基于 TGR5/cAMP/PKA信號通路探討疏肝、健脾療法對肝損傷大鼠的作用及機(jī)制

魏偉莉,鄭智禮,鄧秀蘭,高藝寧,史興華,鐘相根

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,北京100029)

肝臟在維持代謝動(dòng)態(tài)平衡,排泄外源性和內(nèi)源性有毒物質(zhì)方面起著關(guān)鍵作用,肝臟損傷可導(dǎo)致肝臟炎癥、肝脂肪變性、肝纖維化等多種病理改變[1-2]。膽汁酸由肝臟中膽固醇合成并進(jìn)入腸道,可調(diào)節(jié)腸道菌群的組成[3],肝損傷時(shí)造成的膽汁酸代謝改變可引起腸道菌群失衡和肝臟炎癥[4]。G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)大家族中的成員,是膽汁酸膜受體,在肝臟枯否細(xì)胞、結(jié)腸中表達(dá)[5-6],并在小鼠肝臟中具有抗炎特性[7],調(diào)節(jié)其表達(dá)可能是治療肝損傷的有效靶點(diǎn)。目前治療肝損傷的西藥有限,中醫(yī)藥的應(yīng)用越來越多。四逆散具有疏肝理脾、透邪解郁的功效[8],可調(diào)節(jié)非酒精性脂肪性肝炎大鼠脂代謝紊亂、改善胰島素抵抗、減輕肝細(xì)胞損傷[9];四逆散加味對大鼠肝纖維化有明顯的預(yù)防和治療作用[10]。六君子湯具有益氣健脾、燥濕化痰的功效,能預(yù)防阿霉素所致的肝細(xì)胞損傷[11],有效預(yù)防抗生素相關(guān)性腸道菌群失調(diào)[12]。但兩種方藥辨治證型有所不同,對肝損傷的保護(hù)作用機(jī)制尚不明確 。本實(shí)驗(yàn)將四逆散作為疏肝方、六君子湯作為健脾方,基于TGR5/環(huán)磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)信號通路探討了疏肝、健脾治療對于肝郁疊加肝損傷大鼠肝臟的作用及機(jī)制,旨在為肝損傷的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只清潔級雄性SD大鼠,體重(180±20)g,由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供,動(dòng)物合格證號:SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)條件:室溫(25±5)℃,相對濕度(55±5)%,采用12 h/12 h明暗光照,自由攝食飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(BUCM-4-2019082602-3073)。

1.2藥物和試劑 雙環(huán)醇片(北京協(xié)和藥廠,國藥準(zhǔn)字H20040467,規(guī)格:25 mg/片);四逆散(柴胡12 g、白芍15 g、枳殼10 g、炙甘草5 g),六君子湯(黨參15 g、茯苓10 g、白術(shù)10 g、炙甘草5 g、法半夏10 g、陳皮10 g、焦神曲10 g、焦山楂10 g、焦麥芽10 g)組方中中藥飲片均購于北京同仁堂醫(yī)藥藥材有限公司,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院李向日教授鑒定,藥物符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)范。藥物煎煮方法:先加藥物組方10倍量純水浸泡2 h,藥物煎煮至沸騰,保持沸騰40 min后過濾藥液,濾渣再加8倍量純水煎煮40 min,過濾,2次煎煮濾液合并后文火濃縮,四逆散、六君子湯含生藥質(zhì)量濃度分別為0.21 g/mL和0.45 g/mL,4 ℃保存?zhèn)溆?。四氯化?CCl4,上海滬試化工有限公司,批號:20180129);肝功能生化指標(biāo)檢測試劑原廠配套試劑(BECKMAN COULTER,USA);RNA提取液、Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix(None ROX)(Servicebio,G3013、G3330、G3320);兔抗TGR5多克隆抗體(Abcam,ab72608);AB-PAS染液(Servicebio,G1049)。

1.3儀器 石蠟切片機(jī)(Leica,RM2245);組織包埋機(jī)(Leica,EG1150H);脫水機(jī)(DIAPATH,Donatello);烤箱(上?；厶﹥x器制造有限公司,DHG-9140A);光學(xué)顯微鏡(Olympus,BX5);熒光定量PCR儀(Bio-rad,CFX96);超微量分光光度計(jì)(Thermo,NanoDrop2000);全自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter,CX4Pro);臺式高速冷凍型微量離心機(jī)(DragonLab,D3024R)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、雙環(huán)醇組、四逆散組、六君子湯組,每組6只。正常組大鼠不進(jìn)行造模,其余組大鼠采用束縛疊加CCl4橄欖油溶液皮下注射的方法制備肝郁疊加肝損傷模型。慢性束縛方式[13]:將大鼠放于特制的束縛筒內(nèi),根據(jù)大鼠體重,通過擰動(dòng)螺絲固定束縛筒前端的筒塞及調(diào)節(jié)束縛筒后端的插片進(jìn)行相應(yīng)的活動(dòng)空間調(diào)整,空間大小以大鼠無強(qiáng)烈反抗動(dòng)作為準(zhǔn)。每天開始束縛的時(shí)間隨機(jī),持續(xù)束縛的時(shí)間從開始的4 h/d逐漸增加到6 h/d,1次/d,連續(xù)束縛42 d,束縛期間大鼠禁食并禁水。造模期間,各組大鼠均給予新鮮配制的40% CCl4橄欖油溶液5.89 g/kg皮下注射[14],正常組大鼠皮下注射等容量橄欖油溶液,均1次/3 d;同時(shí)雙環(huán)醇組給予雙環(huán)醇0.2 g/kg灌胃(1次/d),四逆散組、六君子湯組分別給予四逆散4.32 g/kg、六君子湯9.26 g/kg灌胃(中藥給藥劑量參照普通成人體重60 kg的臨床用量、大鼠與人的等效劑量換算及本課題組實(shí)驗(yàn)研究而定[15-16],均1次/d),正常組與模型組大鼠給予等體積去離子水灌胃(1次/d),均持續(xù)42 d。以血清ALT、AST、ALP水平明顯升高為大鼠肝損傷造模成功。

1.5觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1肝功能生化指標(biāo) 末次灌胃結(jié)束后,麻醉各組大鼠,腹主動(dòng)脈取血 ,使用全自動(dòng)生化分析儀測定血清ALP、ALT、AST、TBil、DBil水平。

1.5.2肝臟組織中TNF-α、IL-6、cAMP、PKA mRNA表達(dá)情況 采用RT-PCR法檢測:取大鼠肝臟組織,將組織充分研磨后取上清液,提取總RNA,使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,加入Total RNA 10 μL作為模板,反轉(zhuǎn)錄程序設(shè)置條件為25 ℃ 5 min,42 ℃ 30 min;結(jié)束后85 ℃保溫5 s滅活反轉(zhuǎn)錄酶,然后進(jìn)行定量PCR,PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性15 s,60 ℃延伸30 s,共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。熔解曲線為65 ℃ 95 ℃,每升溫0.5 ℃采集1次熒光信號。用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作內(nèi)參,通過2-ΔΔCT法計(jì)算肝臟組織中TNF-α、IL-6、cAMP、PKA mRNA相對表達(dá)量。各引物由武漢賽維爾生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成,引物序列見表1。

1.5.3肝臟、結(jié)腸組織中TGR5陽性表達(dá)情況 采用免疫組化法檢測:取出4%甲醛固定好的肝臟、結(jié)腸組織并進(jìn)行切片,將切片依次放入脫蠟液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,每次15 min;濃度梯度乙醇浸泡,每次5 min;將切片放于抗原修復(fù)液并在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù);使用3 %雙氧水進(jìn)行封閉;在組織上均勻滴加3 % BSA,室溫30 min;加一抗,50 μL/片,4 ℃濕盒內(nèi)孵育過夜;加入二抗,50 μL/片,37 ℃室溫孵育50 min;再進(jìn)行DAB顯色、復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片等處理。顯微鏡下每張切片隨機(jī)取6個(gè)視野,在放大相同倍數(shù)(×400)條件下進(jìn)行觀察,以出現(xiàn)棕褐色為TGR5陽性表達(dá),然后采集圖像,用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析,計(jì)算平均光密度值(陽性細(xì)胞染色的累積光密度與區(qū)域面積比值) 。

表1 TNF-α、IL-6、cAMP、PKA mRNA檢測引物序列

1.5.4結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量 采用 AB-PAS法檢測:將4%甲醛固定好的結(jié)腸組織進(jìn)行切片,按照AB-PAS染液試劑說明嚴(yán)格進(jìn)行染色操作。每張切片隨機(jī)取6個(gè)視野進(jìn)行觀察,以杯狀細(xì)胞藍(lán)染為陽性表達(dá),用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行定量分析,記錄每張切片視野下出現(xiàn)的陽性細(xì)胞數(shù)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肝功能生化指標(biāo)比較 模型組大鼠血清ALP、ALT、AST、TBil、DBil水平均明顯高于正常組(P均<0.05)。雙環(huán)醇組、四逆散組血清ALP、ALT、AST、TBil、DBil水平及六君子湯組ALP、ALT、TBil、DBil水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。四逆散組ALP水平明顯低于雙環(huán)醇組、六君子湯組(P均<0.05),雙環(huán)醇組DBil水平明顯低于四逆散組、六君子湯組(P均<0.05)。見表2。

表2 正常組和肝郁疊加肝損傷各組大鼠血清ALP、ALT、AST、TBil、DBil水平比較

2.2各組大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-6 mRNA相對表達(dá)量比較 與正常組比較,模型組大鼠IL-6 mRNA相對表達(dá)量明顯升高(P<0.05),cAMP、PKA mRNA相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05)。與模型組比較,雙環(huán)醇組、四逆散組TNF-α、IL-6 mRNA相對表達(dá)量均明顯降低(P均<0.05),四逆散組cAMP、PKA mRNA相對表達(dá)量和雙環(huán)醇組PKA mRNA相對表達(dá)量、六君子湯組cAMP mRNA相對表達(dá)量均明顯升高(P均<0.05);且四逆散組TNF-α、IL-6 mRNA相對表達(dá)量均明顯低于六君子湯組(P均<0.05),PKA mRNA相對表達(dá)量明顯高于六君子湯組(P<0.05);四逆散組各指標(biāo)與雙環(huán)醇組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表3 正常組和肝郁疊加肝損傷各組大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-6、cAMP、 PKA mRNA相對表達(dá)量比較

2.3各組大鼠肝臟、結(jié)腸組織中TGR5陽性表達(dá)情況比較 與正常組比較,模型組大鼠肝臟組織中TGR5陽性表達(dá)平均光密度值明顯降低(P<0.05),結(jié)腸組織中TGR5陽性表達(dá)平均光密度值明顯升高(P<0.05);與模型組比較,雙環(huán)醇組、四逆散組、六君子湯組肝臟組織中TGR5陽性表達(dá)平均光密度值均明顯升高(P均<0.05),雙環(huán)醇組、四逆散組、六君子湯組結(jié)腸組織中TGR5陽性表達(dá)平均光密度值均明顯降低(P均<0.05);各藥物組間肝臟、結(jié)腸組織中TGR5陽性表達(dá)平均光密度值比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖1、圖2及表4。

2.4各組大鼠結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量比較 正常組和模型組杯狀細(xì)胞數(shù)量分別為(83.67±10.60)個(gè)/視野和(53.67±14.05)個(gè)/視野,模型組杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常組(P<0.05);雙環(huán)醇組、四逆散組、六君子湯組杯狀細(xì)胞數(shù)量分別為(82.50±12.82)個(gè)/視野、(76.50±5.01)個(gè)/視野、(84.33±5.57)個(gè)/視野,各藥物組杯狀細(xì)胞數(shù)量均明顯多于模型組(P均<0.05);各藥物組間杯狀細(xì)胞數(shù)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3。

圖1 正常組和肝郁疊加肝損傷各組大鼠肝臟組織中TGR5陽性表達(dá)情況(免疫組化染色)

圖2 正常組和肝郁疊加肝損傷各組大鼠結(jié)腸組織中TGR5陽性表達(dá)情況

表4 正常組和肝郁疊加肝損傷各組大鼠肝臟、結(jié)腸組織中TGR5陽性表達(dá)平均光密度值比較

3 討 論

肝損傷時(shí)腸黏膜屏障被破壞,腸道通透性增加,腸道菌群失調(diào)和細(xì)菌過度生長,隨之而來的細(xì)菌易位使細(xì)菌及其產(chǎn)物從胃腸道經(jīng)門靜脈循環(huán)和淋巴系統(tǒng)進(jìn)入肝臟,加重肝損傷[17-20]。另外,肝臟枯否細(xì)胞產(chǎn)生過量的TNF-α和其他促炎介質(zhì),引發(fā)肝臟炎癥[21]。杯狀細(xì)胞位于腸上皮內(nèi),是胃腸道重要的分泌細(xì)胞,杯狀細(xì)胞的產(chǎn)物之一是黏蛋白,黏蛋白能形成一種覆蓋在上皮表面的生物凝膠,對維持腸道屏障至關(guān)重要[22]。本實(shí)驗(yàn)以束縛疊加CCl4制造肝郁疊加肝損傷病證結(jié)合動(dòng)物模型,結(jié)果顯示模型組大鼠血清ALP、ALT、AST、TBil、DBil水平及肝組織中IL-6 mRNA相對表達(dá)量均明顯升高,腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少,表明大鼠肝功能和腸道受損;雙環(huán)醇、四逆散、六君子湯灌胃均能在一定程度上改善肝功能和增加腸組織中杯狀細(xì)胞數(shù)量,雙環(huán)醇和四逆散灌胃能下調(diào)肝組織中IL-6、TNF-α mRNA表達(dá),六君子湯灌胃對TNF-α、IL-6表達(dá)無明顯影響但杯狀細(xì)胞數(shù)量略多于四逆散灌胃,提示四逆散疏肝治療更有利于減輕肝臟炎癥,六君子湯健脾治療有利于腸道功能的改善。

肝的生理功能包含了排泄膽汁、分泌膽汁,膽汁參與食物和水液的消化與吸收。TGR5是膽汁酸膜受體,TGR5被激活后,隨即釋放Gαs亞基并激活cAMP,細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加進(jìn)而激活PKA,PKA使cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化,抑制巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞中核因子-κB的激活,進(jìn)而減少IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的釋放及各種黏附分子如E-選擇素、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá),減輕炎癥反應(yīng)[23-29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組大鼠肝臟組織中TGR5陽性表達(dá)及cAMP、PKA mRNA表達(dá)減少,結(jié)腸組織中TGR5陽性表達(dá)增加;與模型組比較,四逆散組肝臟組織中TGR5陽性表達(dá)及cAMP、PKA mRNA表達(dá)增加,結(jié)腸組織中TGR5陽性表達(dá)減少;六君子湯組肝臟組織中TGR5陽性表達(dá)及cAMP mRNA表達(dá)增加,結(jié)腸組織中TGR5陽性表達(dá)減少,但肝臟組織中PKA mRNA表達(dá)無明顯變化。結(jié)合先前研究六君子湯可上調(diào)肝郁疊加肝損傷大鼠腸黏膜緊密連接蛋白表達(dá)[20],肝臟免疫應(yīng)答對從消化道流入的許多抗原具有耐受性,這種耐受性使肝臟不像其他器官那樣容易發(fā)生排斥反應(yīng)[30],故推測六君子湯健脾治療可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群、減少細(xì)菌易位而發(fā)揮間接作用 ;四逆散疏肝治療能激活TGR5/cAMP/PKA信號通路,增加肝臟TGR5含量,激活TGR5導(dǎo)致細(xì)胞中cAMP水平升高,cAMP水平升高進(jìn)一步激活PKA,PKA磷酸化下游效應(yīng)元件結(jié)合因子(CREB-P),被激活的CREB-P可結(jié)合至特定位點(diǎn),調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá),減少肝臟炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá),從而減輕肝損傷。

綜上所述,在肝郁疊加肝損傷狀態(tài)下,六君子湯健脾治療通過維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境從而防止肝損傷進(jìn)一步發(fā)展;四逆散疏肝治療對于維護(hù)腸道屏障功能是有利的,其減輕肝臟炎癥作用優(yōu)于六君子湯健脾治療,其作用機(jī)制可能與TGR5/cAMP/PKA信號通路的激活有關(guān)。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。