續(xù)筋接骨液對兔肩袖損傷修復(fù)模型腱骨界面PI3K/Akt信號通路的影響

危建文,曹寅生,金久楚,劉 雄,鄒 冕

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué),湖南 長沙 410208;2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007)

肩袖損傷是以肩痛、乏力伴肩關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙為主要表現(xiàn)的肩部疾病,多由勞損、外力等因素造成,常見于中老年人,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1-2]。肩袖損傷多采用保守治療,保守治療失敗后需進(jìn)行手術(shù),以達(dá)到改善肩部功能并緩解疼痛的目的。關(guān)節(jié)鏡下肩袖修補(bǔ)術(shù)是目前治療肩袖損傷最主流的手術(shù)方式[3],但是術(shù)后腱骨結(jié)合部是否完整愈合嚴(yán)重影響治療效果。相關(guān)研究顯示,肩袖修補(bǔ)術(shù)后再撕裂率可達(dá)到20%～30%[4],其原因與腱骨界面結(jié)構(gòu)以及炎癥反應(yīng)有著直接關(guān)系[5]。前期研究表明,續(xù)筋接骨液能增加肩袖修補(bǔ)術(shù)后腱骨組織抗拉強(qiáng)度[6],但其作用機(jī)制仍不明確。PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化等生命活動(dòng)[7],基于此,本課題組研究了續(xù)筋接骨液對兔肩袖損傷修復(fù)術(shù)后腱骨組織中PI3K/Akt信號通路的影響,以探討其促進(jìn)腱骨愈合的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性新西蘭大白兔15只,清潔級,體重2.0～2.5 kg,購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心并飼養(yǎng)于該中心,動(dòng)物許可證號:SCXK(湘)2020-0005,單位許可證號:SYXK(湘)2022-0003。所有兔常規(guī)飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)室室溫21～26 ℃,相對濕度50%～55%,環(huán)境干凈整潔、安靜,單籠飼養(yǎng),自由攝水,保持12 h晝夜輪替。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(ZYFY20220513-01)。

1.2主要藥物及試劑 續(xù)筋接骨液(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑,批號:20220925,規(guī)格:250 mL/瓶);兔p-PI3K抗體(北京博奧森,批號:bs-5570r);兔p-Akt抗體(美國CST,批號:#4060);兔GAPDH抗體(美國proteintech,批號:10494-1-AP);miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀(jì),批號:CW2141)。

1.3主要儀器 搖床、旋渦混合器(中國江蘇其林貝爾,型號分別為TS-1和GL-88B);臺式冷凍離心機(jī)(中國湖南湘儀,型號:H1650R);熒光定量RCP儀、熒光PCR板(美國Thermo公司,型號分別為PIKOREAL96和SPL0960);電泳儀、水平瓊脂糖電泳槽(中國北京六一有限公司,型號分別為DYY-2C和DYCP-31DN);-80 ℃冰箱(中國美菱有限公司,型號:DW-HW438)?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(中國勤翔,型號:ChemiScope6100);生物樣品均質(zhì)儀(中國杭州奧盛,型號:BioPrep-24)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)取5只兔作為空白組,其余兔參考寇景浩等[8]方法建立肩袖損傷修復(fù)模型:戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉兔后,固定于無菌手術(shù)臺,左肩做縱向2 cm切口,逐層分離,暴露岡上肌,縫線標(biāo)記,在大結(jié)節(jié)止點(diǎn)處銳性切斷岡上肌肌腱,用克氏針在肱骨大結(jié)節(jié)制作孔道,絲線通過孔道將切斷的岡上肌肌腱縫合固定大結(jié)節(jié)止點(diǎn)處,逐層關(guān)閉切口。術(shù)后肌注青霉素20萬IU,持續(xù)3 d。將造模兔隨機(jī)分為模型組、續(xù)筋接骨組各5只。續(xù)筋接骨組給予續(xù)筋接骨液56 mg/kg灌胃(參照劑量-體表面積換算方法[9]計(jì)算給藥量,藥物和蒸餾水配置成混懸液,灌胃量為10 mL/kg),空白組、模型組給予等量生理鹽水灌胃,均2次/d,連續(xù)灌胃8周。

1.5檢測指標(biāo)及方法

1.5.1腱骨組織HE染色病理形態(tài) 末次灌胃結(jié)束后,采用空氣栓塞法處死兔,在無菌環(huán)境下暴露兔造模側(cè)肩關(guān)節(jié),取部分下岡上肌及連接的上段肱骨(腱骨組織),予烤片、切片、脫蠟、脫水、蘇木素染色、伊紅染色、梯度酒精脫水、透明封片等處理,采用普通光學(xué)顯微鏡觀察腱骨組織形態(tài)。

1.5.2腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)情況采用Western blot法檢測:取-80 ℃凍存的腱骨組織,剪碎,經(jīng)RIPA裂解液裂解后,4 ℃下12 000 r/min離心15 min,收集上清液。SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,PBST清洗。脫脂奶粉液封閉,室溫靜置90 min,4 ℃過夜,次日室溫靜置30 min。加入p-PI3K、p-Akt一抗(稀釋度均為1∶2 000),4 ℃孵育過夜,再洗膜3次×15 min。加二抗(稀釋度1∶5 000),室溫孵育90 min,洗膜3次×10 min。將膜置入ECL化學(xué)發(fā)光液孵育1 min,再用濾紙吸干,凝膠成像系統(tǒng)成像,用Quantity One 4.6.2軟件進(jìn)行分析,以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

1.5.3腱骨組織中PI3K、Akt mRNA表達(dá)情況 采用RT-qPCR法檢測:取凍存的腱骨組織,經(jīng)Trizol裂解,提取總的RNA。反轉(zhuǎn)錄為cDNA,行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系:cDNA模板2 μL,PrimerR(10 μmol)1 μL,PrimerF(10 μmol)1 μL,ddH2O 11 μL,2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,循環(huán)40次。反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCT法計(jì)算各基因相對表達(dá)量。兔引物序列見表1。

表1 兔引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組兔腱骨組織HE染色病理形態(tài) 空白組兔肌腱-骨連接緊密,肌腱與骨組織之間界限清晰,膠原纖維排列整齊;模型組兔肌腱-骨連接不完全,膠原纖維排列紊亂;續(xù)筋接骨組兔肌腱-骨緊密連接,腱骨界面有大量致密結(jié)締組,并且有新生血管。見圖1。

2.2各組兔腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)情況比較 模型組造模側(cè)腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05),續(xù)筋接骨組造模側(cè)腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖2及表2。

圖1 空白組和肩袖損傷修復(fù)術(shù)后各組兔腱骨界面組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 空白組和肩袖損傷修復(fù)術(shù)后各組兔腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)電泳圖

2.3各組兔腱骨組織中PI3K、Akt mRNA表達(dá)情況比較 模型組造模側(cè)腱骨組織中PI3K、Akt mRNA相對表達(dá)量均明顯高于空白組(P均<0.05),續(xù)筋接骨組造模側(cè)腱骨組織中PI3K、Akt mRNA相對表達(dá)量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表3。

3 討 論

表2 空白組和肩袖損傷修復(fù)術(shù)后各組兔腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)量比較

表3 空白組和肩袖損傷修復(fù)術(shù)后各組兔腱骨組織中PI3K、Akt mRNA相對表達(dá)量比較

肩袖通過肌腱附著于肱骨,其特殊的腱骨界面結(jié)構(gòu)能將應(yīng)力載荷從肌腱轉(zhuǎn)移至骨骼而完成力的傳導(dǎo),減少肌腱勞損[10]。肩袖修復(fù)術(shù)后促進(jìn)腱骨界面愈合是保證手術(shù)效果的重要因素,也是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)。正常腱骨界面由肌腱、未鈣化的纖維軟骨、鈣化纖維軟骨和骨組成[11],結(jié)合腱骨界面特殊結(jié)構(gòu),促進(jìn)其中的軟骨、骨及肌腱的形成,可直接加速腱骨愈合[12]。

PI3K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng)的重要通路,PI3K可以被上游細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)等激活為p-PI3K[13]。p-PI3K可作為第二信使募集Akt,使其被激活為p-Akt,再將信號傳遞至下游效應(yīng)蛋白[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt信號通路可以參與調(diào)控成骨間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)成骨分化遷移[15]和BMSCs肌腱誘導(dǎo)分化[16],可以上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)水平,增加血管數(shù)量[17]。而充足的血運(yùn)可為腱骨界面修復(fù)提供營養(yǎng),同時(shí)也能傳輸炎癥代謝產(chǎn)物。過度的炎癥應(yīng)激導(dǎo)致組織水腫并瘢痕化,影響腱骨結(jié)構(gòu)中軟骨層的長入,破壞其生物力學(xué)機(jī)制[18],而PI3K/Akt信號通路可參與調(diào)控TNF-α、IL-6表達(dá)水平[19]。

中醫(yī)藥目前廣泛應(yīng)用于骨折筋傷疾病。續(xù)筋接骨液為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)驗(yàn)制劑,由丹參、續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、杜仲、自然銅等藥組成,全方共奏活血養(yǎng)血、補(bǔ)益肝腎、接骨續(xù)筋之效。藥理學(xué)研究表明,丹參酮ⅡA[20]、續(xù)斷皂苷Ⅵ[21]能促進(jìn)BMSCs增殖并向成骨細(xì)胞分化;骨碎補(bǔ)不僅能促進(jìn)BMSCs成骨分化,還能抑制破骨細(xì)胞活性,抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[22];杜仲葉提取物可促進(jìn)局部毛細(xì)血管再生,改善微循環(huán)[23]。前期臨床研究證實(shí),續(xù)筋接骨液內(nèi)服能有效緩解肩袖損傷患者疼痛,改善肩關(guān)節(jié)活動(dòng)[24]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組腱骨界面連接不完全,膠原纖維排列紊亂,腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表達(dá)量均明顯升高,說明肩袖損傷術(shù)后PI3K/Akt通路明顯活化;與模型組比較,續(xù)筋接骨組腱骨界面大量結(jié)締組織,連接緊密,膠原纖維排列有序,腱骨組織中p-PI3K、p-Akt蛋白及PI3K、Akt mRNA表達(dá)量均明顯降低,說明續(xù)筋接骨液可以抑制PI3K/Akt通路的活化。

綜上,續(xù)筋接骨液可能通過抑制PI3K/Akt信號通路活化而促進(jìn)兔肩袖損傷修復(fù)術(shù)后腱骨愈合。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。