超聲處理結(jié)合pH值調(diào)控對白果分離蛋白/乳清分離蛋白復(fù)合凝膠特性的影響

尤潔瑜，唐長波，張露妍，張 薇，王耀松,*

（1.南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095）

銀杏果俗稱白果，作為一種藥食同源物質(zhì)，其內(nèi)含豐富的生物活性物質(zhì)[1]，因此逐漸進(jìn)入功能性健康食品的范疇[2]。近些年，隨著銀杏樹的廣泛種植，其果實(shí)的開發(fā)利用逐漸受到重視，特別是其果實(shí)的蛋白組分引起了人們廣泛的關(guān)注[3]。在前期的研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)白果分離蛋白（ginkgo seed protein isolate，GSPI）具有一定的凝膠性和營養(yǎng)價值，然而其食品品質(zhì)有待進(jìn)一步提高[4]，以滿足實(shí)際食品應(yīng)用體系對其感官品質(zhì)及營養(yǎng)品質(zhì)的要求[5]。

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）作為食品工業(yè)中常見的食品配料[6]，其主要組分為各類球蛋白，具有極高的營養(yǎng)價值以及極好的成膠性[7-8]，已廣泛應(yīng)用于各類食品體系[9]。然而在乳清蛋白生產(chǎn)過程中會增加溫室氣體的排放，且所需土地面積較大，成本相對較高[10]，將其引入到GSPI中可在彌補(bǔ)GSPI凝膠性能缺陷的同時降低食品生產(chǎn)成本。有研究表明，乳清蛋白無論與植物蛋白（如大豆蛋白[11-12]、菜籽蛋白[13]）還是動物蛋白[12,14]復(fù)合，其所形成復(fù)合物的凝膠性能均能得到顯著提升。

簡單地將兩種蛋白混合雖然能夠提高存在缺陷一方的蛋白性能，但復(fù)合蛋白的功能特性仍有進(jìn)一步提高的空間。超聲處理作為一種簡單高效的物理加工手段被廣泛應(yīng)用于蛋白改性中[15]，超聲改性蛋白主要是通過超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)、剪切和液體湍流等方式，影響蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用、氫鍵、二硫鍵等作用[16]，從而改變蛋白的功能特性；在蛋白凝膠體系中，超聲處理能夠顯著改善各類蛋白的凝膠特性[17]。此外，蛋白的凝膠性受pH值的影響較大[18]。

本研究將GSPI與WPI進(jìn)行復(fù)合，采用不同超聲功率處理并調(diào)控pH值，通過表征復(fù)合蛋白溶液的物化性質(zhì)、蛋白分子行為及所形成熱誘導(dǎo)凝膠的質(zhì)構(gòu)、持水性及微觀結(jié)構(gòu)，探究超聲處理及pH值對復(fù)合凝膠成膠性的影響，以期提升凝膠的質(zhì)地性能和持水性能，為實(shí)際食品工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮白果 徐州淳康生物有限公司；WPI（蛋白相對含量90%） 美國Hilmar公司；正己烷 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；JY92-IIDN型超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer Nano ZS90粒徑電位分析儀 英國Malvern公司；TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro Systems公司；FE28 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；VERTEX 80 V傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR）儀 德國Bruker公司；Prisma E環(huán)境掃描電子顯微鏡 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 GSPI的提取

參照Zhang Weiwei等[19]的方法提取GSPI。將去皮的白果仁置于40 ℃烘箱中干燥72 h，用粉碎機(jī)粉碎后過80 目篩。將白果粉與正己烷按1∶9（m/V）的比例混合，脫脂2 次。采用堿溶酸沉法，將得到的脫脂粉按1∶10（m/V）溶于去離子水中，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至9.0，在室溫下攪拌30 min，然后在10 000×g、4 ℃的條件下離心15 min。用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)離心后的上清液至pH 4.4，在相同條件下離心15 min。將離心后的蛋白沉淀分散于5 倍質(zhì)量的去離子水中，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，冷凍干燥后備用。

1.3.2 GSPI/WPI溶膠的制備

將GSPI和WPI分別溶解在去離子水中，質(zhì)量濃度均為120 g/L，室溫下攪拌4 h，然后置于4 ℃下儲存過夜，確保溶液均勻分散并完全溶解。將過夜儲存的兩種蛋白溶液按體積比1∶1混合（pH 6.7），并在200 r/min下攪拌2 h。將混合溶液分成3 份，用1 mol/L HCl溶液分別調(diào)至pH 4.0、5.0、6.0，繼續(xù)攪拌1 h。將不同pH值的混合溶液分為4 份，共12 份，每份6 mL。將質(zhì)量濃度為120 g/L的GSPI/WPI蛋白溶液轉(zhuǎn)移到內(nèi)徑2.0 cm、高3.5 cm的燒杯中進(jìn)行超聲處理。

1.3.3 超聲處理及GSPI/WPI復(fù)合蛋白凝膠的制備

參照Zhao Ruixuan等[20]的方法，在冰水浴條件下，用直徑為6 mm的探頭浸入溶液中，超聲處理時間為5 min，其中超聲時間5 s、間隔時間5 s。超聲總功率為900 W，設(shè)置輸出功率分別為總功率的25%、45%、65%，未超聲處理的樣品作為對照組（即輸出功率為0 W）。用塑料薄膜將所有樣品密封并在膜上扎孔，置于90 ℃水浴鍋中加熱30 min，將樣品冷卻至室溫后在4 ℃下儲存12 h以形成熱誘導(dǎo)凝膠。測試前，使凝膠樣品于室溫下平衡2 h。

1.3.4 蛋白質(zhì)溶解度測定

參照Wang Yaosong等[21]的方法測定超聲處理后不同pH值條件下的蛋白溶解度。超聲處理后的GSPI/WPI復(fù)合溶膠用相應(yīng)pH值的檸檬酸磷酸鹽緩沖液（citratephosphate buffer，CPB）稀釋至10 mg/mL。在5 000×g、25 ℃條件下離心10 min后，采用雙縮脲試劑測定上清液中的蛋白質(zhì)量濃度。蛋白質(zhì)溶解度以上清液中的蛋白質(zhì)量濃度占初始總蛋白質(zhì)量濃度（10 mg/mL）的比例表示。

1.3.5 蛋白表面疏水性和表面巰基含量測定

參考Shi Ruijie等[22]的方法稍加改動，用1-苯氨基萘-8-磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）作為熒光探針，對超聲處理后GSPI/WPI復(fù)合溶膠的疏水性進(jìn)行測定。將各復(fù)合溶膠樣品分別稀釋至0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL。隨后將20 μL ANS溶液與2 mL稀釋的樣品溶液充分混合，在黑暗中反應(yīng)15 min。使用熒光分光光度計在365 nm激發(fā)波長和484 nm發(fā)射波長下測定熒光強(qiáng)度。表面疏水性用熒光強(qiáng)度和蛋白質(zhì)量濃度之間線性回歸方程的初始斜率表示。

巰基含量的測定參照Beveridge等[23]的方法并進(jìn)行一些修改。超聲處理后的樣品用相同pH值的CPB稀釋到2 mg/mL；取2 mL稀釋液加入50 μL 5,5’-二硫代二硝基苯甲酸鹽（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用，濃度為10 mmol/L），混合均勻后避光反應(yīng)15 min，在412 nm波長處測定樣品溶液的吸光度。巰基含量按下式計算。

式中：A412nm為溶液在412 nm波長處的吸光度；ρ為稀釋后的蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ε為摩爾消光系數(shù)（13 600 L/（mol·cm））。

1.3.6 溶膠粒徑測定

分析前將超聲后的樣品溶液稀釋到2 mg/mL，避免高質(zhì)量濃度引起多重散射。粒徑分布主要基于動態(tài)光散射表征，使用粒徑電位儀測定樣品溶液的粒度，上樣量為1 mL，折射率和吸收參數(shù)分別設(shè)置為1.33和0.1。

1.3.7 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

根據(jù)Laemmli[24]的方法，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析不同pH值條件下超聲功率對GSPI/WPI的影響。將超聲處理后的GSPI/WPI復(fù)合溶液稀釋至2 mg/mL，分別加入等體積的還原劑（體積分?jǐn)?shù)5%β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME））或非還原劑（0.5 mmol/LN-乙基順丁烯二酰亞胺），混合均勻。將混合溶液煮沸3 min，冷卻至室溫備用。SDS-PAGE在5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）濃縮膠和12%分離膠中進(jìn)行，每孔的上樣量均為15 μg。

1.3.8 質(zhì)構(gòu)特性測定

參照He Zhendong等[25]的方法進(jìn)行修改，從燒杯中取出制備的GSPI/WPI復(fù)合凝膠（高1.8 cm、直徑2.0 cm），選擇P/0.5的圓柱形探頭測試凝膠的紋理特性。參數(shù)設(shè)定：實(shí)驗(yàn)前、后速率均為5.0 mm/s，測試速率為2.0 mm/s，壓縮距離為7 mm，觸發(fā)力為5 g，進(jìn)行2 個循環(huán)的壓縮實(shí)驗(yàn)。

1.3.9 持水性測定

參照Wang Yaosong等[26]的方法，將超聲處理后的GSPI/WPI凝膠從燒杯中取出，在3 000×g、20 ℃條件下離心20 min。仔細(xì)排除上清液，記錄凝膠離心前后的質(zhì)量。持水性以離心后剩余凝膠質(zhì)量與離心前樣品初始質(zhì)量的百分比表示。

1.3.10 FTIR測定

分析前，對超聲處理后不同pH值的凝膠樣品進(jìn)行冷凍干燥。取約1 mg干燥后的樣品加入100 mg溴化鉀中，研磨成均勻的粉末并進(jìn)行壓片。用FTIR儀掃描4 000～400 cm－1范圍內(nèi)的FTIR光譜，分辨率設(shè)置為4 cm－1，掃描背景吸收進(jìn)行基線校正。

1.3.11 微觀結(jié)構(gòu)觀察

使用Prisma E環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。將超聲處理后不同pH值的蛋白凝膠從玻璃杯中取出并切片，用雙面膠固定凝膠樣品，對其橫截面進(jìn)行噴金處理。將樣品置于20 kV電子加速電壓的掃描電子顯微鏡下觀察，放大倍數(shù)為10 000 倍，觀察尺度為10 μm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)測定3 次，用最小顯著性差異法進(jìn)行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，使用Statistix 9軟件通過方差分析（ANOVA）對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Sigmaplot 10.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合蛋白的溶解度、表面疏水性、表面巰基含量和粒徑

溶解度是影響蛋白質(zhì)功能特性的一個重要參數(shù)，受到pH值的影響。如圖1A所示，GSPI/WPI樣品在pH 6.0條件下的溶解度整體較高，這是因?yàn)檫h(yuǎn)離白果蛋白等電點(diǎn)（pI 4.4）后，復(fù)合蛋白帶有更多負(fù)電荷，靜電排斥較強(qiáng)，有助于蛋白質(zhì)的溶解；而pH 4.0和pH 5.0更靠近等電點(diǎn)，靜電排斥較弱，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低[27]。經(jīng)過超聲處理后，超聲波產(chǎn)生的空化作用可能會影響蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)分子展開或折疊聚集，但對于GSPI/WPI復(fù)合蛋白的溶解度影響較弱，相同pH值下超聲處理樣品的溶解度沒有顯著差異。

圖1 超聲對不同pH值GSPI/WPI溶解度（A）、表面疏水性（B）、表面巰基含量（C）和粒徑（D）的影響Fig. 1 Effect of ultrasonic treatment on the solubility (A), surface hydrophobicity (B), surface sulfhydryl group content (C) and particle size (D)of GSPI/WPI at different pH levels

表面疏水性與蛋白質(zhì)的構(gòu)象、大小、氨基酸組成和序列以及分子內(nèi)和分子間連接有關(guān)[28]，可用于研究蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的變化。如圖1B所示，GSPI/WPI的表面疏水性隨著pH值的升高而降低。有研究表明，酸性環(huán)境更有利于疏水氨基酸殘基的暴露，從而導(dǎo)致親水基團(tuán)的嵌入[29]。pH值的增加使GSPI/WPI表面帶有更多負(fù)電荷，這可能會引起蛋白質(zhì)的自聚集，從而降低其表面疏水性。超聲處理后的GSPI/WPI疏水性隨著超聲功率的增大而減弱，這可能是因?yàn)槌暿笹SPI和WPI蛋白結(jié)構(gòu)展開并產(chǎn)生新的交聯(lián)，從而使蛋白顆粒重新聚集，進(jìn)而減少了疏水基團(tuán)的暴露。

表面巰基對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性起重要的作用，可通過測定巰基含量研究蛋白的結(jié)構(gòu)變化，在過氧化條件下巰基易形成二硫鍵，從而改善蛋白的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[30]。如圖1C所示，隨著pH值的增加，蛋白的表面巰基含量減少，這可能是因?yàn)殪o電斥力的作用使蛋白結(jié)構(gòu)展開、亞基解聚，蛋白內(nèi)包裹的巰基被氧化為二硫鍵[31]。隨著超聲功率的增強(qiáng)，蛋白的表面巰基含量也隨之增加，這可能是因?yàn)槌曁幚斫档土说鞍椎木奂潭?，超聲波空化效?yīng)沖擊波破壞了GSPI/WPI復(fù)合蛋白聚集體之間的二硫鍵，使其斷裂并形成—SH基團(tuán)[20]。在超聲過程中，蛋白分子的破碎、重排和聚合可能會同時發(fā)生，高強(qiáng)度的超聲環(huán)境可能會產(chǎn)生新的自由基和超氧化物，從而影響表面巰基的含量。

如圖1D所示，在等電點(diǎn)附近，蛋白質(zhì)分子間的靜電作用較弱，更易形成粒徑較大的聚集體。而在pH 6.0時，靜電斥力占主導(dǎo)，疏水作用較弱[32-33]，使蛋白質(zhì)顆粒分散且尺寸較小。隨著超聲功率的升高，GSPI/WPI的粒徑呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢。在較低功率下，超聲波的高剪切力和空化作用破壞了蛋白質(zhì)分子間的聚集，形成粒徑較小的蛋白顆粒[34]。隨著超聲功率的增加，GSPI/WPI的粒徑增大，高功率的超聲可能會加速GSPI/WPI蛋白分子互相碰撞，促進(jìn)蛋白分子間的相互作用，形成分子質(zhì)量較大的聚集體。這與Jiang Lianzhou等[35]的研究中超聲對黑豆分離蛋白粒徑影響的結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)高功率的超聲處理使黑豆分離蛋白聚集體重組，從而導(dǎo)致顆粒尺寸增加。Zhang Tiehua等[36]的研究表明，經(jīng)高功率的超聲處理后，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)乳清蛋白的粒徑明顯增加，這可能是因?yàn)槌暺茐牧讼嚓P(guān)的非共價相互作用。

2.2 復(fù)合蛋白SDS-PAGE分析結(jié)果

如圖2所示，在非還原條件下（不添加β-ME），主要條帶包括GSPI中的G1和G2以及WPI中的β-乳球蛋白和α-乳白蛋白。其中G1和G2條帶蛋白可能分別是銀杏種子中的11S豆蛋白Ginnacin和7S類豌豆球蛋白[36-37]。超聲處理后條帶位置未受影響，條帶強(qiáng)度無明顯變化。在不添加β-ME的條件下，觀察到電泳條帶的頂部出現(xiàn)了高分子質(zhì)量的蛋白聚集體。當(dāng)加入β-ME后，G1和G2條帶蛋白降解，并出現(xiàn)低分子質(zhì)量的多肽，其中G1條帶蛋白分裂成G4和G5條帶蛋白。Ginnacin是一種六聚體蛋白，類似于其他豆科蛋白，每個亞基由一個酸性多肽（G5）和一個堿性多肽（G4）組成，兩者通過二硫鍵形成共價連接。在非還原條件下，Ginnacin在SDS-PAGE中的分子質(zhì)量為49 kDa，而還原后其酸性亞基和堿性亞基分子質(zhì)量分別為約28 kDa和約20 kDa[19]。G2條帶蛋白在還原條件下（添加β-ME）也產(chǎn)生了酸誘導(dǎo)降解，電泳條帶頂部的大分子聚集體消失，可能是二硫鍵被氧化后斷裂，大分子降解成低分子質(zhì)量多肽所致。

圖2 超聲處理及不同pH值條件下GSPI/WPI的SDS-PAGE圖譜Fig. 2 SDS-PAGE patterns of ultrasound-treated GSPI/WPI at different pH levels

2.3 復(fù)合蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性

通過單軸雙壓縮實(shí)驗(yàn)研究不同超聲功率處理下不同pH值GSPI/WPI凝膠的質(zhì)地屬性（包括硬度、彈性、黏聚性、膠黏性、咀嚼性和回復(fù)性）（圖3）。凝膠的硬度是指在第一次壓縮循環(huán)期間測得的最大阻力，pH 4.0條件下的GSPI/WPI凝膠強(qiáng)度明顯弱于pH 5.0、6.0。超聲處理后，不同pH值條件下蛋白凝膠的強(qiáng)度隨超聲功率的增加而增強(qiáng)。超聲功率為65%時，pH 5.0的凝膠硬度從83 g增加到164 g，pH 4.0的凝膠硬度是未超聲組的2.7 倍。凝膠的口感與嚼勁反映了其食品性能，因此與硬度高度相關(guān)。彈性為凝膠在減壓后恢復(fù)其原始形狀的能力。pH 4.0條件下的蛋白凝膠彈性較差，但隨著超聲功率的增加，其彈性明顯增大。黏聚性為凝膠在兩次連續(xù)壓縮期間保持其整體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的能力[38]。GSPI/WPI蛋白凝膠的回復(fù)性和黏聚性也隨超聲功率的增大而呈現(xiàn)增大趨勢。

圖3 超聲對不同pH值條件下GSPI/WPI熱誘導(dǎo)凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic treatment on texture properties of heat-induced GSPI/WPI gel at different pH levels

GSPI/WPI熱誘導(dǎo)凝膠特性受pH值影響的原因是凝膠內(nèi)部網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的改變。有研究表明，WPI在低pH值條件下會形成剛性的細(xì)股網(wǎng)絡(luò)，在高pH值條件下則會形成柔性的彎曲股網(wǎng)絡(luò)[39]。當(dāng)溶液的pH值接近蛋白等電點(diǎn)時，弱的靜電斥力會使其形成顆粒凝膠，與細(xì)鏈凝膠相比，松散的顆粒凝膠間連接較少，形成的凝膠硬度和彈性較差。超聲處理有效提高了GSPI/WPI復(fù)合凝膠的硬度、彈性和咀嚼性。超聲波帶來的空化作用使復(fù)合凝膠形成了更加緊密均勻的凝膠網(wǎng)絡(luò)，暴露的疏水殘基有利于蛋白質(zhì)分子間的相互作用，從而提高了其凝膠強(qiáng)度[40]。Alting等[41]的研究表明，巰基含量在決定葡萄糖酸內(nèi)酯誘導(dǎo)的WPI凝膠強(qiáng)度中起主導(dǎo)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著超聲功率的增大，游離巰基的含量增加，與凝膠強(qiáng)度的變化趨勢相印證。綜上，超聲影響了GSPI/WPI間的分子結(jié)構(gòu)，從而改善了復(fù)合蛋白凝膠的質(zhì)構(gòu)特性。

2.4 復(fù)合蛋白凝膠的持水性

如圖4所示，超聲處理后，不同pH值條件下GSPI/WPI凝膠的持水性差異較大。有研究表明，蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)處形成的顆粒凝膠孔隙較大，截留水的能力較弱，而細(xì)鏈凝膠結(jié)構(gòu)更均勻，所以擁有更好的持水性[42]。隨著超聲功率的增加，GSPI/WPI凝膠的持水性也有所提升，超聲波帶來的空化效應(yīng)使蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生改變。加熱過程中，蛋白質(zhì)的共價鍵與非共價鍵共同作用，形成具有一定三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體系，而超聲引起巰基含量的增加，更有利于蛋白質(zhì)間的相互作用。加熱過程中，游離巰基形成新的二硫鍵，也因此增強(qiáng)了復(fù)合凝膠的硬度[43]。

圖4 超聲對不同pH值條件下GSPI/WPI復(fù)合凝膠持水性的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic treatment on water-holding capacity of GSPI/WPI composite gel at different pH levels

2.5 復(fù)合蛋白凝膠的FTIR分析

如圖5所示，超聲沒有使GSPI/WPI光譜圖引入新的峰，這意味著復(fù)合凝膠中沒有形成新的共價鍵。3 600～3 100 cm－1處有較寬的吸收峰，對應(yīng)羥基—OH鍵和氫鍵的伸縮振動。2 960 cm－1附近的峰反映C—H基團(tuán)的伸縮振動。此外，還可以觀察到1 640、1 530 cm－1和1 230 cm－1處的典型蛋白質(zhì)吸收峰，分別對應(yīng)蛋白質(zhì)的酰胺I帶、酰胺II帶和酰胺III帶[44]，這可以用來表征蛋白質(zhì)中氫鍵的強(qiáng)度和所形成二級結(jié)構(gòu)的類型。經(jīng)過高功率的超聲處理后，—OH伸縮振動的吸收帶向較低的波數(shù)（約3 300 cm－1）轉(zhuǎn)移，這表明超聲使兩種蛋白分子之間的羥基相互作用增強(qiáng)，從而形成氫鍵，與2.3節(jié)復(fù)合凝膠質(zhì)構(gòu)特性的變化相符合，即超聲使凝膠硬度增加。在pH 5.0條件下，相比于沒有經(jīng)過超聲處理的GSPI/WPI復(fù)合凝膠，超聲導(dǎo)致FTIR圖譜中酰胺I帶（1 640 cm－1）強(qiáng)度增大，且向更高的波數(shù)（1 644 cm－1）移動，表明超聲改變了蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使蛋白的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使其交聯(lián)程度提高[45-46]。

圖5 超聲處理及不同pH值條件下GSPI/WPI凝膠的FTIR圖譜Fig. 5 FTIR spectra of GSPI/WPI gel formed with ultrasonic treatment at different pH levels

2.6 復(fù)合蛋白凝膠的微觀結(jié)構(gòu)分析

如圖6所示，通過掃描電子顯微鏡可以觀察超聲處理后不同pH值條件下GSPI/WPI復(fù)合凝膠放大后的微觀結(jié)構(gòu)，從微觀水平上表征蛋白質(zhì)凝膠的形貌。pH 4.0條件下的GSPI/WPI復(fù)合凝膠展現(xiàn)出較為光滑的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這是因?yàn)殪o電斥力的作用促進(jìn)了蛋白質(zhì)的展開。而pH 5.0、6.0條件下GSPI/WPI復(fù)合凝膠更靠近等電點(diǎn)，呈現(xiàn)出明顯的顆粒結(jié)構(gòu)，由粗聚集體球形顆粒組成。超聲處理后，復(fù)合凝膠的蛋白結(jié)構(gòu)因?yàn)槌暡ǖ目栈饔枚归_，因此分布得更加緊密均勻，孔隙更小，這有助于凝膠中蛋白質(zhì)對水分子的捕捉，也解釋了其持水性增加的原因。pH 5.0條件下的復(fù)合凝膠在超聲作用下呈現(xiàn)出明顯的網(wǎng)絡(luò)聚集，蛋白質(zhì)之間的相互作用增強(qiáng)，隨著超聲功率的增加，蛋白質(zhì)形成分子質(zhì)量更大的聚集體，這與超聲后復(fù)合蛋白粒徑增大的現(xiàn)象相印證。

圖6 超聲處理及不同pH值條件下GSPI/WPI凝膠的微觀結(jié)構(gòu)Fig. 6 Microstructure of GSPI/WPI gel formed with ultrasonic treatments at different pH levels

3 結(jié) 論

GSPI/WPI復(fù)合物在超聲處理后蛋白結(jié)構(gòu)及溶膠的物化特性和凝膠性均有較為明顯的變化，這些變化與復(fù)合物的pH值也有一定的關(guān)聯(lián)。在較低的pH值條件下（pH 4.0），超聲處理顯著降低了蛋白疏水性，提高了其表面巰基含量，促進(jìn)了蛋白聚集，在此pH值條件下所形成的凝膠質(zhì)地均勻細(xì)膩且持水性得到顯著提升，但成膠性較差。在較高的pH值條件下（pH 5.0和pH 6.0），超聲處理對蛋白復(fù)合物的溶解度、表面疏水性無顯著影響，但顯著提高了復(fù)合物的表面巰基含量和粒徑，所形成的凝膠質(zhì)地粗糙，但pH 5.0時凝膠具有較好的質(zhì)構(gòu)特性和較高的持水性。GSPI/WPI復(fù)合物的物性（表面巰基含量和粒徑）和凝膠功能性隨著超聲強(qiáng)度的增加而顯著提升。綜上，將超聲處理與pH值調(diào)控結(jié)合可有效調(diào)控復(fù)合蛋白的凝膠特性，本研究可為其功能性的改造提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。