根際環(huán)境。

4 結(jié) 論

本研究表明,外源磷雖然降低了土壤pH和土壤有效鎘含量,但也促進(jìn)了土壤礦物質(zhì)磷的活化,提高了可利用磷庫的規(guī)模,增加土壤NAG和UE的活性,改善根際養(yǎng)分循環(huán),減弱了鎘對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響,從而促進(jìn)油菜的生長(zhǎng),提高了油菜對(duì)鎘的積累。本試驗(yàn)僅限在油菜苗期進(jìn)行,而外源磷添加在油菜整個(gè)生育期內(nèi)對(duì)土壤磷鎘轉(zhuǎn)化、酶活性變化以及油菜各組織吸收積累鎘的影響還有待進(jìn)一步研究。