黏多糖貯積癥Ⅲ型基因突變譜及造血干細(xì)胞移植效果分析

劉 軍,劉 芳,喬廣明

(1. 解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八〇醫(yī)院,河北 石家莊 050082;2. 河北中西醫(yī)結(jié)合兒童醫(yī)院,河北 石家莊 050000)

黏多糖貯積癥(mucopolysaccharidoses,MPS)是一類罕見的由遺傳缺陷引起的溶酶體貯積病(lyso-somal storage diseases,LSD),也是造成兒童發(fā)育遲緩、認(rèn)知能力下降等神經(jīng)系統(tǒng)異常遺傳性疾病之一[1]。這些遺傳缺陷導(dǎo)致了參與糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs) 降解的酶缺乏或活性不足,GAGs是長而無分支的多糖,在細(xì)胞黏附和細(xì)胞信號傳導(dǎo)等過程中起作用。未降解的GAGs被認(rèn)為是MPS的主要和直接原因,而GAG的貯積可導(dǎo)致細(xì)胞的二次和三級效應(yīng),如自噬、凋亡和線粒體功能障礙[2],GAGs可積聚在細(xì)胞溶酶體中,導(dǎo)致受累組織功能障礙,引起面部粗糙、認(rèn)知遲緩、肝脾腫大、疝、脊柱后凸、角膜混濁等多器官嚴(yán)重癥狀[3-4]。MPS分為7個亞型,其中MPSⅢ型又稱Sanfilippo綜合征,屬于常染色體隱性遺傳病,發(fā)病率約為1/1 000 000～9/1 000 000活產(chǎn)。在線《人類孟德爾遺傳》數(shù)據(jù)庫中,MPSⅢ型包含A型、B型、C型、D型4個亞型,其特征分別為缺乏硫酸乙酰肝素硫酸酯酶(heparan-N-sulfatase,SGHS)、N-乙酰-α氨基葡萄糖苷酶(α-N-acetyglucosaminidase,NAGLU)、乙酰CoA-氨基葡糖-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(α-glucosaminidase acetyltransferase,HGSNAT)和N-乙酰氨基葡萄糖-6-硫酸酯酶(N-acetylglucosamin-6-sulfatase,GNS),這些酶都參與硫酸乙酰肝素(heparan sulfat,HS)的降解,酶的缺乏會導(dǎo)致HS在溶酶體內(nèi)的貯積[1-5]。MPS是一種進(jìn)展性疾病,診斷需要結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查,酶學(xué)測定是MPS診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[1]。治療MPS的主要方法是酶替代治療(enzyme replacement therapy,ERT)和造血干細(xì)胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)[6-7]。由于ERT治療價格昂貴,臨床上HSCT仍然是醫(yī)生選擇的一種手段[8]。目前對HSCT治療MPSⅡ型效果肯定[7],但是對HSCT治療MPSⅢ型仍存在爭議[5],國內(nèi)鮮見HSCT治療MPSⅢ型報道。本文回顧性分析了5例MPSⅢ型患兒的臨床特征、基因變異類型及HSCT治療效果及預(yù)后,旨在加深臨床醫(yī)師對MPSⅢ型的認(rèn)識。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月—2022年12月在河北中西醫(yī)結(jié)合兒童醫(yī)院血液科就診的5例可疑MPS患兒,其就診目的均希望接受HSCT治療。在就診于河北中西醫(yī)結(jié)合兒童醫(yī)院血液科前,1例曾就診于華西醫(yī)科大學(xué)二院,1例曾就診于西安兒童醫(yī)院,1例曾就診于首都兒研所。5例患兒依據(jù)臨床癥狀、影像學(xué)檢查、血生化檢查、酶活性測定及基因分析進(jìn)行綜合診斷,MPSⅢ型診斷參照Stapleton等[9]報道標(biāo)準(zhǔn)。5例患兒確診后接受了HSCT治療。本研究經(jīng)河北中西醫(yī)結(jié)合兒童醫(yī)院倫理委員會和解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八○醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2023-KY-32)。所有患兒的父母均簽署了臨床檢查及治療書面知情同意書。其中基因分析的判讀解釋由解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八○醫(yī)院完成,HSCT治療由河北中西醫(yī)結(jié)合兒童醫(yī)院完成。

1.2全外顯子測序 在家長知情同意的前提下,采用EDTA抗凝管抽取5例患兒及其父母靜脈血2 mL,1例送康旭檢驗公司,1例送貝瑞基因檢測公司,3例送邁基諾基因檢測公司。上述公司均采用的是全外顯子捕獲技術(shù),建庫后進(jìn)行高通量測序。使用BWA軟件(0.5.9,http://bio-bwa.sourceforge.net/)比對測序序列與GRCh37/hg19人類參考基因組。使用GATK軟件(版本 4.1.7, https://software.broadinstitute.org/gatk/)分析單核苷酸變異、小片段插入及缺失等。 根據(jù)2015年美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)發(fā)布的變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南進(jìn)行致病性評估[10]。

1.3白細(xì)胞SGHS及HGSNAT活性檢測 經(jīng)患兒家長知情同意,5例患兒在河北中西醫(yī)結(jié)合兒童醫(yī)院采靜脈血4 mL,收集到含有EDTA抗凝劑的真空采血管中,將標(biāo)本送至北京中科醫(yī)學(xué)檢驗實驗室。血樣標(biāo)本加入預(yù)處理試劑,通過低滲裂解全血中的紅細(xì)胞,離心分離獲得白細(xì)胞。用考馬斯亮藍(lán)法對標(biāo)本白細(xì)胞蛋白濃度進(jìn)行標(biāo)定,用熒光底物法進(jìn)行SGHS活性及HGSNAT酶活性的測定。樣本加入反應(yīng)體系中37 ℃恒溫水浴中溫育48 h,使用F93熒光分光光度計于Ex=365 nm/Em=444 nm條件下測定特異熒光值。配制4-MU標(biāo)準(zhǔn)液,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,隨標(biāo)本同時測定熒光值。計算酶活性,以nmol/(g·h)為單位來表示酶活性。

1.4HSCT治療 5例患兒均采用了異基因非血緣臍帶血干細(xì)胞移植,臍帶血干細(xì)胞來源于國家衛(wèi)健委批準(zhǔn)的國家臍帶血庫,HLA配型為8/10～9/10相合,預(yù)處理方案BU+CY+ALG+FLU抗人T細(xì)胞豬免疫球蛋白(ALG 武漢中生毓普生物醫(yī)藥有限公司,國藥準(zhǔn)字S10830001)總量100～125 mg/kg,分4 d靜脈滴注,-10 d～-7 d;白消安(Bu 美國DSM pharmaceuticals,Inc,國藥準(zhǔn)字J20040107)0.8～1.2 mg/(kg/次)靜脈滴注,每6 h 1次,共3 d,-8 d～-6 d;氟達(dá)拉濱(Flu重慶萊美藥業(yè)股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H20059418)40 mg/m2靜脈滴注,共5 d,-7 d～-3 d;環(huán)磷酰胺(CY 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H32020857)40 mg/(kg·d)靜脈滴注,共4 d,-6 d～-3 d。預(yù)防GVHD方案為-1 d開始予環(huán)孢素(杭州中美華東制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H10960122)口服,監(jiān)測藥物濃度,谷濃度100～200 ng/mL,嗎替麥考酚酯(MMF上海羅氏制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H20031240)300 mg/(m2/次)口服,每12 h 1次,+1 d～+30 d;甲氨蝶呤(廣東嶺南制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H20054692)15 mg/m2靜脈滴注第1天,10 mg/m2靜脈滴注第3天,第6天。輸注干細(xì)胞數(shù)量(TNC)(4.50～8.70)×107/kg,CD34+(2.49～3.54)×105/kg。HSCT后1個月進(jìn)行外周血嵌合狀態(tài)及白細(xì)胞酶活性檢測,采用短串聯(lián)重復(fù)序列方法監(jiān)測植入狀態(tài),當(dāng)供者細(xì)胞比例≥95%為完全嵌合,酶學(xué)標(biāo)本送檢北京中科醫(yī)學(xué)檢驗實驗室。對5例患兒定期進(jìn)行常規(guī)隨訪,隨訪時間8～27個月,末次隨訪時間為2023年5月30日。

2 結(jié) 果

2.1基本資料 5例可疑MPS患兒中男5例,女0例,所有患兒最初就診醫(yī)院的主訴均包括智力發(fā)育落后。確診年齡3歲11個月～7歲5個月。其中MPSⅢA型4例, 其外周白細(xì)胞SGHS活性為2.2～5.8 nmol/(g·h)[參考:119.6～494.4 nmol/(g·h)];MPSⅢC型1例,外周白細(xì)胞HGSNAT活性為7.1 nmol/(g·h)[參考:276.2～660.5 nmol/(g·h)]。1例患兒臨床表現(xiàn)包括躁動不安、面容粗糙、關(guān)節(jié)僵硬、進(jìn)行性智力低下、語言發(fā)育落后、睡眠障礙;MPSⅢA型4例患兒有聽力受損,部分患兒有反復(fù)呼吸道感染、運動發(fā)育落后、骨骼畸形、肝脾腫大、攻擊行為等。見表1。

2.2基因變異分析 基因檢測顯示MPSⅢA型4例患兒SGSH基因均存在復(fù)合雜合變異,分別為c.863C>T(p.Pro2881Ile)和外顯子1-8雜合缺失、c.703G>A(p.Asp235Asn)和c.1235T>C(p.Leu235Pro)、c.1129G>A(p.Arg377Cys)和c.1063G>T(p.Glu355Lys)、c.703G>A(p.Asp235Asn)和c.97G>A (p. Gly33Arg)。上述變異中的外顯子1-8雜合缺失和c.1235T>C屬于新發(fā)變異,未見文獻(xiàn)報道,其余變異均有相關(guān)文獻(xiàn)報道,根據(jù)ACMG評級,上述8個變異為可能致病性或致病性,見表2。MPSⅢC型1例基因檢測顯示HGSNAT基因存在復(fù)合雜合變異,分別為c.819T>G(p.Asn273Lys)和c.1277G>A (p.Gly426Glu),兩個變異ACMG評級均為致病性變異,其中c.819T>G已有相關(guān)文獻(xiàn)報道,c.1277G>A變異尚未見文獻(xiàn)報道,屬于新發(fā)現(xiàn)的致病性變異,見表2。

表1 5例MPSⅢ型患兒臨床表現(xiàn)

2.3HSCT治療效果及不良反應(yīng) 經(jīng)過臍帶血HSCT治療,5例患兒均獲得順利植入,+30 d查外周血嵌合均到達(dá)完全嵌合,+30 d查外周血白細(xì)胞酶活性均達(dá)到正常水平。隨訪8～27個月,5例患兒目前均存活,智力水平穩(wěn)定,較移植前未見減退。移植后1個月酶值恢復(fù)正常,關(guān)節(jié)僵硬癥狀好轉(zhuǎn);移植后6個月,睡眠情況、躁動情緒、呼吸阻塞、呼吸道感染癥狀好轉(zhuǎn);移植12個月后,酶值穩(wěn)定,身高、生長發(fā)育、骨骼異常等改善。見表3。

3 討 論

MPS分為MPSⅠ型(Hurler綜合征)、MPSⅡ型(Hunter綜合征)、MPSⅢ型(Sanfilippo綜合征)、MPSⅣ型(Morquio綜合征)、MPSⅥ型(Maroteaux-Lamys綜合征)、MPSⅦ型(Sly綜合征)以及MPSⅨ型(Natowicz綜合征)[1]。在亞洲,大多數(shù)MPS患兒屬于MPSⅡ型,1984—2012年中國的一項MPS研究顯示,506例MPS患兒中MPSⅡ型占所有MPS病例的近50%,MPSⅠ型約占13.7%,MPSⅢ型約占7.9%,MPSⅣ型約占24%,MPSⅥ型約占2.6%[16-17]。

MPSⅢ型中4個亞型特征分別為缺乏SGHS、NAGLU、HGSNAT和GNS,編碼上述4種酶的基因分別是SGSH、NAGLU、HGSNAT和GNS[1,5]。由于HS在神經(jīng)元發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[18],因此可以解釋MPSⅢ型患兒的神經(jīng)病理學(xué)。通常MPSⅢ型患兒臨床特征包括進(jìn)行性特發(fā)性發(fā)育遲緩、認(rèn)知能力下降、多動和睡眠障礙,當(dāng)然不同亞型的臨床特征各不相同,且患兒之間存在異質(zhì)性[1,5]。

SGSH位于17q25.3,共14個外顯子,編碼502個氨基酸長度的蛋白質(zhì)-硫酸乙酰肝素硫酸酯酶,該基因的突變是產(chǎn)生MPSⅢA型的病因。根據(jù)人類基因組數(shù)據(jù)庫(HGMD數(shù)據(jù)庫:http://www.hgmd.org),已有161種變異與MPSⅢA型有關(guān),其中錯義突變最多,為106種,移碼突變30種,無義突變13種,大片段缺失4種,剪切位點3種,其他突變5種。本研究的4例MPSⅢA型患兒基因突變以錯義突變?yōu)橹?7個),缺失1個,錯義突變發(fā)生在6,7,8外顯子上,其中c.1235T>C,p.Leu235Pro是首次報道?；颊? SGSH基因的Exon 1-8雜合缺失也是首次報道。

表2 5例MPSⅢ患兒基因突變情況

表3 5例MPSⅢ患兒造血干細(xì)胞移植治療結(jié)果

HGSNAT位于8p11.21-p11.1,共20個外顯子,編碼663個氨基酸長度的蛋白質(zhì)-乙酰CoA-氨基葡糖-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶,該基因的突變是產(chǎn)生MPSⅢC型的病因。根據(jù)HGMD數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.org),已有90種變異與MPSⅢC型有關(guān),其中錯義突變最多為37種,剪切位點16種,無義突變12種,移碼突變11種,大片段缺失8種,同義突變1種。本研究的1例MPSⅢC型患兒HGSNAT基因發(fā)生2個錯義突變(Exon 8和13),其中c.1277G>A,p.Gly426Glu是首次報道。

MPSⅢ患兒常見的初始癥狀包括發(fā)育遲緩、言語遲緩、反復(fù)耳鼻喉感染,以及某些患兒會發(fā)生腹瀉或聽力損失[19]。初始發(fā)育遲緩年齡1～4歲,經(jīng)常伴有反復(fù)發(fā)作的耳部感染。在早期,患兒可能被誤診為特發(fā)性發(fā)育遲緩、注意力缺陷/多動障礙或自閉癥譜系障礙,許多患兒隨后發(fā)展為癲癇發(fā)作障礙。睡眠障礙很常見,會導(dǎo)致睡眠延遲、夜間頻繁醒來和白天睡眠[20]。本研究中5例患兒均有智力、言語發(fā)育遲緩,其中3例患兒曾進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練治療,但均無改善。5例患兒均有不同程度的睡眠障礙,進(jìn)行HSCT 6個月后均有不同程度的改善。

目前MPSⅠ型、MPSⅡ型國內(nèi)外應(yīng)用ERT治療療效已得到肯定,國內(nèi)面臨的問題是價格昂貴,而MPSⅢ型目前仍未有獲批的酶替代藥物,且大分子酶替代藥物難以通過血腦屏障,所以中樞神經(jīng)系統(tǒng)改善更為困難。檢索國內(nèi)文獻(xiàn),未找到HSCT治療MPSⅢ型的報道,國外學(xué)者曾有報道MPSⅢ型患兒HSCT后均未提示神經(jīng)系統(tǒng)癥狀有改善[21],故MPS的國內(nèi)外指南和專家共識中,均未將MPSⅢ型的HSCT納入其中。本研究中5例MPSⅢ型患兒經(jīng)HSCT治療后,患兒智力、語言等神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)定,未出現(xiàn)繼續(xù)減退現(xiàn)象,而睡眠、情緒方面大多已有改善,關(guān)節(jié)僵硬、感染情況改善較明顯。但目前國內(nèi)HSCT病例數(shù)少、隨訪時間短,HSCT用于MPSⅢ型患兒的治療效果有待更大樣本和長時間隨訪獲得。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。