殼聚糖-姜黃素光動(dòng)力協(xié)同作用對(duì)圣女果食源性致病菌的滅活效果

藍(lán)彩娟，陳潔怡，何雨薇，麻春陽(yáng)，黃 蕊，Nima AZARAKHSH，Tanushree GUPTA，吳希陽(yáng),*

（1.暨南大學(xué)理工學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.梅西大學(xué)Hopkirk研究所，新西蘭 北帕默斯頓 4474）

食源性致病菌是導(dǎo)致食品污染和危害食品安全的主要原因之一。2018年中國(guó)疾控信息系統(tǒng)報(bào)告，食物中毒事件中63.1%的病例是由攝入食源性致病菌引起的[1]。其中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌O157:H7（Escherichia coliO157:H7）、沙門(mén)氏菌（Salmonella Typhimurium）和單核細(xì)胞增生李斯特菌是世界衛(wèi)生組織公示的四大食源性致病菌[2]。此外，產(chǎn)芽孢菌如蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）因具有高度抗逆性而被認(rèn)為是食品滅菌中的一大挑戰(zhàn)。

目前食品工業(yè)的主要?dú)⒕绞椒譃闊釟⒕头菬釟⒕?。高溫?zé)崽幚砣菀讓?dǎo)致熱敏性食品如果蔬和生鮮肉品等感官特性和營(yíng)養(yǎng)成分的變化。近年來(lái)，一項(xiàng)多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的殺菌技術(shù)——光動(dòng)力處理（photodynamic treatment，PDT），因具有經(jīng)濟(jì)、便捷、無(wú)毒殘留、無(wú)耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于食品領(lǐng)域。PDT技術(shù)的關(guān)鍵要素是光敏劑、特定波長(zhǎng)光源和氧氣，3 個(gè)要素同時(shí)存在時(shí)可激發(fā)產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而攻擊滅活細(xì)菌[3]。選擇無(wú)毒無(wú)害的光敏劑和光源是PDT進(jìn)入食品行業(yè)的關(guān)鍵。姜黃素（curcumin，Cur）是一種天然光敏劑、著色劑和調(diào)味品，提取于姜黃根莖，本身具有光敏、抗菌、抗炎、抗氧化等活性，可被400～500 nm光激發(fā)產(chǎn)活性氧[4]。

PDT在滅活細(xì)菌、真菌及其孢子等方面已被廣泛報(bào)道，相比革蘭氏陽(yáng)性（G＋）菌，革蘭氏陰性（G－）菌對(duì)PDT的敏感性較差[5]。該技術(shù)缺陷可以通過(guò)添加靶向分子或修飾光敏劑來(lái)解決。目前有研究報(bào)道，添加靶向分子如多黏菌素B、ε-聚賴(lài)氨酸、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等可協(xié)同增效PDT[6-9]。此外，也有學(xué)者將L-聚賴(lài)氨酸、多黏菌素B和殼聚糖（chitosan，Chi）與光敏劑共價(jià)偶聯(lián)，通過(guò)修飾光敏劑以提高PDT滅菌效果[10-12]。然而，修飾光敏劑可能引發(fā)食品安全問(wèn)題，因此，本實(shí)驗(yàn)的研究思路是在PDT技術(shù)中添加安全有效的靶向分子Chi。

Chi是一種生物可降解、無(wú)毒且具有廣泛抗菌活性的陽(yáng)離子聚合物[6]，已作為食品添加劑廣泛用于制作可食涂膜并應(yīng)用于果蔬保鮮。Chi涂層可以降低果蔬呼吸頻率、保持水分、防止褐變和微生物污染，從而延長(zhǎng)貨架期[13]。圣女果是全球高消費(fèi)率的即食水果之一，富含維生素和番茄紅素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但圣女果在種植過(guò)程中需施用糞肥和堆肥，且種植環(huán)境中存在的野生動(dòng)物和爬行動(dòng)物會(huì)提高致病菌如Salmonella的污染率[14]。另外，圣女果不耐貯藏，這給流通銷(xiāo)售帶來(lái)了巨大壓力，因此圣女果的抗菌保藏問(wèn)題亟待解決。

目前關(guān)于Chi-PDT的報(bào)道主要集中在Chi納米復(fù)合材料的制備及其在癌癥、皮膚病、牙科生物膜等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用[15-17]。鮮有研究將PDT滅菌技術(shù)和Chi-Cur涂膜聯(lián)合應(yīng)用于水果抗菌和保藏。此外，果蔬攜帶的細(xì)菌種類(lèi)豐富，但目前對(duì)致病菌的滅活研究主要集中在單一菌，鮮有對(duì)混合菌滅活的研究。因此，本研究探究Chi-Cur協(xié)同PDT對(duì)S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella單一菌和混合菌的滅活效果，以及Chi與PDT的協(xié)同機(jī)理及對(duì)圣女果抗菌效果和品質(zhì)的影響，以期為食品安全生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

S. aureus（ATCC 6538）、B. cereus（CMCC 63303）、E. coli（ATCC 31350）、Salmonella（Salmonella Typhimurium，ATCC 14028）均保存于暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系。

‘千禧’圣女果購(gòu)自廣州某水果超市。

Cur（食品級(jí)，純度＞95%） 陜西慈緣生物技術(shù)有限公司；Chi（75%～85%脫乙?；?美國(guó)Sigma-Aldrich公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）、LB瓊脂（LB agar，LA）、平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）、亞硫酸鉍瓊脂（bismuth sulfite agar，BS）廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；瓊脂粉 德國(guó)Biofroxx公司；無(wú)水乙醇（分析純） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；乙酸（分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

發(fā)光二極管（light emitting diode，LED）光照設(shè)備（420 nm，69.97 mW/cm2）由暨南大學(xué)理工學(xué)院光電工程系和食品科學(xué)與工程系自主研發(fā)；DHP 120恒溫培養(yǎng)箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；HNYC-2102智能恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津歐諾儀器股份有限公司；X3FR高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；Infinite M200 PRO光柵型多功能微孔板檢測(cè)儀 瑞士Tecan公司；LS-400均質(zhì)器 上海比朗儀器制造有限公司；CS-820N色差儀 彩譜科技（浙江）有限公司；質(zhì)構(gòu)儀 美國(guó)博勒飛公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)

將凍存于－80 ℃冰箱的菌株取出，S. aureus、B. cereus和Salmonella劃線于NA平板，E. coli劃線于LA平板，于37 ℃倒置培養(yǎng)約12 h。挑取單菌落分別接種至相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，于恒溫（37 ℃）培養(yǎng)箱振蕩（120 r/min）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3.2 Chi-Cur配制

用體積分?jǐn)?shù)1%乙酸配制0.05%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）Chi溶液。稱(chēng)取Cur溶于無(wú)水乙醇，配制成20 mmol/L Cur母液，0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，4 ℃避光保存，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）或0.05% Chi作為溶劑，配制所需濃度的Cur或Chi-Cur溶液。

1.3.3 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Chi對(duì)致病菌的影響

取1 mL菌液分別與1 mL 0.05%、0.1%、0.5% Chi溶液混勻，孵育20 min，梯度稀釋?zhuān)?00 μL稀釋液，向S. aureus、B. cereus和Salmonella菌液中倒入NA，向E. coli菌液中倒入LA并進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)規(guī)則和菌落總數(shù)的計(jì)算方法參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。

1.3.4 PDT滅活致病菌

為比較PDT和Chi-PDT的滅活效果，取1 mL菌液分別與1 mL 100 μmol/L Cur或0.05% Chi-100 μmol/L Cur混合于6 孔板，暗孵育20 min，用LED藍(lán)光照射20 min（距離燈源10 cm）。為探究不同濃度Cur對(duì)Chi-PDT滅活效果的影響，取1 mL菌液分別與1 mL 0、5、15、25、50、100 μmol/L Cur（以0.05% Chi作為溶劑）混合，暗孵育20 min，用LED藍(lán)光照射20 min。取1 mL菌液與0.05% Chi-15 μmol/L Cur混合，暗孵育20 min，用LED藍(lán)光照射0、5、10、15、20 min，以探究不同光照時(shí)間對(duì)Chi-PDT滅活效果的影響。空白對(duì)照以等體積PBS代替，不做光照處理。處理結(jié)束后參照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

1.3.5 PDT滅活混合致病菌

等體積混合S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella菌懸液，取1 mL上述混合菌液與1 mL 15 μmol/L Cur或0.05% Chi-15 μmol/L Cur混合，暗孵育20 min后光照20 min。空白對(duì)照組以等體積PBS代替，不做光照處理。處理結(jié)束后，用PCA平板參照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

1.3.6 致病菌對(duì)Cur的吸收

參照Liang Zuxin等[8]的方法測(cè)定細(xì)菌對(duì)Cur的吸收量。用2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）稀釋Cur，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（Cur濃度為0～50 μmol/L）。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液和50 μmol/L Cur或0.05%Chi-50 μmol/L Cur等體積混合，暗孵育20 min，PBS洗滌兩次，2% SDS溶液重懸，并于37 ℃避光孵育20 h。隨后，5 500×g離心5 min，取上清液，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在425 nm激發(fā)波長(zhǎng)、530 nm發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度?？瞻讓?duì)照組以PBS替代Cur進(jìn)行相同操作。

1.3.7 PDT應(yīng)用于圣女果抗菌保鮮

圣女果用自來(lái)水清洗并去蒂，體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液消毒以除去其自帶細(xì)菌，晾干。將無(wú)菌圣女果分成3 組，每組設(shè)置3 個(gè)平行，每個(gè)平行60 個(gè)果實(shí)，保藏期間用聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（polyethylene terephthalate，PET）盒子盛裝并保存于25 ℃生化培養(yǎng)箱。將培養(yǎng)過(guò)夜的Salmonella用PBS稀釋至1×107CFU/mL，將圣女果浸泡于菌懸液1 min后撈出晾干1 h。隨后，將染菌果浸泡于100 μmol/L Cur或0.05% Chi-100 μmol/L Cur 1 min，撈出，于超凈工作臺(tái)干燥1 h，LED藍(lán)光照射20 min。空白對(duì)照組用PBS替代并進(jìn)行同樣操作[18]。

1.3.7.1 微生物分析

從每個(gè)盒子隨機(jī)選取2 顆圣女果置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入10 mL PBS，捏碎后用均質(zhì)器拍打2 min。吸取均質(zhì)液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?00 μL稀釋液倒入BS瓊脂，37 ℃倒置培養(yǎng)約24 h，對(duì)果實(shí)表面存活的Salmonella計(jì)數(shù)[18]。

1.3.7.2 色澤測(cè)定

從每個(gè)盒子隨機(jī)選取3 顆圣女果，用色差儀監(jiān)測(cè)其保藏期間的色澤變化。光源和角度為D65/10°，測(cè)量孔徑為6 mm。測(cè)定果實(shí)中間部位，每個(gè)果實(shí)測(cè)定3 個(gè)不同的表面，記錄明亮度（L*值）、紅綠度（a*值）和黃藍(lán)度（b*值）[18-19]。

1.3.7.3 質(zhì)量損失率

每個(gè)監(jiān)測(cè)日對(duì)圣女果稱(chēng)質(zhì)量，質(zhì)量損失率以當(dāng)日果實(shí)質(zhì)量相比初始質(zhì)量減少的比例表示。

1.3.7.4 硬度測(cè)定

用質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定圣女果硬度，選用直徑為4 mm的探針，以1 mm/s的速率穿刺圣女果，刺入穿刺深度為10 mm[18]，每個(gè)果實(shí)穿刺兩個(gè)不同的表面，結(jié)果用平均值表示。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素或雙因素方差分析，采用Tukey多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Chi的抑菌效果

據(jù)報(bào)道，Chi是具有抗菌性能的聚合物[6]。本研究結(jié)果顯示Chi對(duì)4 種食源性致病菌均有不同程度的抑菌效果，并具有濃度依賴(lài)性。如圖1所示，0.5% Chi分別使S. aureus和B. cereus的菌落總數(shù)減少了3.68（lg（CFU/mL））和6.37（lg（CFU/mL）），而使E. coli和Salmonella的菌落總數(shù)僅分別減少了1.25（lg（CFU/mL））和1.23（lg（CFU/mL）），即Chi對(duì)G＋菌的滅活效果明顯優(yōu)于G－菌，這一現(xiàn)象與Goy等[20]所報(bào)道的一致。富含陽(yáng)離子的Chi在靜電相互作用下可吸附到菌體表面，破壞其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)大分子，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。此外，Chi由乙酸配制而成，在酸性環(huán)境下，Chi會(huì)被廣泛質(zhì)子化，這會(huì)增強(qiáng)其與細(xì)菌表面陰離子基團(tuán)中羧基和磷酸基的結(jié)合[21]。關(guān)于Chi對(duì)G＋菌和G－菌滅活效果的差異，Duan Chao等[22]報(bào)道，由于G-菌有外膜，Chi需要先通過(guò)取代外膜的Ca2＋和Mg2＋才能直接以靜電相互作用吸附于細(xì)菌表面，導(dǎo)致細(xì)菌膜裂解，從而達(dá)到殺菌效果；而對(duì)于無(wú)外膜的G＋菌，Chi的多陽(yáng)離子長(zhǎng)鏈分子結(jié)構(gòu)使其可以直接高效、大面積地吸附于細(xì)菌表面，因此滅活效果更佳。本研究探究Chi對(duì)PDT協(xié)同作用效果的實(shí)驗(yàn)中選用Chi的最低抑菌劑量（0.05%）。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)Chi對(duì)4 種致病菌的抑菌效果Fig. 1 Antibacterial efficacy of Chi at different concentrations against four pathogens

2.2 Chi-PDT對(duì)致病菌的滅活效果

2.2.1 PDT和Chi-PDT滅活效果比較

如圖2所示，低劑量的Chi（0.05%）可分別使S. aureus和B. cereus的菌落總數(shù)減少3.05（lg（CFU/mL））和5.62（lg（CFU/mL）），而對(duì)E. coli和Salmonella無(wú)明顯滅活作用。100 μmol/L Cur介導(dǎo)的PDT可分別使S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella的菌落總數(shù)減少2.96、5.79、0.51、2.35（lg（CFU/mL））。然而，當(dāng)Chi和PDT共同作用時(shí)，菌落總數(shù)均可減少約8.00（lg（CFU/mL）），Chi-PDT對(duì)S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella的滅活菌落數(shù)相比于PDT單獨(dú)作用分別提升了5.66、1.84、8.18、6.30（lg（CFU/mL）），表明Chi對(duì)PDT具有顯著的協(xié)同增效作用。原因可能是Chi增強(qiáng)了Cur的水溶性，進(jìn)而促進(jìn)Cur滲透進(jìn)入細(xì)菌，增強(qiáng)PDT的滅活效果，這與Li Tianmin等[23]報(bào)道的一致。此外，Chi溶液本身具有黏性和陽(yáng)離子特性[22]，因此推測(cè)Chi可以延長(zhǎng)Cur在細(xì)菌表面的接觸時(shí)間，從而加劇PDT對(duì)菌體的損傷。

圖2 PDT和Chi-PDT對(duì)4 種致病菌的滅活效果Fig. 2 Bactericidal efficacy of PDT and Chi-PDT against four pathogens

2.2.2 Cur濃度對(duì)Chi-PDT抑菌效果的影響

如圖3所示，隨著Cur濃度的增加，Chi-PDT的抑菌效果逐漸增強(qiáng)。Cur濃度的增加會(huì)使活性氧水平增加，從而增強(qiáng)滅菌效果。0.05% Chi-15 μmol/L Cur可分別使S. aureus和B. cereus的菌落總數(shù)減少7.90（lg（CFU/mL））和7.60（lg（CFU/mL）），而滅活相同數(shù)量的E. coli和Salmonella則分別需要100 μmol/L和25 μmol/L Cur，說(shuō)明相比于G＋菌，即使在Chi與PDT協(xié)同作用時(shí)，也仍然需要更高濃度的光敏劑來(lái)殺滅G－菌。Li Tianmin等[23]將0.5% Chi-25 μmol/L Cur和S. aureus共孵育10 min后光照10 min，可使其菌落總數(shù)減少5.00（lg（CFU/mL）），其所使用的Chi和Cur劑量較本研究更高，但滅活效果較本研究稍差。G－菌表面具有一層復(fù)雜外膜，該外膜是阻礙光敏劑滲透至菌體內(nèi)的物理屏障[24]，推測(cè)這是G－菌對(duì)Chi-PDT敏感性較低的關(guān)鍵原因。

圖3 Cur濃度對(duì)Chi-PDT滅活效果的影響Fig. 3 Influence of Cur concentration on the bactericidal effect of Chi-PDT

2.2.3 光照時(shí)間對(duì)Chi-PDT滅活效果的影響

如圖4所示，Chi-PDT對(duì)4 種致病菌的滅活效果隨光照時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，最佳滅活效果均出現(xiàn)在光照20 min時(shí)，分別使S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella的菌落總數(shù)減少了8.00、7.32、4.93、6.06（lg（CFU/mL））。結(jié)果表明，Chi-PDT對(duì)4 種致病菌的滅活效果均具有光照時(shí)間依賴(lài)性。光照時(shí)間和光功率密度決定光照劑量，有研究表明光照時(shí)間對(duì)PDT滅活效果的影響大于光功率密度[25]，所以實(shí)際食品工業(yè)應(yīng)用過(guò)程中可以通過(guò)恒定光功率密度、延長(zhǎng)光照時(shí)間來(lái)改善殺菌效果。

圖4 光照時(shí)間對(duì)Chi-PDT滅活效果的影響Fig. 4 Influence of illumination time on the bactericidal effect of Chi-PDT

2.3 Chi-PDT對(duì)混合致病菌的滅活效果

如圖5所示，15 μmol/L Cur介導(dǎo)的PDT僅可使4 種致病菌混合物的菌落總數(shù)減少0.91（lg（CFU/mL））。當(dāng)0.05% Chi和15 μmol/L Cur協(xié)同PDT處理混合菌時(shí)，其菌落總數(shù)減少6.00（lg（CFU/mL）），即Chi-PDT比PDT單獨(dú)作用時(shí)的抑菌量高5.09（lg（CFU/mL）），且對(duì)混合菌的滅活效果與單一菌滅活效果相當(dāng)。表明Chi-PDT無(wú)論是對(duì)于單一菌還是混合菌，都比PDT具有更好的滅菌效果。

圖5 PDT和Chi-PDT對(duì)混合菌的滅菌效果Fig. 5 Bactericidal efficacy of PDT and Chi-PDT on bacterial mixture

目前，大多數(shù)對(duì)于非熱殺菌技術(shù)的研究多專(zhuān)注于探究其對(duì)單一菌的滅活效果，如Li Tianmin等[23]探究Chi-PDT對(duì)S. aureus及其生物膜的滅活效果；Cap等[26]探究高靜水壓對(duì)Salmonella的滅活效果；Gan Zhilin等[27]探究等離子體活化水對(duì)E. coli和S. aureus的滅活效果；Kim等[28]采用紫外線-TiO2光催化和高靜水壓聯(lián)合處理滅活B. cereus。目前鮮有采用非熱殺菌技術(shù)滅活G＋菌和G－菌混合物的報(bào)道，其中，Kuliesiene等[29]發(fā)現(xiàn)采用TiO2光催化滅活Salmonella和E. coli混合物時(shí)，其滅活效果不如滅活單一菌；El Kadri等[30]探究大氣壓冷等離子體對(duì)E. coli和單核細(xì)胞增生李斯特菌混合生物膜的滅活效果，也發(fā)現(xiàn)混合生物膜敏感性較差。本研究結(jié)果與上述研究不同，這可能是菌株種類(lèi)、混合菌株數(shù)量和殺菌方式的差異導(dǎo)致的。

2.4 致病菌對(duì)Cur的吸收

如圖6所示，在Chi存在時(shí)，4 種致病菌的熒光強(qiáng)度均顯著高于無(wú)Chi組。S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella中Chi-Cur組的熒光強(qiáng)度分別比Cur組高122.92、80.67、137.75和104.14。2.2節(jié)結(jié)果顯示Chi可以顯著促進(jìn)PDT的滅菌效果，因此可推測(cè)Chi增強(qiáng)了細(xì)菌和光敏劑的相互作用，促進(jìn)了細(xì)菌對(duì)Cur的吸收。Buchovec等[6]采用Chi與葉綠素PDT協(xié)同滅活Salmonella，在掃描電子顯微鏡視野下發(fā)現(xiàn)細(xì)菌完全被葉綠素-Chi復(fù)合物覆蓋，并且發(fā)生了明顯的膜崩解現(xiàn)象。Liang Zuxin等[8]發(fā)現(xiàn)帶正電的高分子聚合物ε-聚賴(lài)氨酸可促進(jìn)細(xì)菌對(duì)Cur的攝取，從而增強(qiáng)Cur的光敏作用。本研究結(jié)果也證明Chi可以促進(jìn)Cur吸附滲透進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)，從而改善PDT的滅活效果。

圖6 4 種致病菌對(duì)Cur的吸收Fig. 6 Uptake of Cur by four pathogens

2.5 Chi-PDT處理后圣女果在保藏期間活菌數(shù)和品質(zhì)變化

2.5.1Salmonella菌落總數(shù)的變化

如圖7所示，經(jīng)檢測(cè)，未經(jīng)人工染菌前的圣女果表面不攜帶Salmonella，染菌后圣女果表面Salmonella的吸附量為6.69（lg（CFU/果））。在保藏前（第0天），100 μmol/L Cur介導(dǎo)的PDT處理對(duì)圣女果殺菌效果不顯著，然而Chi-PDT可以使Salmonella菌落總數(shù)顯著降低1.62（lg（CFU/果））。保藏18 d后，對(duì)照組圣女果的活菌數(shù)量較第0天增加了1.07（lg（CFU/果）），PDT處理組活菌數(shù)量增加了0.87（lg（CFU/果）），而Chi-PDT處理組活菌數(shù)量沒(méi)有增加。這說(shuō)明Chi-PDT能有效地殺滅圣女果表面的Salmonella，并且0.05% Chi-100 μmol/L Cur涂膜協(xié)同PDT處理可以較好地抑制Salmonella的生長(zhǎng)。Chai Zhengyuan等[4]采用2 μmol/L Cur介導(dǎo)PDT處理鮮切梨10 min，結(jié)果使Listeria monocytogenes菌落總數(shù)減少3.43（lg（CFU/g）），殺菌效果較本研究更好，推測(cè)原因是梨切成平整的薄片后，相比橢球形的圣女果接觸光面積更大，且受光照更均勻。Buchovec等[6]使用0.1%Chi-15 μmol/L葉綠素協(xié)同PDT處理草莓，可使Salmonella菌落總數(shù)減少2.20（lg（CFU/g）），本研究結(jié)果與之相近。Jin等[18]用Chi-異硫氰酸烯丙酯涂膜處理感染Salmonella的圣女果，21 d后活菌數(shù)從3.65（lg（CFU/果））降到無(wú)法檢測(cè)的水平，其與本研究的效果差異可能在于涂膜液的配制方法不同，該研究為0.9% Chi溶于2%乙酸、乳酸和乙酰丙酸混合溶劑。

圖7 圣女果在保藏期間的Salmonella數(shù)量Fig. 7 Salmonella counts on cherry tomatoes during storage

2.5.2 色澤變化

對(duì)消費(fèi)者而言，色澤是評(píng)價(jià)圣女果質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。如表1所示，L*值在保藏過(guò)程中顯著降低，但在第18天時(shí)Chi-PDT處理組仍顯著高于對(duì)照組，即Chi-PDT組仍具有較好的光澤。a*值在保藏期間升高，但每個(gè)觀察日內(nèi)組間無(wú)顯著差異，而且18 d后，對(duì)照組a*值比PDT處理組增幅更大。b*值在整個(gè)保藏過(guò)程中無(wú)明顯變化。成熟度（a*/b*）在保藏期間持續(xù)上升，但在第18天各組間無(wú)顯著差異，即Chi-PDT處理不會(huì)對(duì)圣女果的色澤和成熟度產(chǎn)生明顯影響。美國(guó)農(nóng)業(yè)部曾提出圣女果成熟階段的a*/b*范圍應(yīng)在0.95～1.21之間[19]，而本研究貯藏末期圣女果的a*/b*符合這一推薦范圍。因此，PDT處理對(duì)圣女果品質(zhì)無(wú)不良影響，并且Chi-Cur涂膜協(xié)同PDT處理能使圣女果保持較好的色澤。

表1 圣女果在保藏期間的色澤和硬度變化Table 1 Changes in color and firmness of cherry tomatoes during storage

2.5.3 硬度變化

在整個(gè)貯藏期間，圣女果硬度均在1 300 g左右（表1），同一處理組各監(jiān)測(cè)點(diǎn)間和同一監(jiān)測(cè)點(diǎn)不同組間無(wú)明顯變化，即PDT和Chi-Cur涂膜協(xié)同PDT處理不會(huì)對(duì)圣女果硬度有負(fù)面影響。

2.5.4 質(zhì)量損失情況

由圖8可知，保藏時(shí)間越長(zhǎng)，圣女果質(zhì)量損失率越高。這是因?yàn)槭ヅ诒２剡^(guò)程中會(huì)發(fā)生水分流失，所以質(zhì)量有輕微的下降，但各處理組間沒(méi)有顯著差異。

圖8 圣女果在保藏期間的質(zhì)量損失率Fig. 8 Mass loss of cherry tomatoes during storage

2.5.5 外觀變化

如圖9所示，PDT處理后保藏前（第0天）3 組圣女果在顏色上無(wú)明顯差異，經(jīng)18 d保藏后3 組圣女果顏色也無(wú)顯著差異，這與表1結(jié)果相印證，表明PDT處理不影響圣女果外觀。經(jīng)過(guò)18 d的保藏后，對(duì)照組和PDT組中部分圣女果出現(xiàn)發(fā)霉腐爛現(xiàn)象，但Chi-PDT組外觀完好，并且圖7結(jié)果顯示對(duì)照組和PDT組活菌數(shù)量在第18天增長(zhǎng)了約1.00（lg（CFU/果）），表明0.05% Chi-100 μmol/L Cur涂膜協(xié)同PDT處理能有效抑制Salmonella和霉菌的生長(zhǎng)繁殖，延長(zhǎng)圣女果的保質(zhì)期。

圖9 圣女果保藏前后的外觀變化Fig. 9 Changes in visual appearance of cherry tomatoes before and after storage

由此可見(jiàn)，Chi-PDT是一種能有效滅活圣女果表面Salmonella的非熱殺菌方法，并且Chi-Cur涂膜協(xié)同PDT處理能有效抑制Salmonella的繁殖，同時(shí)不會(huì)對(duì)圣女果的品質(zhì)產(chǎn)生不良影響，起到了較好的保鮮效果。

3 結(jié) 論

本研究選取Chi作為PDT的協(xié)同增效劑，結(jié)果表明Chi可通過(guò)促進(jìn)細(xì)菌對(duì)Cur的吸收從而增強(qiáng)PDT的殺菌效果。Chi-Cur協(xié)同PDT處理可有效滅活S. aureus、B. cereus、E. coli和Salmonella，其滅活效果與Cur濃度和光照時(shí)間呈正相關(guān)。PDT結(jié)合Chi-Cur涂膜可應(yīng)用于圣女果的抗菌和保藏。

本研究解決了PDT對(duì)G－菌滅活效果不理想這一難題，結(jié)合PDT和Chi-Cur涂膜技術(shù)，解決了圣女果的抗菌保藏問(wèn)題。但是本研究還存在一定的局限性，后續(xù)研究可聚焦于以下幾個(gè)方面：1）比較PDT和Chi-PDT對(duì)細(xì)菌芽孢、真菌孢子和病毒的滅活效果，探究Chi是否對(duì)于PDT滅活其他微生物亦具有協(xié)同增效作用，以拓寬Chi-PDT技術(shù)的應(yīng)用范圍；2）研究PDT和Chi-PDT處理后細(xì)菌中吸收Cur受體、細(xì)胞膜通透性、氧化應(yīng)激等相關(guān)基因表達(dá)的變化情況，從分子層面揭示Chi與PDT的協(xié)同增效機(jī)理；3）深入探究Chi-PDT對(duì)圣女果營(yíng)養(yǎng)成分（如VC、番茄紅素、黃酮類(lèi)化合物和酚類(lèi)等）含量的影響，助力開(kāi)發(fā)安全、高效及食品品質(zhì)友好的食品加工技術(shù)。