燕麥SCoT分子標(biāo)記體系的優(yōu)化及引物篩選

李 進(jìn)，陳仕勇

(1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；3.四川省抗逆牧草種質(zhì)創(chuàng)新及生態(tài)修復(fù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

【研究意義】燕麥(AvenasativaL.)是世界各地廣泛種植的一種重要的一年生糧飼兼用作物，具有抗旱、耐冷、耐瘠薄等優(yōu)良性狀和較高的營養(yǎng)及保健價(jià)值[1]。燕麥主要分布在北半球的溫帶地區(qū)，國內(nèi)主要種植省區(qū)為河北、內(nèi)蒙古、山西，其次是甘肅、寧夏、陜西、青海及四川等，特別在我國青藏高原地區(qū)是冬春重要的飼草來源[2]。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性(start codon targeted polymorphism, SCoT)分子標(biāo)記是一種針對(duì)ATG起始密碼子及側(cè)翼序列保守性開發(fā)的新型目的基因分子標(biāo)記，該技術(shù)較其他分子標(biāo)記具備操作簡便、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定性好和成本低等優(yōu)勢。通過優(yōu)化建立燕麥SCoT-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系，為SCoT分子標(biāo)記技術(shù)在燕麥中的應(yīng)用以及燕麥品種的保護(hù)、新品種的選育等提供重要的工具?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)對(duì)于燕麥的研究主要集中在高產(chǎn)栽培管理技術(shù)研究、抗性生理研究[3]、遺傳育種研究[4-5]等。目前，隨著分子遺傳標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，已有多種分子標(biāo)記技術(shù)在燕麥種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及育種中應(yīng)用。如基于內(nèi)部簡單重復(fù)序列(ISSR)[6]、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA 標(biāo)記(RAPD)[7]、相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記(SRAP)[8]等分子標(biāo)記技術(shù)揭示了燕麥種質(zhì)資源間的遺傳變異，但不同的分子標(biāo)記手段都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)并能達(dá)到互補(bǔ)的作用[9]。自Collard和Mackill[10]開發(fā)了SCoT分子標(biāo)記以來，已有多種植物的 SCoT-PCR反應(yīng)體系被建立或優(yōu)化[11]。目前已在牧草和飼用作物上得到了較好的應(yīng)用，如紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、鴨茅(DactylisglomerateL.)等[12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前燕麥種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)和育種落后于其他栽培作物，特別是關(guān)于種質(zhì)的評(píng)價(jià)和精準(zhǔn)鑒定等方面，因此開展不同類型的分子標(biāo)記在燕麥種質(zhì)資源研究中非常有必要。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法對(duì)SCoT-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并篩選了80條SCoT引物在供試燕麥中進(jìn)行多態(tài)性篩選和退火溫度的確定?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立燕麥SCoT-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系，篩選出在不同燕麥品種中擴(kuò)增多態(tài)性較好的引物，并確定其最佳的退火溫度，為燕麥SCoT分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用提供重要的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選用青引1號(hào)、青引2號(hào)、蘇聯(lián)燕麥、青燕1號(hào)4個(gè)品種進(jìn)行PCR體系優(yōu)化和引物篩選，本研究中的供試材料種子均來自四川省抗逆牧草種質(zhì)創(chuàng)新及生態(tài)修復(fù)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 將供試燕麥種子于花盆中播種，待燕麥幼苗長出后，隨機(jī)采集每個(gè)品種不少于20株的鮮嫩葉片混合，采用試劑盒DP305(北京天根)提取DNA，用Nanodrop測定其DNA濃度和純度，并用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，模板DNA保存在-30 ℃的冰箱冷凍備用。

1.2.2 SCoT-PCR退火溫度的確定與目標(biāo)引物的篩選 本研究引物選用Collard和Mackill[10](SCoT1～SCoT36) 及Luo等[13](SCoT37～SCoT80)開發(fā)的SCoT引物，引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在BIO-RAD T100 Termal Cycler PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min；退火1 min(設(shè)置8個(gè)退火溫度梯度分別為54、53.5、52.8、51.7、50.3、49.1、48.4、48 ℃)；72 ℃延伸1.5 min；共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；最后置于4 ℃冰箱冷藏備用。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后采用 1.3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，拍照保存并分析各個(gè)引物擴(kuò)增效果。

1.2.3 SCoT-PCR的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在引物退火溫度篩選的基礎(chǔ)上，隨機(jī)選取引物用于確定適宜的2×EsTaqMaster Mix(北京康為世紀(jì)生物)、DNA模板與引物的用量，反應(yīng)中各個(gè)因素水平如表1所示，L9(33)正交設(shè)計(jì)具體信息如表2所示，試驗(yàn)所用樣本DNA濃度為10 ng·μl-1，引物濃度為10 μmol·μl-1。

表1 燕麥SCoT-PCR反應(yīng)體系各因素水平

表2 PCR反應(yīng)因素水平的L9(33)正交設(shè)計(jì)方案

1.2.4 SCoT-PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系總體積為20 μl，不足部分用ddH2O補(bǔ)足，將反應(yīng)產(chǎn)物在1.3 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測，選用D2000作為電泳Marker。對(duì)各體系擴(kuò)增效果進(jìn)行對(duì)比，以選取最佳反應(yīng)體系。

1.2.5 反應(yīng)體系的驗(yàn)證 以四川省抗逆牧草種質(zhì)創(chuàng)新及生態(tài)修復(fù)實(shí)驗(yàn)室栽培的其他12個(gè)品種燕麥DNA為模板(隴燕3號(hào)、隴燕4號(hào)、隴燕5號(hào)、燕王、駿馬、牧王、鋒利、邊鋒、牧樂思、領(lǐng)袖、夢龍、莫妮卡)，隨機(jī)選取能擴(kuò)增出清晰可辨且完整條帶的引物驗(yàn)證反應(yīng)體系的可靠性及退火溫度的準(zhǔn)確性，并用1.3 %瓊脂糖凝膠電泳檢測試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 退火溫度篩選

引物退火溫度是影響PCR反應(yīng)的重要因素，在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上本試驗(yàn)確定了在48～54 ℃退火溫度范圍進(jìn)行最佳溫度的篩選。在不同退火溫度條件下，引物的擴(kuò)增效果存在一定的差異(圖1)，主要表現(xiàn)在條帶數(shù)量、亮度及清晰程度等方面。這也說明有必要對(duì)篩選的引物進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化。SCoT57引物的退火溫度篩選中，當(dāng)退火溫度設(shè)置為51.7 ℃時(shí)，擴(kuò)增條帶清晰且完整，而退火溫度小于或大于51.7 ℃時(shí)擴(kuò)增出來的條帶不夠清晰和完整。

2.2 引物篩選

本試驗(yàn)選用4個(gè)供試燕麥品種對(duì)80條SCoT引物的擴(kuò)增效果及多態(tài)性進(jìn)行了篩選和評(píng)價(jià)。其中65條引物能擴(kuò)增出清晰可辨且完整的條帶，占供試引物的81.25 %，每條引物擴(kuò)增條帶數(shù)為2～14條，其中36條引物能擴(kuò)增出清晰且豐富的多態(tài)性條帶(表3)，占供試引物的45 %。

表3 SCoT引物序列

續(xù)表3 Continued table 3

2.3 燕麥SCoT反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)分析

不同正交組合處理的擴(kuò)增效果存在差異(圖2)，如主帶的亮度、擴(kuò)增條帶的清晰程度等。處理5的擴(kuò)增條帶數(shù)量和清晰程度等最佳，同時(shí)結(jié)合試劑用量等因素，確定最優(yōu)的反應(yīng)體系：2 μl模板DNA(10 ng·μl-1)、2 μl引物(10 μmol·L-1)、9 μl Mix混合液和7 μl ddH2O。

2.4 反應(yīng)體系穩(wěn)定性的驗(yàn)證

應(yīng)用優(yōu)化后的燕麥SCoT-PCR反應(yīng)體系，選取引物SCoT48對(duì)實(shí)驗(yàn)室的其他12個(gè)燕麥品種DNA進(jìn)行擴(kuò)增，不同燕麥品種擴(kuò)增產(chǎn)物均清晰穩(wěn)定(圖3)，體現(xiàn)出了品種之間的差異，表明該體系能夠進(jìn)行穩(wěn)定的PCR擴(kuò)增，適合用于不同燕麥品種的SCoT-PCR分析及燕麥屬飼用植物的研究。

3 討 論

SCoT標(biāo)記是一種基于翻譯起始位點(diǎn)的目標(biāo)分子標(biāo)記新技術(shù)，具有操作簡單、引物通用性高、多態(tài)性高、成本低且重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[14]。其與較多的基因形成了較多的引物結(jié)合位點(diǎn)，且其擴(kuò)增的不確定性介于外顯子與內(nèi)含子之間，大幅度提升了該引物的多態(tài)性[15]。與其它分子標(biāo)記手段相比，SCoT標(biāo)記技術(shù)與供試材料的功能基因相關(guān)，更能反應(yīng)相關(guān)功能性狀的多態(tài)性[16]，是適用于農(nóng)作物、水果和牧草等植物種質(zhì)資源鑒定、保護(hù)和利用、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種、基因定位和克隆等研究的非常有效的一種分子標(biāo)記[17]。本研究首次將SCoT分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于燕麥，通過本研究最終得到燕麥SCoT-PCR反應(yīng)的最佳體系，且在其他燕麥品種中進(jìn)行了驗(yàn)證，最終均能獲得清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，為今后SCoT分子標(biāo)記技術(shù)在燕麥上的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

準(zhǔn)確應(yīng)用SCoT分子標(biāo)記技術(shù)的前提是首先要建立一個(gè)高效、穩(wěn)定的SCoT-PCR反應(yīng)體系。SCoT-PCR反應(yīng)受多個(gè)因素的影響。退火溫度是PCR擴(kuò)增程序中的重要影響因素，本試驗(yàn)中各引物退火溫度有較大區(qū)別主要集中在51.7～53.5 ℃，這與之前研究所用的退火溫度不同。如韓國輝等[13]優(yōu)化了柑橘SCoT分子標(biāo)記適宜的退火溫度，所有引物退火溫度均為49 ℃；李強(qiáng)等[18]優(yōu)化了大豆SCoT分子標(biāo)記適宜的退火溫度，引物最佳退火溫度為50.4 ℃。導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因可能是由于不同研究所用的試驗(yàn)材料及反應(yīng)條件不一致，同時(shí)也驗(yàn)證了袁王俊等[19]的觀點(diǎn)，表明不同的反應(yīng)條件與材料導(dǎo)致退火溫度不一致。因此，進(jìn)行退火溫度的優(yōu)化可確保分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性和擴(kuò)增條帶的特異性，達(dá)到理想的擴(kuò)增效果。目前PCR主要采用是Mix反應(yīng)混合液，其將PCR主要成分TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs預(yù)先進(jìn)行混合，并加入穩(wěn)定劑等成分使得PCR操作簡便和穩(wěn)定。本研究中采用2×TaqMaster Mix，在篩選多態(tài)性引物的同時(shí)進(jìn)行各個(gè)引物退火溫度的確定，共設(shè)置了8個(gè)梯度與4個(gè)重復(fù)，以此來確保各引物最佳退火溫度的準(zhǔn)確性，使復(fù)雜的試驗(yàn)流程簡單化，易于操作。

4 結(jié) 論

在燕麥SCoT-PCR反應(yīng)體系(20 μl)中，最優(yōu)的組合為2 μl模板DNA(10 ng·μl-1)、2 μl引物(10 μmol·μl-1)、9 μl Mix混合液和7 μl ddH2O。