馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫下馬鈴薯根際土壤微生物代謝功能多樣性變化

唐芬芬，楊偉克，謝 昆，張祖蕓，李 娜

（1.紅河學院 生物科學與農(nóng)學學院，云南 蒙自 661199；2.云南省農(nóng)業(yè)科學院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661199）

根際土壤微生物種類眾多，是最復雜的生態(tài)系統(tǒng)之一，因此也被譽為植物的第二套基因組[1]，它們在植物的營養(yǎng)吸收[2-4]、生長發(fā)育[5]、免疫[6]及抗病性[7-9]等方面具有重要作用。過去幾十年，植物的防御機制研究主要集中在相關抗性基因方面[10-11]，關于植物遺傳對許多代謝防御途徑的影響已經(jīng)很清楚，例如，調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的植物途徑極大地影響了田間環(huán)境中草食動物對植物的損害，是極其重要的防御機制之一[12-13]。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，植物根際土壤微生物還能影響植物對植食昆蟲的抗性[14-17]，進一步揭示了植物-微生物-植食昆蟲三者之間的關系。

馬鈴薯塊莖蛾（Phthorimaea operculellaZeller）是馬鈴薯的重要害蟲之一，不僅取食馬鈴薯植株，還能危害塊莖[18-19]。此外，該蟲對煙草、辣椒等茄科作物也造成危害[20-21]?；瘜W農(nóng)藥是防控該蟲害的主要方式，但化學農(nóng)藥的廣泛使用使該蟲對擬除蟲菊酯類及有機磷類等殺蟲劑都產(chǎn)生了不同程度的抗性[22]。目前，國內(nèi)外對馬鈴薯塊莖蛾的防控研究主要集中在綜合治理方面，如栽培管理[23]、間套作[24]、化學信息素[25]、生物殺蟲劑[26-28]、植物抗性誘導劑[29]、生物防治[30]等，這些方法雖取得了一定成效，但仍需開展防治馬鈴薯塊莖蛾的其他途徑研究。目前，關于馬鈴薯根際微生物是否也與植株抗蟲性相關以及馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫對馬鈴薯根際微生物群落的影響研究尚未見報道。因此，采用Biolog 技術分析馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫下云南省2個主栽馬鈴薯品種根際微生物代謝功能的變化，明確馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫對其根際微生物的影響，為深入探究馬鈴薯塊莖蛾、馬鈴薯以及根際微生物之間的相互作用機制提供理論基礎，并為馬鈴薯抗蟲性機制研究以及馬鈴薯病蟲害防控提供理論依據(jù)和新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

Biolog ECO 板購自美國BIOLOG 公司；馬鈴薯品種為合作88、麗薯6 號；供試土壤采自紅河學院種植基地，一次性采集并充分混勻、去除雜質(zhì)，過孔徑0.6 mm篩后備用。

1.2 馬鈴薯種植

將上述過篩的土壤分裝于洗凈的花盆里，每盆種植馬鈴薯塊莖一個（保留一個芽眼）。然后置于溫度為（26±1）℃、濕度為（75±5）%、光周期L/D=16 h/8 h 的光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（恒立國際有限公司，型號RG-300），在此期間無任何蟲源危害，不施加任何化肥、農(nóng)藥，按需進行常規(guī)澆水。采集土壤樣品前3 d不澆水。

1.3 馬鈴薯塊莖蛾脅迫處理

收集馬鈴薯塊莖蛾同一天卵塊，待其孵化后，接于出苗45 d 的馬鈴薯植株上，分別于馬鈴薯塊莖蛾取食3、7、14 d 時采集土壤，同時以無害蟲取食脅迫的馬鈴薯植株為對照組。采集方法為抖落法。馬鈴薯植株取出后，將與根系結合不緊密的部分土壤抖落，然后用無菌毛筆將與根結合緊密的土壤掃落于無菌牛皮紙上。分別將2個品種取食脅迫各時段（3、7、14 d）的土壤每3 盆混在一起作為一個樣品，每個處理3 個重復，即2 個脅迫處理54 盆，對照54 盆，共108 盆。收集樣品用于微生物代謝功能多樣性相關數(shù)據(jù)的測定。

1.4 根系微生物代謝功能測定

根際微生物變化與根系分泌物利用的關系可以在一定程度上通過Biolog ECO 微孔板分析來反映，因此，本研究中對土壤微生物代謝功能多樣性分析采用Biolog 生態(tài)板的方法進行測定。采用的Biolog ECO板有31種單一碳源，分為六大類：碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類、胺類。

測定方法參照左強等[31]的報道，略有改進。不同處理分別稱取混合土壤5.0 g，加入90 mL 無菌的0.85% NaCl 溶液，放置于25 ℃搖床200 r/min 振蕩30 min 后于4 ℃冰箱靜置10 min，用移液槍吸取上清液200 μL 稀釋1 000 倍，然后取150 μL 稀釋液添加至Biolog ECO 板的微孔中，最后將Biolog ECO 板培養(yǎng)于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，分別在培養(yǎng)4、12、24、48、72、96、120、144、168、192 h 時取出Biolog ECO板，在Biolog EmaxTM自動讀盤機上讀取590 nm 波長的光密度值，選取測定趨于平穩(wěn)的96 h 光密度值進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

土壤微生物可與Biolog ECO 板微孔內(nèi)的染料四唑反應，產(chǎn)生顏色變化，通過顏色深淺可判斷微生物對碳源的利用能力，通過平均顏色變化率（Average color change rate，AWCD）可反映土壤微生物的代謝活性情況，即AWCD 值越大，土壤微生物的代謝活性越強。其計算公式為AWCD=∑（Ci-Ri）/n，其中：Ci為每個孔的光密度值；Ri為對照孔的光密度值；n＝31，為Biolog ECO板的孔數(shù)。

微生物多樣性指數(shù)利用Excel 計算。評估物種的豐富度用Shannon指數(shù)（H），計算公式為H＝∑Pi/lnPi，Pi為第i孔的相對吸光值與整個微平板所有孔中相對吸光值總和的比值；Simpson 多樣性指數(shù)（D）用于評估優(yōu)勢度，計算公式為D=1-∑Pi2[32]。

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010 和SPSS 20.0 軟件進行，不同處理間在0.05 水平下的差異顯著性通過鄧肯氏多重比較法檢驗。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫對馬鈴薯根際微生物代謝活性的影響

根系微生物代謝活性可用AWCD 值衡量，結果（圖1）顯示，經(jīng)馬鈴薯塊莖蛾幼蟲取食后，馬鈴薯品種合作88、麗薯6 號的AWCD 值均高于對照，兩品種的AWCD 值均在取食脅迫7 d 達到最高，且顯著高于對照（P＜0.05）。馬鈴薯塊莖蛾幼蟲取食脅迫3、7、14 d，合作88 AWCD 值比對照分別提高了3.9%、32.8%、11.8%；而麗薯6 號則比對照分別提高了23.1%、10.1%、35.1%。

圖1 馬鈴薯塊莖蛾取食后馬鈴薯根際土壤微生物的代謝活性變化Fig.1 Variation of metabolic activity of potato rhizosphere soil microorganisms after feeding by P.operculella

2.2 馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫對馬鈴薯根際微生物多樣性的影響

微生物多樣性分析結果（表1、表2）表明，在馬鈴薯塊莖蛾幼蟲取食脅迫處理第7 天，兩品種的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均最高，即根際微生物多樣指數(shù)均達到最高，但麗薯6 號脅迫處理此時的2 個指數(shù)與對照相比均未達到顯著水平（P＜0.05）。合作88 和麗薯6 號根際微生物的Shannon 指數(shù)在取食脅迫第3、7、14 天相對于對照分別提高了1.9%、2.5%、1.2%和2.8%、0.6%、3.1%，Simpson 指數(shù)則分別對應提高了6.4%、15.0%、6.8%和12.7%、4.4%、18.5%。

表1 馬鈴薯塊莖蛾取食對馬鈴薯根際土壤微生物群落Shannon多樣性指數(shù)的影響Tab.1 Effects of feeding by P.operculella on Shannon diversity index of soil microbial community in potato rhizosphere

表2 馬鈴薯塊莖蛾取食對馬鈴薯根際土壤微生物群落Simpson多樣性指數(shù)的影響Tab.2 Effects of feeding by P.operculella on Simpson diversity index of soil microbial community in potato rhizosphere

2.3 馬鈴薯塊莖蛾脅迫下根際微生物對碳源利用的差異

通過測定微生物對Biolog ECO 板上各類碳源的平均吸光度值，評價微生物對不同碳源的利用能力，分析了馬鈴薯塊莖蛾幼蟲取食脅迫不同時間下根際微生物對31 種碳源即歸類為六大類碳源利用的差異。從圖2 可以看出，無論是合作88 還是麗薯6號在取食脅迫第7天，其根際微生物對6類碳源的利用均達到最大。合作88 在脅迫處理第3 天，根際微生物相對于對照僅對氨基酸的利用達到顯著提高水平（P＜0.05）；在脅迫處理第7 天，與對照相比，合作88 的根際微生物提高了對6 類碳源的利用，分別為碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類和胺類，其中對碳水化合物類和羧酸類化合物的利用能力與對照相比達到顯著水平（P＜0.05）；在脅迫處理14 d，合作88 根際微生物與對照相比顯著提高了對氨基酸類、多聚物類和胺類的利用（P＜0.05）（圖2a）。

圖2 馬鈴薯塊莖蛾取食后馬鈴薯根際土壤微生物在各時段對6類碳源的利用情況Fig.2 Utilization of six carbon sources by microorganisms of potato rhizosphere soil at different periods after feeding by P.operculella

而麗薯6 號在處理第3 天，與對照相比其根際微生物提高了對4 類碳類的利用，分別為碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類，但對酚酸類和胺類化合物的利用則低于對照，其中氨基酸類、羧酸類和多聚物類未達到顯著水平（P＜0.05）；在處理第7 天時，麗薯6 號的根際微生物對多聚物類和酚酸類化合物的利用情況與對照相比達到顯著水平（P＜0.05）；在脅迫處理14 d，麗薯6 號根際微生物對6 類碳源的利用情況與對照相比，僅有多聚物類未達到顯著水平（P＜0.05）（圖2b）。

綜上所述，取食脅迫處理后，馬鈴薯根際微生物對碳源的利用隨時間推移呈現(xiàn)動態(tài)變化，2 個品種的根際微生物對碳源的利用不同。總體上顯示，馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫處理提高了馬鈴薯根際微生物對各類碳源的利用，其中取食脅迫第7 天時馬鈴薯根際微生物對碳源的利用達到最高。

2.4 馬鈴薯根際微生物對碳源利用的主成分分析

為了進一步了解馬鈴薯塊莖蛾取食下馬鈴薯不同品種根際土壤微生物群落功能的差異，對不同處理下培養(yǎng)96 h 的根際土壤微生物進行31 種碳源利用的主成分分析，按照載荷值大于0.18 或者小于-0.18 的標準[33]，進行重要碳源的篩選。從表3 看出，影響品種合作88 的重要碳源，主成分1 上有11種，分別是丙酮酸甲脂、吐溫40、肝糖、I-赤藻糖醇、D，L-α-甘油、衣康酸、γ-羥基丁酸、腐胺、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-苯基丙氨酸；主成分2 上有10 種，分別為D-纖維二糖、β-甲基D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸鹽、D-半乳糖內(nèi)酯、衣康酸、α-丁酮酸、D-蘋果酸、L-精氨酸、苯乙基胺、L-絲氨酸。

表3 31種碳源在主成分1（PC1）、主成分2（PC2）上的載荷（Loading＞0.18和Loading＜-0.18）Tab.3 Loads of 31 carbon sources on first two principal components（PC）（the loading is＞0.18 or ＜-0.18）

影響麗薯6 號的重要碳源在主成分1 上有12種，分別為α-環(huán)式糊精、肝糖、α-D-乳糖、β-甲基D-葡萄糖苷、I-赤藻糖醇、N-乙?；?D-葡萄胺、D-葡萄胺酸、葡萄糖-1-磷酸鹽、D-半乳糖醛酸、4-羥基苯甲酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-絲氨酸；主成分2上有7 種，分別為吐溫40、4-羥基苯甲酸、α-丁酮酸、L-精氨酸、腐胺、苯乙基胺、甘氨酰-L-谷氨酸。

從排序圖（圖3）來看，合作88 主成分1 變異為28.3%，主成分2 變異為13.6%，總變異為41.9%，且各時間段處理組和對照組均分布于不同象限；麗薯6 號主成分1 的變異為37.5%，主成分2 的變異為8.5%，總變異為46.0%，各時間段處理組和對照組也均分布于不同象限?？梢姡∈趁{迫改變了根際微生物對碳源的利用。

圖3 馬鈴薯塊莖蛾取食后馬鈴薯根際土壤微生物碳源利用的主成分變異分析Fig.3 Principal component variation analysis of microbial carbon source utilization in potato rhizosphere soil after feeding by P.operculella

3 結論與討論

本研究利用Biolog 技術分析研究了麗薯6 號、合作88 兩個馬鈴薯品種在馬鈴薯塊莖蛾脅迫下根系土壤微生物群落多樣性及對土壤碳源利用的情況。土壤碳源利用AWCD 值可衡量微生物對相應碳源的利用能力。經(jīng)馬鈴薯塊莖蛾取食3、7、14 d的2 個馬鈴薯品種根際土壤樣品，在培養(yǎng)96 h 時根際微生物對碳源的利用能力均高于對照，且隨取食后時間延后出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，代謝速率與微生物的增長規(guī)律吻合，即慢-快-慢的代謝速率[34]，且均在取食脅迫第7 天微生物對碳源的利用達到最大。結果說明，在馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫下，植株根際土壤微生物對碳源的代謝活性和利用能力增強。

微生物群落功能多樣性變化可以通過微生物多樣性指數(shù)來反映，Shannon 和Simpson 指數(shù)是最常用的指標之一，值越高說明群落多樣性越高，物種越豐富[35]。對馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫下2 個馬鈴薯品種根際微生物多樣性的分析結果表明，取食脅迫處理的Shannon和Simpson 指數(shù)值均高于對照，說明在馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫下，2 個馬鈴薯品種根際微生物的生物多樣性得到提高。

本研究分析了馬鈴薯根際微生物對Biolog Eco板31種碳源，即歸屬于碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物類、酚酸類、胺類6類碳源的利用情況。與對照相比，馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫明顯提高了2個品種根際土壤微生物對6類碳源的利用，且趨勢基本一致，說明取食脅迫后微生物的群落更為豐富和多樣，與上述結果一致。糖類、氨基酸類和酚酸類化合物是植物根系分泌物的主要成分[36]，在根際與周圍微生物的相互作用中發(fā)揮著重要作用。研究表明，在根系分泌物的作用下，具有趨化性的細菌或真菌能夠在根際大量聚集和繁殖[37]。對馬鈴薯根際微生物的碳源利用情況進行主成分及聚類分析，結果表明，馬鈴薯塊莖蛾取食脅迫處理與對照相比，改變了根際微生物對碳源的利用，說明微生物群落結構和生物多樣性發(fā)生了變化。同時研究還發(fā)現(xiàn)，未受害蟲取食脅迫的對照組2 個馬鈴薯品種的根際微生物對碳源利用的主成分不同，說明群落有差別，這與已有研究報道認為植物種類對根際微生物群落有影響的結論相符，即使是相同物種，基因型不同也會導致微生物群落的差異[38]。

植物、微生物與植食昆蟲之間存在著密切關系，植物根系能感知微生物的存在，根系分泌物則是植物根系與土壤之間進行信息交流和能量傳遞的主要媒介[39]。研究表明，昆蟲取食植物能改變植物根系分泌物的組成和數(shù)量[40]。而植物可通過根系分泌生物活性分子來改變土壤微生物區(qū)系，誘導菌群繁殖，從而影響下一代植物的生長和抗蟲性[41-42]，如HU 等[43]研 究 發(fā) 現(xiàn)，草 地 貪 夜 蛾（Spodoptera frugiperda）取食玉米葉片后會誘導玉米根際分泌屬于防御性次生代謝產(chǎn)物的苯并惡嗪類化合物，然后通過調(diào)節(jié)土壤改變根際土壤微生物群落，最后使茉莉酸信號增強，葉片防御能力提高。另外，BADRI 等[44]研究表明，土壤微生物能通過影響植物揮發(fā)物，從而影響昆蟲的取食選擇性，保護植物免受昆蟲的危害。本研究中，在馬鈴薯塊莖蛾的取食脅迫下，2 個馬鈴薯品種植株根際土壤微生物的生長和群落結構均發(fā)生改變，總體表現(xiàn)為功能多樣性提高，很可能是由于馬鈴薯塊莖蛾取食誘導根系分泌物發(fā)生改變，最終造成土壤微生物群落的結構多樣性改變，形成了有益于自身生長的土壤微生態(tài)環(huán)境。同時，在馬鈴薯取食脅迫下，2個品種的根際土壤微生物功能多樣性存在一定差異，說明根際微生物群落結構和功能多樣性很可能受植物品種抗蟲性的影響[45]。根系微生物的這些改變是否與植株的抗蟲性有關，還值得進一步的研究。此外，由于Biolog 技術限制，本研究僅發(fā)現(xiàn)馬鈴薯塊莖蛾脅迫下根際土壤微生物發(fā)生了改變，但是具體哪一類微生物發(fā)生了改變，它們的改變有怎樣的作用，還需深入探究。