濃香型白酒窖泥理化因子、微生物群落、感官質(zhì)量以及相關(guān)性研究進(jìn)展

劉治國，方 超，張曉元，劉 玲，慕濟(jì)鍺，林良才,*，張翠英,*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101）

近年來，濃香型白酒因其獨特的風(fēng)味和良好的口感被消費者廣泛接受，據(jù)統(tǒng)計，其在中國白酒行業(yè)中的市場占有率約為70%[1]。傳統(tǒng)濃香型白酒采用的是“泥窖固態(tài)發(fā)酵”[2]，全泥窖池是濃香型白酒發(fā)酵必不可少的先決條件，相比于醬、鳳、特、芝麻等香型的發(fā)酵設(shè)備更容易附著且適宜微生物的生長繁殖，隨著窖齡不斷增加，最終形成了具有較高生物多樣性和功能多樣性的窖泥微生物生態(tài)系統(tǒng)。固態(tài)發(fā)酵即谷物經(jīng)蒸煮后拌入大曲置于窖池中，在此階段糖化和發(fā)酵同時進(jìn)行，這與西方蒸餾酒所采用的先糖化后發(fā)酵的方式存在顯著差異。自然固態(tài)發(fā)酵是涉及功能微生物群落與原料消耗及產(chǎn)物形成的復(fù)雜動態(tài)過程[3]，窖池中的環(huán)境變量和微生物群落會直接或間接地影響風(fēng)味化合物的形成[4]。長期的生產(chǎn)實踐表明，老窖池發(fā)酵生產(chǎn)的白酒質(zhì)量要優(yōu)于新窖池[5]。因此，全面剖析窖泥理化因子、窖泥功能微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性以及窖泥感官質(zhì)量評價等成為濃香型白酒行業(yè)長期持續(xù)的研究熱點[6-8]。本綜述總結(jié)了前人對濃香型白酒窖池的研究方法和結(jié)論，以期為業(yè)界了解比較窖泥質(zhì)量研究演進(jìn)提供便利，同時也為控制窖泥培養(yǎng)條件和窖泥養(yǎng)護(hù)乃至基礎(chǔ)研究提供必要的借鑒和啟發(fā)。圖1為濃香型全泥窖池涉及的主要理化因子、微生物群落和風(fēng)味化合物。

1 窖泥理化因子對窖池質(zhì)量的影響

窖池作為營養(yǎng)物質(zhì)的載體和微生物的棲息地，其環(huán)境在較大程度上決定了微生物群落結(jié)構(gòu)及演替[9]。窖泥含水量與窖泥微生物的生長代謝存在密切關(guān)系，菌體所需要的營養(yǎng)物質(zhì)必須呈水溶液狀態(tài)才能被吸收利用[10]，水分含量過低會導(dǎo)致窖泥板結(jié)、微生物生長困難；水分含量過高則會出現(xiàn)窖泥掛壁困難及垮窖等問題。窖池的pH值是影響窖泥質(zhì)量的另一個關(guān)鍵因素，酸度過高會影響微生物細(xì)胞膜電荷變化，從而抑制窖泥微生物的生長代謝[11]，甚至?xí)绊懡涯嘀形⑸锏难萏妗o機鹽是構(gòu)成菌體和酶，以及促進(jìn)酶作用的重要成分，無機鹽包括磷酸鹽、硫酸鹽、氯化物及K、N、P、Na、Mg、Fe、Ca等元素的化合物，這些物質(zhì)是微生物生長繁殖和生理代謝所必需的微量元素，適量范圍的微量元素對維持窖泥質(zhì)量和提高白酒品質(zhì)起著重要作用。腐殖質(zhì)是評價土壤肥力的指標(biāo)，除了可以為窖泥微生物提供必需的基本養(yǎng)分外，還有助于維持窖泥良好的保水性，減緩乳酸亞鐵和乳酸鈣的形成[12]。因此，深入研究窖泥的理化性質(zhì)，調(diào)節(jié)微生物發(fā)酵環(huán)境，從而建立窖泥品質(zhì)指標(biāo)和穩(wěn)定濃香型白酒的品質(zhì)具有重要的指導(dǎo)意義。

1.1 窖泥理化因子與窖齡之間的關(guān)系

目前對窖泥理化因子的研究多集中在窖齡的相關(guān)性方面。有研究表明，pH值和水分含量是影響窖泥質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)[8]。一般新窖泥的pH值較低，不過隨著窖齡的增加，新窖泥逐漸趨于老熟，pH值呈上升趨勢[13]，優(yōu)質(zhì)老窖泥的pH值一般維持在7左右[12-14]。窖泥含水量隨窖齡的增加而增加，這可能意味著微生物的代謝活動在新老窖泥中存在差異，含水量越高的窖泥微生物代謝活性越高[15]。吳浪濤等[16]對10 年和30 年的窖泥理化因子進(jìn)行了比較，結(jié)果表明10 年窖泥的己醇和乳酸含量較高，而含水量、有效磷、速效鉀含量以及己酸、丁酸乙酯、己酸乙酯等關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)含量均是30 年窖泥較高，與之前相關(guān)研究結(jié)論一致。為進(jìn)一步揭示窖泥理化性質(zhì)隨窖齡增加的變化趨勢，Tao Yong等[17]分別對1～50 年窖泥的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH值和含量隨窖齡增加而增加，乳酸含量則隨窖齡增加而降低。結(jié)合之前的研究結(jié)論可推測，隨著窖齡的增加，窖泥中的微生物菌群代謝鏈逐漸趨于新的平衡，在一定程度上可以促進(jìn)環(huán)境中乙醇、乙酸、丁酸、乳酸含量的降低，同時提高和己酸的含量。另外有研究表明，乳酸和乙醇均具有抑菌作用。當(dāng)二者的含量下降并趨于一定的濃度范圍時，窖泥的理化環(huán)境更適宜功能微生物菌群的生長，這也是環(huán)境因子對功能微生物菌群影響的綜合體現(xiàn)[18-19]。表1展示了新老窖泥中常見的理化因子及其變化趨勢。

表1 新老窖泥的理化因子及其變化趨勢Table 1 Physicochemical factors of new and old pit mud and their changing trends

1.2 窖泥理化因子與窖池空間位置之間的關(guān)系

同一窖齡的窖池雖然是一個整體，但是在空間結(jié)構(gòu)上窖底泥和窖壁泥的理化環(huán)境存在較大的差異。相比于窖壁，窖底所處的環(huán)境氧氣含量更少，并長期浸泡在黃水中，pH值、水分、微量元素等指標(biāo)水平比窖壁泥要高，長期的實踐和研究均表明接觸窖底的酒醅發(fā)酵所產(chǎn)生的風(fēng)味化合物含量要高于接觸窖壁泥的酒醅[25]。所以目前大多數(shù)研究僅僅通過窖池的使用時間為依據(jù)來評價某一窖池的各項指標(biāo)具有一定的局限性。因此，有必要對窖池的不同空間位置進(jìn)行深入的研究，從而全面剖析窖池的各項指標(biāo)。李俊輝等[26]通過對比窖壁泥和窖底泥與窖齡之間的變化趨勢發(fā)現(xiàn)，窖壁泥的pH值隨窖齡的增加呈下降趨勢，由最初的中性逐漸變?yōu)樗嵝?，而窖底泥的pH值則呈先降低后逐漸上升趨勢，最終穩(wěn)定在7.5左右。隨著窖齡的增加，有效磷、速效鉀等微量元素均呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。但就含量而言，窖底泥遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于窖壁泥。胡曉龍等[27]以濃香型白酒35 年的窖泥為研究對象，對窖壁上、中、下層和窖底窖泥的理化因素進(jìn)行了解析，結(jié)果表明窖壁不同位置的含水量、乙醇、總酸以及有效磷含量隨窖壁深度的增加逐漸上升，pH值與含量的變化趨勢則與之相反。與窖壁泥相比，窖底泥pH值、有效磷和的含量較高，且pH值和有效磷含量顯著高于窖壁的上層窖泥。形成這一結(jié)果的主要原因可能是窖壁泥透氣性較好，且含氧量較高，為好氧的產(chǎn)酸菌提供了良好的生長環(huán)境，最終導(dǎo)致pH值下降。而窖底泥因長期處于厭氧的環(huán)境下，逐漸形成一條完整的代謝鏈，不同微生物之間相互作用使得pH值處于接近中性的狀態(tài)。

為進(jìn)一步揭示窖泥不同空間位置理化性質(zhì)之間的差異，徐相輝等[28]通過對濃香型白酒新老窖泥底部1～7 cm深度的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)新老窖泥的pH值與窖泥深度呈明顯的正相關(guān)，水分、腐殖質(zhì)、各種有機酸含量與窖泥的深度呈負(fù)相關(guān)，含量在老窖泥不同深度中差異不明顯，在新窖泥中隨窖泥的深度增加而增加。張會敏等[29]對不同深度窖泥理化性質(zhì)與菌群結(jié)構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)性研究也表明新窖泥5～7 cm深度的窖泥質(zhì)量與老窖泥1～3 cm深度的窖泥質(zhì)量相當(dāng)。從以上研究結(jié)果可以看出新窖泥深層質(zhì)量較淺層更高，且可以推測底層窖泥的成熟可能是由深層窖泥優(yōu)先開始的。在窖池理化因子與窖池空間位置關(guān)系的研究中，不同垂直深度上表現(xiàn)出規(guī)律性差異，在新窖池的使用過程中，發(fā)酵產(chǎn)生的黃水在窖底表層和淺層逐漸積累，其中含有的大量有機酸導(dǎo)致pH值處于較低水平，隨著窖池深度深入至5～7 cm位置處，水分含量呈遞減趨勢，有機酸被微生物降解使得pH值逐漸上升，較適宜的環(huán)境為微生物的富集提供了基礎(chǔ)。另有研究表明，新窖池是從角落優(yōu)先老化的[18]，一個可能的原因是黃水在角落的滲透比其他位置弱，特別是更深角落的微生物有更多時間進(jìn)行自我繁殖以發(fā)揮降酸功能。

1.3 綜合窖泥理化因子評價窖泥質(zhì)量水平

Zhang Huimin[24]、Chai Lijuan[30]、李芳莉[31]等的研究表明，不同酒廠的窖泥在某些理化指標(biāo)方面存在較大差異?？紤]到研究結(jié)論僅來源于單個酒企的窖泥樣品，且樣品量較少，胡曉龍等[32]以河南省5 個地區(qū)的6 家濃香型酒企的窖泥樣品為研究對象，對河南酒企的窖泥理化指標(biāo)進(jìn)行綜合評價。結(jié)果表明，6 家酒企窖泥的平均水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、總酸含量、pH值、有效磷含量和含量分別為39.21%、7.51 mg/g、5.36、214.7 mg/kg和699.0 mg/kg。任良棟等[12]對全國各省份46 家有代表性的濃香型白酒企業(yè)的窖泥理化及微生物指標(biāo)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，窖泥水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于30%的企業(yè)占比76%，窖泥產(chǎn)酸能力大于100 mg/100 mL的企業(yè)占比84.78%，pH值大于5.5的企業(yè)占比78.46%，窖泥腐殖質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于2%的企業(yè)占比89%，含量大于800 mg/kg的企業(yè)占比93%。通過對窖泥產(chǎn)酸情況和窖泥中梭菌數(shù)量的相關(guān)性分析表明，窖泥產(chǎn)酸能力與窖泥中梭菌數(shù)量呈正相關(guān)，且窖泥的產(chǎn)酸能力越強，原酒中己酸乙酯含量越高，乙酸乙酯和乳酸乙酯含量之比越低。窖泥理化因子除影響菌群結(jié)構(gòu)外，不同理化因子之間也存在顯著相關(guān)性，其中pH值與窖泥含水量和含量呈顯著正相關(guān)，總酸含量與含量呈顯著負(fù)相關(guān)。該研究可以為酒企的窖泥養(yǎng)護(hù)和人工窖池提供數(shù)據(jù)參考和理論支撐。

2 窖泥微生物群落的研究進(jìn)展

在正常、連續(xù)、長期的生產(chǎn)過程中，窖池中的微生物不斷被馴化，最終形成相對穩(wěn)定的微生物菌群，主要包括細(xì)菌、古細(xì)菌等微生物，這些微生物的結(jié)構(gòu)、豐度以及種間相互作用等因素對濃香型白酒形成獨特風(fēng)味發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。以往研究窖泥微生物的方式大多基于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)，但是由于窖泥中的微生物大多數(shù)屬于厭氧微生物，其厭氧要求和培養(yǎng)條件的不明確極大地限制了研究人員對窖泥微生物的全面認(rèn)識和深入剖析。近年來隨著微生物學(xué)、現(xiàn)代生物技術(shù)和分子生物學(xué)等周邊學(xué)科的迅速發(fā)展，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的有機結(jié)合成為了研究窖泥微生物的有力武器，如將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）[33]、16S rRNA基因克隆文庫、磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid，PLFA）生物標(biāo)志物、熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）、高通量測序等技術(shù)應(yīng)用于窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性演替等方面的解析，極大地提高了對窖泥樣品中微生物演替的認(rèn)識水平。以往關(guān)于大曲、酒醅和窖泥的研究結(jié)果表明，溫度、水分、氧氣、pH值以及金屬離子等環(huán)境條件是微生物演替的重要驅(qū)動因素。此外，微生物之間的相互作用決定了微生物群落的結(jié)構(gòu)。在窖泥長期重復(fù)的生產(chǎn)使用中，高酸度、缺氧、乙醇等環(huán)境脅迫作用不斷驅(qū)使窖泥對微生物定向篩選，窖泥中的原核微生物是白酒香味成分的前驅(qū)動力，是多種香味產(chǎn)生的主要來源，這些微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的差異可能是造成我國濃香型白酒風(fēng)味多樣化的原因之一。

2.1 窖泥原核微生物結(jié)構(gòu)和多樣性演替

據(jù)目前已有文獻(xiàn)報道，窖泥中的原核微生物主要優(yōu)勢門是厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、廣古菌門（Euryarchaeota）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、放線菌門（Actinobacteria）[17,34-37]。主要的優(yōu)勢菌群有梭菌屬（Clostridium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、互營單胞菌屬（Syntrophomonas）。窖泥在成熟過程中微生物豐度會發(fā)生顯著的變化，在新窖泥中厚壁菌門是優(yōu)勢菌門，尤其是乳球菌和乳酸菌[38]。隨著窖齡的增加，厚壁菌門的豐度會逐漸下降，除乳酸菌之外的其他菌屬，如未分類的厭氧菌屬，未分類的梭菌屬、梭菌、假單胞菌等豐度會呈上升趨勢。老窖泥中典型的菌屬為梭菌，梭菌可以利用乙醇、乙酸和乳酸為底物合成丁酸和己酸[39-40]，這兩種酸是濃香型白酒中丁酸乙酯和己酸乙酯的前體物質(zhì)[41-42]，在酒體風(fēng)味特征方面起著重要作用。隨著窖池使用時間的延長，老窖泥中乳酸菌的豐度相比新窖泥顯著降低，而梭狀芽孢桿菌、甲烷桿菌、甲烷短桿菌等的含量增加[43]。Zheng Qi等[34]采用Illumina MiSeq測序揭示了窖齡30 年窖泥和300 年窖泥的微生物多樣性；Liu Maoke等[44]通過Illumina MiSeq測序研究了40 年和400 年瀘州老窖窖泥細(xì)菌群落的多樣性，二者結(jié)果均表明兩個窖齡樣本微生物的結(jié)構(gòu)無顯著性差異，但在窖泥微生物的豐度上有較大差異。Chai Lijuan等[45]通過實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）分析了30、100、300 年窖泥樣品的微生物群落，結(jié)果表明梭狀芽孢桿菌的相對豐度與窖齡呈顯著的正相關(guān)，擬桿菌的相對豐度與窖齡呈顯著的負(fù)相關(guān)[46]，此結(jié)果與之前的報道一致，因此梭狀芽孢桿菌和擬桿菌的豐度可作為鑒別窖泥質(zhì)量的潛在指標(biāo)。Tan Guangxun等[11]使用焦磷酸測序技術(shù)研究了1～50 年窖泥樣品中原核生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化情況，聚類分析結(jié)果表明，1 年窖齡的微生物形成集群，25 年和 50 年窖齡的微生物也傾向于形成1 個集群，10 年窖齡的微生物在兩個集群中間無規(guī)則地分布，表明它們處于初始馴化期（1 年）到成熟期（25 年以上）之間的過渡狀態(tài)。Wang Xujia等[47]采用Roche 454焦磷酸測序技術(shù)和磷脂脂肪酸分析技術(shù)揭示了5、30 年和100 年窖齡的窖泥樣品中原核生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，研究顯示Shannon指數(shù)在窖齡5～30 年區(qū)間的窖泥樣品中顯著降低，在窖齡30～100 年區(qū)間的窖泥樣品中趨于穩(wěn)定。造成這一結(jié)果的原因可能是微生物對窖泥獨特生境（富含有機質(zhì)、高酸度和缺氧）的適應(yīng)模式，適應(yīng)性微生物逐漸被富集，而不適應(yīng)性微生物逐漸被淘汰，最終形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)，綜合之前的研究結(jié)論可以大致推測出窖泥的成熟約需要25～30 年[15]。根據(jù)文獻(xiàn)[20,48-49]的結(jié)論，窖泥成熟過程中核心微生物以及古細(xì)菌的演替過程如圖2所示。

圖2 核心微生物及古細(xì)菌隨窖齡增長的演替過程Fig. 2 Succession of core microorganisms and archaea in pit mud with cellar age

2.2 窖泥真核微生物結(jié)構(gòu)和多樣性演替

與原核微生物相比，對真核微生物的研究多集中在大曲制作和貯藏期微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化以及酒醅入池發(fā)酵后酒醅的微生物群落組成和演替等方面，對窖泥中真核微生物結(jié)構(gòu)和多樣性的研究相對較少。孟雅靜等[50]采用Illumina高通量測序技術(shù)對濃香型白酒的窖壁泥和窖底泥中真核菌群的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明在老窖池池底泥的6 個樣品中，只有1 個樣品被成功擴增測序，說明老窖池池底泥中真菌的含量非常少。對該樣本分析發(fā)現(xiàn)，在屬水平上優(yōu)勢真核菌屬（相對豐度大于1%）在窖底泥與窖壁泥的差異明顯。新窖池底泥中的真核菌群組成比較單一，假絲酵母占絕對優(yōu)勢，兩組樣本的窖壁泥的真核菌群組成較為豐富。老窖池壁泥的優(yōu)勢真核菌屬有畢赤酵母屬、假絲酵母屬、馬拉色菌屬、嗜熱子囊菌屬等；新窖池壁泥的優(yōu)勢真核菌屬有假絲酵母屬、畢赤酵母屬、曲霉屬等。王春艷等[51]對宋河濃香型白酒不同窖齡窖泥與窖底泥真菌群落結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，窖壁泥中真菌豐富度和多樣性均高于窖底泥，新窖泥中主要有青霉菌屬、氈盤菌屬和被孢酶屬等，老窖泥中主要有嗜熱真菌屬、曲霉屬和根毛霉屬。以上研究表明窖泥位置和窖齡都對真菌的群落結(jié)構(gòu)有所影響，窖壁泥中真菌菌群物種多樣性和豐富度均高于窖底泥。另外，Liu Maoke等[52]采用DGGE和Illumina MiSeq測序方法研究了四川省不同年份窖泥的真菌群落結(jié)構(gòu)，并確定子囊菌、擔(dān)子菌和接合菌是四川窖泥的主要真菌門。與該研究結(jié)果不同的是，Cai Wenchao等[53]采用高通量測序技術(shù)揭示了新疆地區(qū)窖泥不同深度真菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，發(fā)現(xiàn)新疆地區(qū)窖泥無論深度如何，優(yōu)勢真菌門均為子囊菌、擔(dān)子菌和霉菌。究其原因，可能是兩地區(qū)優(yōu)勢真菌門的差異可能是區(qū)域地理氣候不同、土壤差異以及窖泥理化性質(zhì)等多重因素共同造成的。

3 窖泥感官質(zhì)量評價

感官評價以其簡單、直觀、快捷以及不需要借助任何儀器設(shè)備和固定的檢驗場所等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，在原料和產(chǎn)品的鑒定中具有不可替代的作用。在濃香型白酒生產(chǎn)過程中，窖泥感官是評價窖泥質(zhì)量的重要參考依據(jù)。棲息在窖泥中的微生物不斷適應(yīng)窖池環(huán)境，并從窖泥和黃水中攝取營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖和復(fù)雜的代謝活動，從而使得窖泥在視覺、嗅覺以及觸覺等方面發(fā)生不同程度的變化，最終導(dǎo)致窖泥品質(zhì)之間的差異。釀酒師傅憑借長期的實踐經(jīng)驗，通過窖泥的感官特性就可以初步判斷窖泥品質(zhì)的優(yōu)劣，這也是目前酒企對窖泥質(zhì)量評判最常用的方法[54]。

3.1 色澤

色澤是反映窖泥老熟程度的一個重要指標(biāo)。一般來說，隨著長時間連續(xù)發(fā)酵，窖泥不斷成熟，色澤由黃土色逐漸變成灰褐色或黑褐色，表面濕潤光滑且具有光澤，這是優(yōu)質(zhì)窖泥所具備的典型特征。而質(zhì)量中等的窖泥一般呈黃褐色，質(zhì)量較差的窖泥呈黃色或者呈現(xiàn)出制作窖泥時泥質(zhì)的本色。

3.2 氣味

優(yōu)質(zhì)老窖泥帶有濃郁的酒香和酯香，且香味純正持久。質(zhì)量中等的窖泥窖香味較正，有較好的酒香和酯香，香味持續(xù)時間稍短。質(zhì)量較差的窖泥含有淡淡的酒香和酯香，有一定的異味，比如酸味、腐敗味、生泥味等。

3.3 質(zhì)地

質(zhì)地主要反應(yīng)窖泥的物理狀態(tài)，優(yōu)質(zhì)窖泥有明顯的黏手感、斷層有氣泡，用手輕輕捻動，其有天鵝毛般的質(zhì)地。質(zhì)量中等的窖泥表層較柔熟細(xì)膩，有一定的黏稠感，斷面有氣泡。質(zhì)量較差或者退化的窖泥，樣品中常會有晶體或白色顆粒析出，有時甚至伴隨著窖泥板結(jié)。

梁歡[55]、余有貴[56]等對不同質(zhì)量窖泥樣品理化性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性以及所產(chǎn)酒體感官和風(fēng)味化合物進(jìn)行分析，并以此作為窖泥等級劃分和評分的依據(jù)，最終結(jié)果與窖泥感官評價的結(jié)果相一致。李覓等[57]在色澤、氣味、質(zhì)感等感官評價的基礎(chǔ)上，又加入了理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)，建立了窖泥質(zhì)量評分標(biāo)準(zhǔn)，并確定每個指標(biāo)的評分細(xì)則和分值權(quán)重。如表2所示，利用該方法對3、10、30 年窖齡的窖泥進(jìn)行了評價，每個窖齡的3 組平行樣品平均得分分別為6.4、8.0、8.7，結(jié)果與“老窖產(chǎn)好酒”的說法基本一致。

表2 窖泥質(zhì)量評定的標(biāo)準(zhǔn)[57]Table 2 Criteria for pit mud quality assessment[57]

4 窖泥理化因子、微生物群落、感官質(zhì)量三者之間的相關(guān)性

4.1 窖泥理化因子與微生物群落之間的相關(guān)性

窖泥理化因子是影響微生物群落α-多樣性及β-多樣性的重要因素，目前發(fā)表的文獻(xiàn)大多基于冗余分析（redundancy analysis，RDA）來闡明微生物群落結(jié)構(gòu)與理化因子之間的相關(guān)性。雖然不同文獻(xiàn)中環(huán)境因子和微生物群落的相關(guān)性和顯著性略有差異，但是從這些研究結(jié)果可以看出明顯的相似性。Tao Yong等[17]對比不同窖齡窖泥研究發(fā)現(xiàn)，乳酸、pH值、和丁酸水平與原核微生物的豐度顯著相關(guān)，其中pH值和含量與擬桿菌門和廣古菌門的相對豐度呈正相關(guān)，而與厚壁菌門的相對豐度呈負(fù)相關(guān)。劉梅等[58]研究了窖泥理化因子與微生物群落之間的相關(guān)性，結(jié)果表明含量、pH值、總氮含量分別和厚壁菌門、互養(yǎng)菌門比例呈正相關(guān)，與變形菌門、綠彎菌門比例呈負(fù)相關(guān)。有效磷含量與互養(yǎng)菌門和放線菌門比例呈正相關(guān)。腐殖酸含量和變形菌門比例呈正相關(guān)。通過RDA可以進(jìn)一步看出、總氮、有效磷含量和pH值對微生物群落的影響最大，其次為水分、腐殖酸、鈣和鐵元素含量。胡曉龍等[59]對3 個不同質(zhì)量等級窖泥中厭氧微生物群落以及共生模式的分析結(jié)果表明，pH值、含量、有效磷含量主要與梭狀芽孢桿菌、甲烷桿菌和擬桿菌的相對豐度呈正相關(guān)，而與芽孢桿菌、乳酸菌的相對豐度呈負(fù)相關(guān)，同時該研究結(jié)論也闡述了隨窖齡的增加窖池產(chǎn)己酸能力增加的原因。在窖池使用過程中，窖泥的理化指標(biāo)會影響微生物的生長代謝、酶活性，進(jìn)而導(dǎo)致微生物群落的改變[32]。因此，深入認(rèn)識窖泥理化性質(zhì)與微生物的關(guān)聯(lián)性分析有助于進(jìn)一步指導(dǎo)新老窖泥的日常養(yǎng)護(hù)。

4.2 窖泥微生物群落與感官質(zhì)量之間的聯(lián)系

窖泥的質(zhì)量本質(zhì)上取決于窖泥中所含微生物的種類及數(shù)量，隨著窖齡的增加，窖池微生物適應(yīng)并改造理化環(huán)境的能力不斷增強，當(dāng)功能微生物積累到一定程度，其代謝產(chǎn)生的物質(zhì)逐漸改變窖泥的視覺、嗅覺以及觸覺等品質(zhì)，這就為窖泥的感官質(zhì)量提供了評價基礎(chǔ)。微生物產(chǎn)生的風(fēng)味化合物主要包括酯類、醇類、酸類、醛酮類以及芳香族化合物等，其中酯類是放香的主體物質(zhì)，酯類大多屬于較易揮發(fā)且香氣較強的一類化合物，具有令人愉悅的花香或果香氣味。酸類物質(zhì)一般不易揮發(fā)，屬于白酒中重要的呈味物質(zhì)，但是酸可以與醇發(fā)生酯化反應(yīng)，從而生成具有放香作用的酯類物質(zhì)。醇類物質(zhì)是香和味之間的橋梁，醇類物質(zhì)的沸點一般較低、易揮發(fā)，在揮發(fā)的過程中“拖帶”出其他組分物質(zhì)揮發(fā)，因此是重要的助香化合物。同樣，醛類物質(zhì)和酮類物質(zhì)也具有助香和提香的作用。吳浪濤等[16]在不同窖泥樣品中共檢測到101 種風(fēng)味物質(zhì)，通過對比10 年和30 年窖泥樣品中揮發(fā)性化合物發(fā)現(xiàn)，30 年窖泥樣品中酯類化合物顯著高于10 年窖泥，酸類物質(zhì)含量無明顯差異，10 年窖泥樣品中的醇類物質(zhì)含量顯著高于30 年窖泥樣品。這些物質(zhì)隨著窖池長期、反復(fù)的使用逐漸和窖泥融為一體，使得窖泥具有濃郁的窖香味和酒香味，并伴隨著色澤的不斷加深[60]，最終可作為評價窖泥感官質(zhì)量的重要指標(biāo)。

4.3 窖泥理化因子與感官質(zhì)量之間的聯(lián)系

從本質(zhì)上來講，濃香型白酒窖池的組成可以分為兩個部分，即培養(yǎng)基和菌種。培養(yǎng)基又可以細(xì)分為載體物質(zhì)（主要是泥質(zhì)）和營養(yǎng)物質(zhì)（如水分、腐殖質(zhì)、無機元素等）。在窖泥制作過程中，培養(yǎng)基配方直接決定窖泥初始的理化環(huán)境，而理化環(huán)境是否適宜又直接決定微生物的生長繁殖情況。窖池的泥質(zhì)一般采用吸水性較強的黃黏土，另外加入一定量的泥炭以增加窖泥中的腐殖質(zhì)含量。除此之外，泥炭還具有良好的保水性能和酸度緩沖作用。一些酒企在窖泥制作中可能還會選擇藕塘泥，藕塘泥中含有較高含量的氨態(tài)氮、腐殖質(zhì)和微生物菌系，較黃黏土更有利于窖泥的老熟。水分可以將泥質(zhì)、曲粉、酒醅及其他有機質(zhì)充分混合成黏稠的半固態(tài)，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般在39%～45%之間為宜，從而有利于后期搭窖時窖泥附著于窖壁。酒醅微生物在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生乙酸、乳酸等大量有機酸，這些有機酸會隨黃水逐漸向窖泥中滲透，有機酸的積累會使pH值降低，最終導(dǎo)致窖泥酸化[61]，甚至板結(jié)。另外，若因日常養(yǎng)護(hù)不善致使pH值過高，窖泥則會出現(xiàn)較明顯的氨味。腐殖質(zhì)主要由C、H、O、N、P、S等元素構(gòu)成，這些元素是窖泥微生物生長繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，此外腐殖質(zhì)具有一定的緩沖性，可以使黃黏土疏松，使砂土、糟醅等顆粒物質(zhì)黏結(jié)，是窖泥形成團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的良好膠結(jié)劑[12]。微生物可有效利用中的氮元素，含量在一定程度可以反映窖泥的質(zhì)量，但是含量過高容易導(dǎo)致窖泥臭味明顯。在濃香型白酒長期的生產(chǎn)釀造過程中，釀酒師傅可以依據(jù)窖泥一系列的感官變化來判斷窖泥各個理化指標(biāo)是否保持在一個相對均衡的水平上，同時從側(cè)面反映窖泥微生物生長的環(huán)境是否適宜。

5 結(jié) 語