牛病毒性腹瀉診斷方法研究進(jìn)展

劉育含，李 琦，張 娜，楊裕坤

1.臨江市畜牧總站，吉林臨江 134600；2.臨江市花山鎮(zhèn)綜合服務(wù)中心，吉林臨江 134600；3.臨江市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，吉林臨江 134600

牛病毒性腹瀉（BVD）可引起牛黏膜感染，腹瀉，及母牛流產(chǎn)等癥狀，是一種高度接觸性、自限性的傳染病。牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）是一種主要感染牛、羊、豬等哺乳動(dòng)物的重要傳染性病原體，由于BVDV 在全球廣泛流行，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。因此，BVDV 的準(zhǔn)確診斷對(duì)于該病的防治意義重大。近年來(lái)，BVDV 診斷方法也在不斷發(fā)展和完善，本文對(duì)目前應(yīng)用較廣泛的BVDV 診斷方法進(jìn)行了概述，為牛病毒性腹瀉的診斷和防治提供了理論依據(jù)。

1 BVDV 病原學(xué)特征及流行病學(xué)

BVDV 于1946 年在紐約首次被發(fā)現(xiàn)和分離，自此，BVDV 開(kāi)始在世界各地被發(fā)現(xiàn)。目前，許多國(guó)家的感染情況十分嚴(yán)重，BVDV 血清陽(yáng)性率已達(dá)到50%以上。BVDV 血清陽(yáng)性率在北美國(guó)家為75%～84%，在中東國(guó)家為14% ～15%， 在南美國(guó)家為22.2%～90%，在歐洲國(guó)家為53.27%～18.19%，在亞洲國(guó)家為7%～20.21%，在澳大利亞超過(guò)89%。BTM BVDV Ab 的檢測(cè)還可以確定奶牛群的整體抗體狀態(tài)，可以替代血清學(xué)樣本的檢測(cè)方法，降低流行病學(xué)調(diào)查的成本。例如，愛(ài)爾蘭BTM BVDV 抗體的陽(yáng)性率高達(dá)73%。近年來(lái)的分子流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也證實(shí)了BVDV 在多基因型中的廣泛流行，這給當(dāng)前BVDV 的防控帶來(lái)了困難。亞型的患病率因地區(qū)而異。在美國(guó)，已經(jīng)確定了三種主要亞型（BVDV-1a、1b 和BVDV-2a）。PI 動(dòng)物主要持續(xù)感染BVDV-1b。在波蘭流行的基因型主要有BVDV-1b 和1d 兩種。土耳其和阿根廷具有相同的流行亞型，主要是BVDV-1a，1b 和BVDV-2。在中國(guó)，基因型BVDV-1b、BVDV-1m 和BVDV-1q 最為普遍。然而，以前的大多數(shù)研究都涉及中國(guó)西部的肉牛和牦牛。目前尚無(wú)關(guān)于中國(guó)西部大型奶牛場(chǎng)BVDV 患病率的系統(tǒng)報(bào)告。

BVDV-1 和BVDV-2 這兩個(gè)毒株屬于黃病毒科中的瘟病毒屬，與人類丙型肝炎病毒（HCV）基因組同源。目前，國(guó)際病毒分類委員會(huì)（ICTV）認(rèn)可了4 種已知的瘟病毒物種：豬瘟病毒（CSFV）、邊境病毒（BDV）、BVDV-1 和BVDV-2，是有囊膜的單股正鏈RNA 分子,全長(zhǎng)約12.3 kb，基因組兩端為非編碼區(qū)，僅有一個(gè)開(kāi)放閱讀框，編碼一個(gè)大多聚蛋白，在酶的作用下形成4 種結(jié)構(gòu)蛋白和8 種非結(jié)構(gòu)蛋白。目前對(duì)于BVDV 的研究多集中在非結(jié)構(gòu)蛋白的E2 蛋白編碼區(qū)，因?yàn)镋2 蛋白編碼區(qū)是BVDV 基因組內(nèi)變異性最高的區(qū)域之一，編碼區(qū)的變異會(huì)直接影響到病毒的診斷結(jié)果以及對(duì)應(yīng)編碼區(qū)疫苗的效用，所以要對(duì)其進(jìn)行持續(xù)性研究。

牛病毒性腹瀉是危害養(yǎng)牛業(yè)嚴(yán)重疾病之一，它被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為法定報(bào)告動(dòng)物疾病，在中國(guó)被列為三類動(dòng)物疾病。自1980 年BVDV 首次從中國(guó)分離出來(lái)以來(lái)，大量流行病學(xué)調(diào)查顯示中國(guó)大部分地區(qū)都出現(xiàn)過(guò)BVDV 感染。

持續(xù)感染的牛是病毒傳播的主要來(lái)源，急性感染的牛以及其它反芻動(dòng)物，無(wú)論是急性感染還是持續(xù)感染，都可能傳播病毒。直接接觸的傳播效率最高。不同地區(qū)牛病毒性腹瀉患病率的差異或在以前沒(méi)有BVDV 的畜群中引入病毒通常與特定的流行病學(xué)因素有關(guān)，例如牛群密度，動(dòng)物交易及放牧。根據(jù)感染病毒株的牛群免疫狀態(tài)和致病性，感染BVDV引起的經(jīng)濟(jì)損失程度不同。將感染引入完全易感的牛群會(huì)造成嚴(yán)重的損失，感染高毒力BVDV 毒株會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀和急性感染后的死亡，也造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，控制計(jì)劃的成本效益分析高度依賴于不同情況下新感染的風(fēng)險(xiǎn)以及所涉及的病毒株。

2 診斷方法

2.1 臨床診斷

牛病毒性腹瀉潛伏期為7 ～14 d，牛病毒性腹瀉按臨床表現(xiàn)可分為兩種類型：急性型和慢性型。慢性型病牛會(huì)出現(xiàn)明顯的急性高熱，以及不同程度的黏膜病變，例如：鼻鏡糜爛、口腔糜爛、齒齦發(fā)紅、眼角產(chǎn)生漿液性分泌物。慢性病牛由于蹄葉炎和趾間皮膚糜爛壞死常導(dǎo)致跛行?；疾『? ～6個(gè)月死亡，也存在少數(shù)病例病程超過(guò)一年。妊娠母牛感染BVDV 后，會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)，同時(shí)幼牛犢發(fā)生先天免疫缺陷、小腦發(fā)育不全等，在妊娠后期感染BVDV，還會(huì)導(dǎo)致母牛產(chǎn)下免疫耐受的持續(xù)性感染（Persistently infected，PI）小牛，臨床無(wú)明顯癥狀，但免疫水平低下，且持續(xù)向牛群釋放病毒，成為重要的傳染源，因?yàn)樗鼈兂掷m(xù)、大量地排出BVDV。病毒又可感染多個(gè)器官系統(tǒng)，BVDV 感染也會(huì)影響動(dòng)物的免疫力，使動(dòng)物更容易感染其他疾病，所以牛病毒性腹瀉往往發(fā)生在大型牛群中。由于BVDV 引起的臨床癥狀區(qū)別很大，癥狀范圍可從亞臨床癥狀到高死亡率的急性感染。所以想確診患病牛所感染的病毒種類，還需繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。

2.2 病毒分離

病毒分離培養(yǎng)多用于新病毒出現(xiàn)無(wú)法界定種屬時(shí)以及多病毒共同感染時(shí)，整個(gè)操作過(guò)程對(duì)于實(shí)驗(yàn)室硬件設(shè)施要求較高，實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，病毒分離率較低，一般不用大規(guī)模檢測(cè)?？蓪颖具M(jìn)行抗生素處理后，接種至細(xì)胞、雞胚或動(dòng)物體中，若實(shí)驗(yàn)條件合理，病毒將發(fā)生增殖，增殖后可進(jìn)行病毒的鑒定及病毒感染性的定量測(cè)定。BVDV 在不同的毒株之間有著明顯的遺傳和抗原異質(zhì)性特征，根據(jù)BVDV是否使細(xì)胞病變將其分為致細(xì)胞病變型和非致細(xì)胞病變型。通常情況下，分離牛病毒性腹瀉病毒最常用到的細(xì)胞為MDBK 細(xì)胞，阿根廷學(xué)者A C Odeón 分別 用MDBK、BoTur、BHK-21、RD-420、NCL-1、PKZ等細(xì)胞系進(jìn)行BVDV 病毒的體外擴(kuò)增，評(píng)估細(xì)胞系、收獲時(shí)間和感染方案的效果。發(fā)現(xiàn)MDBK 和BoTur細(xì)胞系易受感染，而B(niǎo)HK-21 和PKZ 則不然，但病毒感染后期會(huì)在MDBK 和NCL-1 中發(fā)生更穩(wěn)定的增殖。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)抗體檢測(cè)（ELISA）

ELISA 方法是當(dāng)下較常用的一種血清學(xué)診斷方法，操作簡(jiǎn)單、特異性好，但是制備相應(yīng)的特異性抗原一直是技術(shù)難點(diǎn)，韓美婧[1]以BVDV 全病毒基因?yàn)槊庖咴晒Y選出抗BVDV 結(jié)構(gòu)蛋白的單克隆抗體，建立ELISA 診斷方法，經(jīng)條件優(yōu)化和驗(yàn)證，該方法可信度高。

2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）

LAMP 是一種對(duì)設(shè)備要求不高，具有簡(jiǎn)單高效、靈敏度強(qiáng)、特異性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)適用等優(yōu)點(diǎn)，在發(fā)展中國(guó)家基層測(cè)試試驗(yàn)中具有良好應(yīng)用前景，更適合實(shí)驗(yàn)條件有限的實(shí)驗(yàn)室使用的核酸擴(kuò)增技術(shù)。趙洋等針對(duì)BVDV 保守區(qū)域BVDV5′UTR 設(shè)計(jì)RT-LAMP 特異性引物，優(yōu)化條件后成功建立BVDV RT-LAMP 檢測(cè)方法，靈敏度為1×102copies/μL。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

PCR檢測(cè)方法是牛病毒性腹瀉檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，多種PCR 方法包括巢式PCR、多重診斷PCR、實(shí)時(shí)PCR 等，都具有良好的穩(wěn)定性以及時(shí)效性，其中實(shí)時(shí)熒光定量PCR 近些年發(fā)展迅速，該診斷方法自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性強(qiáng)，結(jié)果也更加直觀易分析。徐曉琪[2]建立了可區(qū)分牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、赤羽病病毒的多重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)方法，其中牛病毒性腹瀉病毒的最低檢出限為3.5 copies/μL，可用于快速診斷牛繁殖障礙等癥狀的感染病原種類。麻寶藝[3]等建立了可以快速檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒1型和2 型的雙重?zé)晒舛縋CR 檢測(cè)方法。

2.6 微滴氏數(shù)字PCR

數(shù)字PCR 是一種新型核酸定量檢測(cè)方法，通過(guò)制備微滴，將核酸模板包裹至微滴中，每個(gè)微滴內(nèi)核酸模板數(shù)少于或者等于1 個(gè)，再次擴(kuò)增后，每個(gè)包含核算模板的微滴都可以檢測(cè)出熒光信號(hào)，可以做到絕對(duì)定量。王旭東[4]等根據(jù)NCBI 已發(fā)表的BVDV 序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，連接至pUC-T 載體上，制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，再次設(shè)計(jì)引物探針，優(yōu)化條件，最終建立BVDV 檢測(cè)數(shù)字PCR，最低檢出限為1.9 copies/μL。

3 預(yù)防與控制

牛病毒性腹瀉病毒很難在體外環(huán)境長(zhǎng)時(shí)間生存，但在低溫條件下可保持一定的穩(wěn)定性，凍干后真空保存于-60 ～-70 ℃可以存活數(shù)年，在26 ～37 ℃溫度條件下可生存24 h，但基本喪失活性，在56 ℃下數(shù)分鐘內(nèi)就將完全喪失活性[5]。

BVDV 的防控主要取決于幾個(gè)因素，包括對(duì)病毒株和變異株的嚴(yán)格和持續(xù)監(jiān)測(cè)，開(kāi)發(fā)具有高通量檢測(cè)能力的最新診斷方法以及開(kāi)發(fā)同源疫苗。雖然我國(guó)自主研發(fā)的BVDV 疫苗已經(jīng)上市，但都屬于BVDV-1 基因型，因此建議在我國(guó)開(kāi)展BVDV-2 基因型聯(lián)合免疫或開(kāi)發(fā)BVDV-1 和BVDV-2 基因型聯(lián)合疫苗,且病毒性腹瀉的反復(fù)流行說(shuō)明該疾病的受重視程度仍有待提高，若可以聯(lián)動(dòng)政府、行業(yè)、企業(yè)及養(yǎng)殖戶，多方共同努力，加強(qiáng)對(duì)牛病毒性腹瀉的認(rèn)知，制定牛病毒性腹瀉控制計(jì)劃或出臺(tái)行業(yè)規(guī)范，嚴(yán)格的把控預(yù)防、養(yǎng)殖、流通以及患病后處理等多個(gè)環(huán)節(jié)，努力實(shí)現(xiàn)牛病毒性腹瀉的基本控制。