金屬抗菌肽SIF4基于胞內(nèi)生物大分子靶點(diǎn)的大腸桿菌非膜損傷抑菌機(jī)理

李玉珍，肖懷秋,*，劉 淼，王 琳，曾夢(mèng)琪，趙謀明

（1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲 412000；2.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510000）

大腸桿菌（Escherichia coli）是引起食品公共安全事故與食物中毒的主要病原菌，由被污染食品或人際傳播，通過(guò)產(chǎn)生耐藥酶或改變藥物靶點(diǎn)、改變膜通透性、改變外膜孔蛋白結(jié)構(gòu)、構(gòu)建主動(dòng)外排機(jī)制或形成生物膜獲得耐藥性，多重交叉耐藥菌株的出現(xiàn)使食源性致病菌防控變得復(fù)雜[1]。吳萱等[2]從北京市6 個(gè)轄區(qū)大型超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)采集生鮮肉樣本259 份，大腸桿菌檢出率65.25%，分離菌株對(duì)甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲惡唑高度耐藥；李明昊等[3]從山東不同地市41 個(gè)連鎖超市采集豬肉和雞肉樣品201 份，大腸桿菌檢出率100%，雞肉源菌株對(duì)頭孢菌素類(lèi)耐藥率極顯著高于豬肉源菌株（P＜0.01），有48 株菌攜帶blaCTX-M耐藥基因；唐雪林等[4]從烏魯木齊市7 區(qū)19 家超市采集畜禽肉樣品353 份，大腸桿菌檢出率71.39%，其對(duì)四環(huán)素和氨芐西林耐藥性最高，耐藥基因A檢出率高達(dá)90.4%；馬振報(bào)等[5]從廣州市不同區(qū)域零售市場(chǎng)和超市采集畜禽肉樣本323 份，大腸桿菌檢出率74.61%，對(duì)氨芐西林（63.07%）、多西環(huán)素（47.72%）和復(fù)方新諾明（43.15%）耐藥率位列前三。

抗菌肽具有抗菌譜廣、穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒副作用少且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，可多靶點(diǎn)作用于食源性致病菌，是抗生素最具潛力的替代品，特別適用多重耐藥性食源性致病菌生物防控[6]。根據(jù)抗菌肽作用靶點(diǎn)不同，可分為靶向作用于細(xì)胞質(zhì)膜的抗菌肽和非細(xì)胞質(zhì)膜抗菌肽兩類(lèi)[6]。天然抗菌肽（如G1OLO-L2OL2[7]、Arg-Ser-Ser[8]和zp37[9]等）可通過(guò)破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和擾亂其生物功能造成胞內(nèi)容物外泄和菌體凋亡，細(xì)胞質(zhì)膜是主要作用靶點(diǎn)。研究表明，部分抗菌肽并不破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和（或）擾亂細(xì)胞質(zhì)膜功能，而是透過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜并靶向作用于胞內(nèi)細(xì)胞器或生物大分子，如胞內(nèi)核酸、拓?fù)洚悩?gòu)酶、電子傳遞酶、熱休克蛋白、微管蛋白或G蛋白、信號(hào)通路受體蛋白等，或影響基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)調(diào)控以及摧毀細(xì)胞骨架等[10]，如Buforin II可在不破壞細(xì)胞質(zhì)膜前提下特征性與胞內(nèi)DNA結(jié)合[11]；Indolicidin可抑制DNA合成并影響RNA和蛋白質(zhì)合成，還能引發(fā)SOS修復(fù)途徑，引起DNA降解[12]；Linezolid可特征性結(jié)合核糖體50S亞基以抑制蛋白質(zhì)起始復(fù)合物形成[13]；Histatin可與細(xì)胞質(zhì)膜特定受體結(jié)合并誘導(dǎo)胞內(nèi)ATP損失，破壞細(xì)胞周期并導(dǎo)致活性氧簇產(chǎn)生[14]。部分抗菌肽具有細(xì)胞質(zhì)膜/非細(xì)胞質(zhì)膜雙重效應(yīng)靶點(diǎn)，如Indolicidin[15]和β-defensin[16]等。前期研究發(fā)現(xiàn)，金屬抗菌肽（以下簡(jiǎn)稱(chēng)金抗肽）SIF4對(duì)大腸桿菌有較好的抑制活性，并可破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)膜通透性、誘導(dǎo)膜去極化和膜氧化損傷，導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)泄漏[17]，或抑制糖酵解途徑已糖激酶活性從而調(diào)控糖氧化效率[18]，或影響呼吸代謝、削弱細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶活性和抑制胞內(nèi)ATP合成從而抑制菌體呼吸與能量代謝[19]，或破壞菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和改變菌體形貌[20]；綜上，金抗肽SIF4可基于細(xì)胞質(zhì)膜/非細(xì)胞質(zhì)膜對(duì)大腸桿菌實(shí)施抑菌，但基于大腸桿菌胞內(nèi)生物大分子靶點(diǎn)的非細(xì)胞質(zhì)膜抑菌機(jī)理尚不明晰，為揭示SIF4對(duì)大腸桿菌基于胞內(nèi)生物大分子的非細(xì)胞質(zhì)膜損傷機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)對(duì)SIF4作用下胞內(nèi)核酸與蛋白質(zhì)合成抑制情況和SIF4與胞內(nèi)核酸靶點(diǎn)作用情況進(jìn)行分析，以期為將SIF4應(yīng)用于食源性大腸桿菌的生物防控提供理論與實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金抗肽SIF4由本課題組前期研究獲得，對(duì)大腸桿菌ATCC25922的最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）為0.4 mg/L[17]；大腸桿菌ATCC25922 上海保藏生物技術(shù)中心；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；ATP、pBR322DNA、蛋白酶K、溶菌酶、RNase和溴化乙錠（ethidium bromide，EB）上海生工生物工程（上海）股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、NaCl 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外分光光度計(jì)、RF-5301PC熒光分光光度計(jì)日本島津公司；JASCO J-810圓二色光譜儀 日本分光株式會(huì)社；H1850R高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；JY98-IIIDN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝生物有限公司；YXQ-LS-70A立式高壓滅菌鍋上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；瓊脂糖凝膠電泳裝置 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SIF4處理下胞內(nèi)核酸生物合成情況分析

胞內(nèi)核酸生物合成分析參考Li Lirong等[21]的方法并略作修改。離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體并用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.2 mol/L、pH 7.2）洗滌3 次，用LB培養(yǎng)基重懸至1×108CFU/mL，加入SIF4至終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以未添加SIF4為對(duì)照組（0 MIC，下同），37 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h，每4 h取2 mL培養(yǎng)液，4 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用PBS洗滌3 次并重懸，取重懸液9.85 mL加入0.15 mL DAPI染色液（終質(zhì)量濃度為15 μg/mL），避光振蕩培養(yǎng)10 min，測(cè)定DAPI-DNA熒光強(qiáng)度（λex＝364 nm，λem＝460 nm）和DAPI-RNA熒光強(qiáng)度（λex＝400 nm，λem＝460 nm）。

1.3.2 菌體基因組DNA的制備

菌體基因組DNA制備參考李婷等[22]的方法并略作修改。將大腸桿菌接種至LB培養(yǎng)基，于37 ℃、120 r/min條件下培養(yǎng)12 h。取10 mL菌懸液5 000 r/min離心10 min，用TE溶液洗滌菌體2 次，5 000 r/min離心10 min，菌體沉淀重懸于4 mL TE緩沖液。加入8 μL 50 mg/mL溶菌酶并于37 ℃溫育30 min；加入10 μL 10 mg/mL RNase和0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SDS溶液，37 ℃溫育30 min；加入10 μL 20 mg/mL蛋白酶K，37 ℃溫育90 min；加入等體積苯酚-氯仿-異戊醇混合液（25∶24∶1，V/V）混勻，8 000 r/min離心5 min；上清液轉(zhuǎn)入另一支離心管，加入1.8 mL 3 mol/L醋酸鈉、18 mL冰無(wú)水乙醇，12 000 r/min離心2 min，重復(fù)抽提2 次，所獲沉淀即基因組DNA。沉淀用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液洗滌一次，室溫干燥。加入0.5 mL TE緩沖液溶解并測(cè)定OD260nm和OD280nm以評(píng)價(jià)DNA含量和純度，－20 ℃保藏備用。

1.3.3 SIF4與EB競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DNA熒光光譜分析

傳統(tǒng)上，對(duì)于無(wú)線點(diǎn)數(shù)較少，覆蓋范圍不廣的區(qū)域，一般會(huì)采用胖無(wú)線接入點(diǎn)AP(Access Point)，如圖1所示。這種方式需要對(duì)逐臺(tái)設(shè)備進(jìn)行配置和管理，無(wú)法形成一個(gè)整體，無(wú)法實(shí)現(xiàn)無(wú)線網(wǎng)絡(luò)中的漫游服務(wù)功能。這種方式在校園內(nèi)無(wú)線點(diǎn)數(shù)比較密集，用戶移動(dòng)性比較頻繁的情況下，是不適合的。

DNA熒光光譜分析參考陳旋等[23]的方法并略作修改。將1 mL 50 μg/mL基因組DNA與15 μL 100 μg/mL EB溶液混勻，37 ℃避光溫育10 min。加入SIF4至終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以等體積無(wú)菌蒸餾水代替SIF4為對(duì)照組。振蕩混勻，37 ℃避光溫育30 min。用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)反應(yīng)液在550～750 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度（λex＝535 nm，λem＝550 nm）。

1.3.4 紫外吸收光譜分析

紫外吸收光譜分析參考Tang Yali等[24]的方法并略作修改。將50 μg/mL基因組DNA與SIF4混合，使SIF4終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以等體積蒸餾水代替SIF4為對(duì)照組，振蕩混勻，37 ℃孵育30 min，于220～320 nm區(qū)間進(jìn)行紫外掃描。

1.3.5 圓二色光譜分析

圓二色光譜分析參考郝剛等[25]的方法并略作修改。移取100 μL 50 μg/ml基因組DNA與SIF4混合，使SIF4終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2MIC，以未添加抗菌肽的為對(duì)照組，37 ℃溫育10 min，室溫條件下進(jìn)行圓二色光譜掃描（220～320 nm）。

1.3.6 SIF4處理下胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成情況分析

SIF4處理下胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成情況分析參考郭娟等[26]的方法并略作修改。離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌體并用PBS洗滌3 次，用LB培養(yǎng)基重懸至1×108CFU/mL，加入SIF4至終質(zhì)量濃度分別為1/2 MIC、MIC和2 MIC，以未添加SIF4為對(duì)照組，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h，每4 h移取2 mL培養(yǎng)液于4 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用PBS洗滌3 次，用50 μL TE緩沖液和50 μL溶菌酶重懸，37 ℃溫育10 min；取出置冰浴中并加入500 μL冰純水和500 μL預(yù)冷20%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）三氯乙酸溶液，混勻后冰浴10 min，離心棄上清液，加入1 mL預(yù)冷10%三氯乙酸溶液懸浮，離心棄上清液。將沉淀轉(zhuǎn)移至干凈試管并加入500 μL 0.15 mol/L的NaCl和5 mL考馬斯亮藍(lán)染色液，混勻后于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝3），采用SPSS Statistic 25軟件對(duì)平均值進(jìn)行方差分析檢驗(yàn)，僅進(jìn)行組內(nèi)平均值差異多重比較。方差齊性時(shí)采用最小顯著性差異法進(jìn)行事后多重比較，否則采用塔姆黑尼（T2）進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 SIF4對(duì)胞內(nèi)核酸生物合成的影響

圖1 SIF4對(duì)胞內(nèi)核酸生物合成的影響Fig. 1 Effect of SIF4 on intracellular nucleic acid biosynthesis

由圖1可看出，各實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度均低于對(duì)照組，表明經(jīng)SIF4處理后，大腸桿菌胞內(nèi)核酸的生物合成均受到不同程度抑制，熒光強(qiáng)度下降與處理劑量和處理時(shí)間呈正相關(guān)；由圖1A可看出，培養(yǎng)4～16 h時(shí)，1/2 MIC與對(duì)照組熒光強(qiáng)度無(wú)顯著性差異（P＞0.05），繼續(xù)培養(yǎng)則呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）；MIC和2MIC組與對(duì)照組均有顯著性差異（P＜0.05），培養(yǎng)20 h時(shí)，相比對(duì)照組，1/2 MIC、MIC和2 MIC組DAPI-DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度分別下降5.37%、17.43%和47.52%，而培養(yǎng)24 h時(shí)，1/2 MIC、MIC和2 MIC組所形成的DAPI-DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度相比對(duì)照組則分別下降5.96%、20.24%和53.39%，DAPI-DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度明顯下降說(shuō)明SIF4能夠競(jìng)爭(zhēng)DAPI和基因組DNA的結(jié)合位點(diǎn)，即推斷金抗肽SIF4與基因組DNA的結(jié)合方式也為溝槽結(jié)合，且溝槽結(jié)合程度存在劑量效應(yīng)關(guān)系；由圖1B可知，實(shí)驗(yàn)組DAPI-RNA熒光強(qiáng)度與對(duì)照組均有顯著性差異（P＜0.05）。培養(yǎng)20 h時(shí)，相比對(duì)照組，1/2 MIC、MIC和2 MIC組DAPI-RNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度分別下降38.24%、50.04%和52.44%，而培養(yǎng)24 h時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組所形成的DAPI-RNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度相比對(duì)照組則分別下降41.72%、55.79%和57.07%，DAPI-RNA熒光強(qiáng)度顯著降低說(shuō)明金抗肽SIF4可與RNA進(jìn)行結(jié)合。由圖1A和圖1B可看出，金抗肽SIF4對(duì)DAPI-DNA和DAPI-RNA復(fù)合物結(jié)合的抑制趨勢(shì)基本相似，推測(cè)SIF4可能通過(guò)抑制DNA生物合成來(lái)影響RNA轉(zhuǎn)錄生物量[22]，金抗肽SIF4與基因組DNA的結(jié)合方式仍需進(jìn)一步確認(rèn)。

2.2 DNA熒光光譜分析結(jié)果

EB是一種靈敏度高、選擇性強(qiáng)的DNA熒光探針，結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)可嵌入DNA堿基平面的三環(huán)平面基團(tuán)，可通過(guò)靜電吸附與DNA磷酸骨架結(jié)合，或以嵌入方式插入雙鏈DNA堿基平面[21]。當(dāng)抗菌肽與EB競(jìng)爭(zhēng)性共存并結(jié)合DNA時(shí)，EB-DNA體系熒光強(qiáng)度會(huì)減弱，說(shuō)明抗菌肽以類(lèi)似EB嵌插方式與DNA結(jié)合。SIF4與EB競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DNA熒光光譜如圖2所示。

圖2 SIF4與EB競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DNA熒光光譜Fig. 2 Fluorescence spectra of competitive binding of SIF4 and EB to genomic DNA

由圖2可看出，EB-DNA復(fù)合物的特征性熒光吸收峰在590 nm波長(zhǎng)處，隨著SIF4質(zhì)量濃度增加，基因組DNAEB熒光強(qiáng)度存在不同程度衰減，且組間存在顯著性差異（P＜0.05）。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著抗菌肽濃度增加，EB-DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度雖有不同程度衰減，但復(fù)合物發(fā)射峰特征性光譜位置并沒(méi)有發(fā)生明顯紅移或藍(lán)移，說(shuō)明SIF4添加后并未對(duì)EB-DNA體系微環(huán)境造成顯著影響，只是競(jìng)爭(zhēng)性地將EB從基因組DNA堿基平面替換下來(lái)，從而表現(xiàn)為EB-DNA熒光強(qiáng)度衰減。由此可說(shuō)明，SIF4可與基因組DNA以嵌插的方式結(jié)合。此外，SIF4為陽(yáng)離子金屬抗菌肽[27]，結(jié)構(gòu)中正電荷的堿性氨基酸殘基可與DNA酸性磷酸基團(tuán)靜電吸附，C-端的兩親α-螺旋疏水基團(tuán)嵌插至DNA內(nèi)部疏水溝槽中，從而減弱了EB-DNA體系熒光強(qiáng)度[21]。

2.3 SIF4與基因組DNA互作紫外光譜吸收分析結(jié)果

DNA可通過(guò)嵌插結(jié)合、靜電結(jié)合及溝槽結(jié)合的方式與小分子物質(zhì)互作并引起吸收光譜紅（藍(lán)）移或增（減）色效應(yīng)，是小分子物質(zhì)與DNA堿基間π-π體系、偶極-偶極互作及疏水相互作用綜合結(jié)果[28]。DNA由于含有嘌呤和嘧啶等共軛雙鍵芳香堿基及磷酸生色基團(tuán)，在近紫外區(qū)有強(qiáng)的π→π*電子躍遷，在260 nm波長(zhǎng)處呈現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，若抗菌肽以靜電吸附的方式結(jié)合到DNA磷酸骨架，或嵌入到DNA堿基平面，可改變DNA構(gòu)象并產(chǎn)生減色效應(yīng)或紅移現(xiàn)象，而DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)若破壞則會(huì)產(chǎn)生增色效應(yīng)，嵌插作用強(qiáng)弱與減色效應(yīng)呈正相關(guān)[15]。SIF4與基因組DNA結(jié)合紫外光譜如圖3所示。

圖3 SIF4與基因組DNA結(jié)合紫外吸收光譜Fig. 3 UV spectra of SIF4 binding to genomic DNA

由圖3可看出，基因組DNA在約260 nm波長(zhǎng)處有特征性吸收光譜，各實(shí)驗(yàn)組最大吸光度隨SIF4處理劑量的增加而呈遞減趨勢(shì)，說(shuō)明抗菌肽SIF4可與基因組DNA以靜電吸附或嵌插的方式結(jié)合，使DNA分子構(gòu)象發(fā)生改變并引起減色效應(yīng)[15]。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著抗菌肽的加入，SIF4與基因組DNA結(jié)合后最大吸收紫外光譜峰由260 nm藍(lán)移至255 nm左右，藍(lán)移了5 nm，說(shuō)明金抗肽SIF4可能以嵌插方式與基因組DNA結(jié)合[29]。由于SIF4與基因組DNA結(jié)合并未引起增色效應(yīng)，說(shuō)明SIF4與基因組DNA結(jié)合并不會(huì)導(dǎo)致基因組雙螺旋DNA結(jié)構(gòu)斷裂，而是通過(guò)靜電結(jié)合或嵌插至DNA堿基平面引起DNA結(jié)構(gòu)的改變，從而影響基因組DNA的紫外吸收光譜[30]。

2.4 SIF4與基因組DNA結(jié)合方式的圓二色光譜分析

由于脫氧核糖具有不對(duì)稱(chēng)碳原子，其偶極能和堿基不對(duì)稱(chēng)地發(fā)生互作并顯示圓二色性，嘧啶核苷表征正康普頓效應(yīng)（正圓二色光譜），嘌呤核苷表征負(fù)康普頓效應(yīng)（負(fù)圓二色光譜）[31]。小分子物質(zhì)與DNA互作可干擾螺旋度和堿基堆積的DNA結(jié)構(gòu)，DNA圓二色光譜特征峰常位于230～300 nm。當(dāng)DNA發(fā)生變性時(shí)只在約270 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)正峰，240 nm波長(zhǎng)處峰消失；DNA由B構(gòu)型向C構(gòu)型轉(zhuǎn)變時(shí)，雙螺旋結(jié)構(gòu)變得松散，堿基間堆積力變?nèi)?，?fù)峰發(fā)生紅移[31]。SIF4與基因組DNA互作的圓二色光譜如圖4所示。

圖4 SIF4與基因組DNA互作的圓二色光譜Fig. 4 CS spectra of interaction between SIF4 and genomic DNA

由圖4可看出，大腸桿菌基因組DNA呈典型B-DNA結(jié)構(gòu)，270 nm和240 nm波長(zhǎng)處出現(xiàn)特征正峰和負(fù)峰，270 nm波長(zhǎng)處正峰是由堿基堆積力作用形成，240 nm波長(zhǎng)處負(fù)峰是由雙螺旋B型構(gòu)象形成，與右手螺旋有關(guān)[25]。當(dāng)基因組DNA與SIF4結(jié)合后，270 nm波長(zhǎng)處正峰強(qiáng)度明顯降低，說(shuō)明基因組DNA與SIF4結(jié)合后構(gòu)象發(fā)生改變，削弱了堿基間π-π堆積效應(yīng)，抗菌肽還與DNA堿基發(fā)生溝槽結(jié)合，且隨著質(zhì)量濃度增加，溝槽結(jié)合互作效果更明顯，雙螺旋結(jié)構(gòu)變得松散[25]。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，SIF4與基因組DNA結(jié)合后沒(méi)有引起增色效應(yīng)，說(shuō)明SIF4加入只影響DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，并未引起雙螺旋解鏈[25]；此外，各實(shí)驗(yàn)組240 nm波長(zhǎng)處負(fù)峰強(qiáng)度相比對(duì)照組均有一定衰減并發(fā)生輕微紅移（243 nm），可能是DNA結(jié)構(gòu)由B構(gòu)型向C型轉(zhuǎn)變以及DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)疏松導(dǎo)致[25]，從而對(duì)DNA復(fù)制、mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯等產(chǎn)生不同程度的影響。

2.5 SIF4對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成的影響

胞內(nèi)物質(zhì)與能量代謝關(guān)鍵酶、組織蛋白、細(xì)胞質(zhì)膜蛋白及受體蛋白等的主要化學(xué)組成為蛋白質(zhì)，胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成水平關(guān)系著菌體細(xì)胞健康狀態(tài)，監(jiān)測(cè)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成水平可表征菌體生存狀態(tài)。SIF4對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的影響如圖5所示。

圖5 SIF4對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成的影響Fig. 5 Effect of SIF4 on intracellular protein biosynthesis

由圖5可看出，對(duì)照組胞內(nèi)蛋白質(zhì)水平隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加，特別是0～16 h內(nèi)，胞內(nèi)蛋白質(zhì)增幅明顯，表明菌體蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)程正常；由圖5還可看出，在培養(yǎng)4～8 h時(shí)，1/2 MIC和MIC組與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），可能是由于抗菌肽作用于菌體時(shí)間較短，短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損較輕，故對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成影響較少，這與郭娟等[26]的研究結(jié)論基本一致；2 MIC組與對(duì)照組均存在顯著性差異（P＜0.05），培養(yǎng)4、8、12、16、20 h和24 h時(shí)，相比對(duì)照組，2 MIC組胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量分別下降19.43%、11.62%、48.84%、63.89%、65.73%和69.23%，由此可說(shuō)明，SIF4對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的抑制效應(yīng)與處理時(shí)間存在明顯關(guān)系，提示SIF4可能結(jié)合DNA和（或）RNA，在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平抑制蛋白質(zhì)生物合成，本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)，SIF4可破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)并使胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄漏，從而降低胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量[17]。

3 結(jié) 論

DAPI熒光光譜分析結(jié)果表明，SIF4處理后可不同程度地抑制胞內(nèi)核酸生物合成，抑制效果與SIF4處理劑量和處理時(shí)間密切相關(guān)。培養(yǎng)4～16 h，低質(zhì)量濃度（1/2 MIC）SIF4處理對(duì)菌體胞內(nèi)DNA合成影響不顯著（P＞0.05），MIC和2 MIC組與對(duì)照組DNA合成均有顯著差異（P＜0.05），培養(yǎng)24 h時(shí)，1/2 MIC、MIC和2 MIC組DAPI-DNA復(fù)合物熒光強(qiáng)度相比對(duì)照組分別下降5.96%、20.24%和53.39%，表明SIF4存在競(jìng)爭(zhēng)DAPI和基因組DNA的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合方式為溝槽結(jié)合；各實(shí)驗(yàn)組DAPIRNA熒光強(qiáng)度與對(duì)照組均有顯著差異（P＜0.05），表明SIF4可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DAPI-RNA結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)SIF4可能通過(guò)抑制DNA生物合成影響RNA轉(zhuǎn)錄生物量；EB競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合DNA熒光光譜分析結(jié)果表明，隨著SIF4質(zhì)量濃度的增加，基因組DNA-EB熒光強(qiáng)度存在不同程度衰減，且組間存在顯著差異（P＜0.05），基因組DNA-EB復(fù)合物特征光譜位置沒(méi)有發(fā)生明顯位移，說(shuō)明SIF4可以通過(guò)嵌插方式競(jìng)爭(zhēng)性替換EB與基因組DNA結(jié)合[21]；SIF4與基因組DNA互作紫外光譜分析結(jié)果表明，SIF4可與基因組DNA發(fā)生靜電吸附或嵌插結(jié)合，使DNA分子構(gòu)象發(fā)生改變并引起減色效應(yīng)[15,29]。SIF4與基因組DNA結(jié)合未觀察到增色效應(yīng)，說(shuō)明基因組DNA沒(méi)有發(fā)生結(jié)構(gòu)斷裂，SIF4只通過(guò)靜電結(jié)合或嵌插至DNA堿基平面引起DNA結(jié)構(gòu)的改變并影響基因組DNA紫外吸收光譜；圓二色光譜分析結(jié)果表明，基因組DNA與SIF4溝槽結(jié)合后，雙螺旋結(jié)構(gòu)未斷裂，但構(gòu)象發(fā)生改變，堿基間π-π堆積力減弱[25]。240 nm波長(zhǎng)處負(fù)峰不同程度衰減并發(fā)生輕微紅移，提示DNA結(jié)構(gòu)由B構(gòu)型向C型轉(zhuǎn)變，雙螺旋結(jié)構(gòu)變得疏松[25]；短時(shí)間培養(yǎng)（4～8 h），1/2 MIC和MIC組與對(duì)照組胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量差異不顯著（P＞0.05），但2 MIC組與對(duì)照組均存在顯著性差異（P＜0.05）?？傮w來(lái)說(shuō)，SIF4可通過(guò)與基因組DNA進(jìn)行靜電吸附或嵌插結(jié)合進(jìn)入到DNA溝槽，影響DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄生物量以及蛋白質(zhì)翻譯，實(shí)現(xiàn)大腸桿菌非膜損傷抑制。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SIF4可破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞質(zhì)膜通透性與膜生物功能，影響菌體糖代謝、能量代謝及細(xì)胞結(jié)構(gòu)與形貌[17-20]，其可能是通過(guò)破壞菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)后進(jìn)入胞內(nèi)，并影響胞內(nèi)生物大分子結(jié)構(gòu)與功能從而實(shí)現(xiàn)協(xié)同抑菌，抑菌作用是否存在先后尚不清楚，需進(jìn)一步研究確認(rèn)。為更好地全面解析金抗肽SIF4對(duì)大腸桿菌的抑菌機(jī)理，本課題組下一步擬在分子生物學(xué)層面、轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)層面開(kāi)展抑菌機(jī)理的深層次探究，具體包括：1）研究金抗肽SIF4不同作用劑量條件下對(duì)DNA復(fù)制相關(guān)的rnhA、ssb、dnaG、ligB等基因及DNA損傷修復(fù)相關(guān)的recA、recN等基因表達(dá)水平的影響并進(jìn)行基因表達(dá)分析；同時(shí)，采用流式細(xì)胞術(shù)分析金抗肽SIF4對(duì)大腸桿菌細(xì)胞周期的影響；2）采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)RNA-seq技術(shù)研究金抗肽SIF4作用下菌體胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控狀態(tài)和差異基因，篩選重要差異表達(dá)基因，注釋這些差異表達(dá)基因參與的代謝途徑，同時(shí)，結(jié)合菌體代謝途徑驗(yàn)證其基因表達(dá)相關(guān)功能，理清SIF4處理對(duì)菌體代謝相關(guān)基因正/負(fù)調(diào)控機(jī)理；3）采用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)金抗肽SIF4處理后菌體內(nèi)部代謝物種類(lèi)和含量變化規(guī)律進(jìn)行解析，篩選差異代謝物并進(jìn)行通路注釋分析，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果構(gòu)建菌體基因-代謝物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，在代謝組學(xué)層面解析菌體內(nèi)部物質(zhì)變化、流向及調(diào)控規(guī)律。