青頭菌多酚的提取及體外抗氧化活性的研究

趙紅艷,張鴨關(guān)

(曲靖師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 曲靖 655011)

0 引 言

云南得天獨(dú)厚的地理?xiàng)l件,孕育著口感細(xì)膩、味道鮮美、營養(yǎng)價(jià)值極高的各類野生菌[1].大量研究表明,野生菌具有很高的營養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值,多食食用菌不僅可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、降低癌癥誘發(fā)率,還能降血脂、降血壓.因此,野生菌也越來越受人們的喜愛.近年來,隨著人們對野生菌研究的不斷深入,野生菌在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用也愈加廣泛.青頭菌[Russulavirescens(Schaeff.)Fr.]是一種常見食藥用菌,又稱綠菇或青桿菌等[2],隸屬傘菌目、紅菇科、紅菇屬,味道鮮美,營養(yǎng)豐富,具有較好的保健與藥用價(jià)值[3].早在明代中醫(yī)藥學(xué)著作《滇南本草》中,就有對“青頭菌”藥用功效“氣味甘淡,微酸,無毒,主治眼目不明,能瀉肝經(jīng)之火,散熱舒氣,婦人氣郁,服之最良”的記載[2],近年來研究表明,“青頭菌”有抑制腫瘤、消炎、抑菌、抗氧化和調(diào)節(jié)血脂等功效[4].

酚類化合物是指帶有一個或者多個羥基芳環(huán),多酚是一類含有特定倍數(shù)苯酚單元化合物的總稱[5],主要分布于植物細(xì)胞的液泡內(nèi),一般以糖苷形式廣泛存在[6].多酚類物質(zhì)具有延緩衰老、降血壓、降血脂、預(yù)防癌癥和抑菌抗炎功能[7],這也使得多酚的研究越來越受人們的關(guān)注.

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 主要材料與儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇區(qū)西城新瑞儀器廠;TDL-5-A飛鴿牌系列離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠;紫外分光光度計(jì)TU-1810北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;SK2200H超聲波清洗器上?？茖?dǎo)超聲儀器有限責(zé)任公司;DHG-9053A電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限責(zé)任公司;DFY-800C高速粉碎機(jī)溫嶺市林大機(jī)械有限公司;AL204-IC電子天平梅特勒-拖利多儀器上海有限責(zé)任公司.

沒食子酸;無水乙醇;無水碳酸鈉;磷酸二氫鈉;磷酸氫二鈉;硫酸亞鐵;鐵氰化鉀;三氯化鐵;30%過氧化氫;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼);水楊酸;福林酚;三氯乙酸.以上試劑都為分析純,生產(chǎn)廠家為天津市風(fēng)帆化學(xué)試劑科技有限責(zé)任公司.

1.2 原料處理

青頭菌,采自曲靖市附近山上(見圖1),由曲靖師范學(xué)院生物資源與食品工程學(xué)院韓麗紅教授鑒定為青頭菌(Russulavirescens).將青頭菌根部去除,用蒸餾水清洗干凈后,切片,低溫烘干、粉碎,密封備用.

圖1 采自野外的青頭菌

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考唐婷范等人[8]方法并加以調(diào)整:準(zhǔn)確稱取0.01g的沒食子酸,加水溶解,轉(zhuǎn)移到100 mL的容量瓶中定容,可得0.1mg/mL的沒食子酸溶液.在五支潔凈的25 mL棕色容量瓶中分別移入0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后補(bǔ)水至總體積為6.0 mL,再分別加0.5 mL的福林酚,混勻后再加1.5 mL 20%Na2CO3,搖勻.用未加沒事子酸的溶液作為空白對照.將六支容量瓶放到暗處放置30 min.在760 nm處測定六支容量瓶中溶液的吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.2 青頭菌中多酚的提取及含量的測定

參照張曉婷等人[9]提取多酚的方法并加以調(diào)整:稱取1g青頭菌粉末,按照一定的料液比加入一定量的一定濃度的乙醇溶液,保持超聲儀器的溫度為30℃,將離心管放到超聲儀器中提取一定時(shí)間后離心5 min,然后將上清液定容到50 mL的容量瓶中,得到多酚提取液.移取1 mL多酚提取液于25 mL的棕色容量瓶中,然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色.放置30 min測定多酚濃度.計(jì)算多酚含量.

式中:Y(mg/g)是青頭菌多酚提取率;C是待測液濃度(mg/mL);V是樣品溶液的體積(mL);N是稀釋倍數(shù);m是青頭菌干粉的質(zhì)量(g).

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

分別選取不同提取時(shí)間(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60),乙醇體積分?jǐn)?shù)(20%、30%、40%、50%、60%),進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇超聲時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)三個水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),見表1.

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 青頭菌多酚抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

(1)青頭菌多酚對羥基自由基的清除

參考李曉強(qiáng)等人[10]的水楊酸法,取9 mmol/L的水楊酸和9 mmol/L的FeSO4各1mL于試管中,再加入2 mL樣品和1 mL 9.8 mmol/L的H2O2進(jìn)行顯色反應(yīng),搖勻后于37℃水浴反應(yīng)30 min,在510 nm波長下測定混合液的吸光值A(chǔ)1.用超純水代替H2O2溶液測得對照吸光值A(chǔ)2.用乙醇溶液代替樣品測吸光值A(chǔ)0.·OH清除率的計(jì)算公式如下:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1-加樣之后所測的吸光度;

A2-純水代替H2O2溶液所測的吸光度;

A0-乙醇溶液代替樣品液所測的吸光度.

(2)青頭菌多酚對DPPH自由基的清除

參考郭翎菲[11]的方法稍作調(diào)整,取2.0 mL DPPH溶液和2.0 mL不同濃度的多糖樣品溶液于10 mL比色管中,搖勻放置30 min,在517 nm處測定其吸光度A0,按照同樣的方法測定2.0 mL 80%乙醇溶液和不同濃度多糖樣品溶液2.0 mL的吸光度A1,2.0 mL 80%乙醇溶液和2.0 mL DPPH溶液的吸光度A2.以維生素C為對照品,按下式計(jì)算DPPH清除率:

清除率(%)=[1-(A0-A1)/A2]×100

式中:A0-DPPH加多糖之后所測的吸光度;

A1-乙醇代替DPPH之后所測的吸光度;

A2-乙醇代替多糖溶液所測的吸光度.

(3)青頭菌多酚對總還原能力的測定

參照張芳銘等人[12]的實(shí)驗(yàn)方法稍作修改,量取0.1mL且依次增加0.1mL的多酚稀釋液于八支潔凈的離心管中,再分別補(bǔ)水至總體積為1 mL,然后加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,搖勻后放入50℃恒溫水浴鍋反應(yīng)20 min.取出加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,然后以3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min.取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL的三氯化鐵溶液,搖勻后靜置10 min.以試劑空白為參比液,在700 nm波長處測定該溶液的吸光度為A.以吸光度值反映總還原能力,吸光度值越大說明還原能力越強(qiáng).

2 結(jié)果與討論

2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為Y=0.08708X+0.0177,R2=0.9996,線性較好.

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對青頭菌多酚提取的影響結(jié)果

由圖2可以看出,隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加,多酚得率先上升后下降.乙醇比例較高時(shí),色素等脂溶性成分大量溶出,阻礙了多酚的溶出,且高濃度的乙醇更容易揮發(fā),與張硯壘等人[13]探究乙醇體積分?jǐn)?shù)對圓鈴1號棗多酚的提取影響得出的結(jié)論大體一致.因此最佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%.

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對青頭菌多酚提取的影響

2.2.2 料液比對青頭菌多酚提取的影響結(jié)果

由圖3可以看出,當(dāng)料液比增加時(shí),多酚的提取率呈上升趨勢,當(dāng)料液比為1∶30時(shí),多酚得率上升較明顯,最后趨于平穩(wěn).可能是料液比較低時(shí),青頭菌中的多酚不能完全被提取出來,增加提取劑乙醇的用量,未被提取的多酚向提取劑乙醇中轉(zhuǎn)移,溶劑與原料的比值越大,濃度梯度越大,有效成分的擴(kuò)散速率也越大,與林錦銘等人[14]探究料液比對美藤果殼多酚的提取影響得出的結(jié)論一致.因此最佳料液比為1∶50.

圖3 料液比對青頭菌多酚提取的影響

2.2.3 超聲時(shí)間對青頭菌多酚提取的影響結(jié)果

由圖4可以看出,在20 min～40 min間,青頭菌多酚得率隨時(shí)間的增加而升高,最大值為8.29 mg/g.延長時(shí)間,多酚得率先降低后又稍微升高,但均小于40 min的得率.多酚得率降低可能是由于提取時(shí)間過長,導(dǎo)致部分多酚被分解或過程中發(fā)生了氧化分解,與張硯壘等人[13]探究超聲時(shí)間對圓1號棗多酚的提取影響得出的結(jié)論大體一致.因此最佳提取時(shí)間為40 min.

圖4 超聲時(shí)間對青頭菌多酚提取的影響

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

由表2中的數(shù)據(jù)可以得出,三個因素對青頭菌多酚提取的影響大小為C(超聲時(shí)間)>A(乙醇體積分?jǐn)?shù))>B(料液比).其中超聲時(shí)間的影響最大,青頭菌多酚提取的最好組合為A1B1C1,即青頭菌多酚的最佳提取方案為乙醇體積分?jǐn)?shù)30%,料液比1∶30,超聲時(shí)間40 min.對此方案進(jìn)行驗(yàn)證,稱取1g青頭菌粉末,按最佳組合A1B1C1重復(fù)三次實(shí)驗(yàn),多酚提取率分別為9.76 mg/g、9.79 mg/g、9.82 mg/g,于正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合,因此最佳組合是合理的.

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

2.4 抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

2.4.1 青頭菌多酚對·OH的清除結(jié)果

由圖5可知,青頭菌多酚和Vc的質(zhì)量濃度越大,對·OH的清除率越大,即清除能力越強(qiáng).當(dāng)質(zhì)量濃度為80 μg/mL時(shí),青頭菌多酚和Vc對·OH的清除率分別為63.32%、96.32%.在胡新穎等人[7]的大麥多酚對·OH的清除能力的實(shí)驗(yàn)中,50 μg/mL的大麥多酚對·OH的清除率為18.78%,本實(shí)驗(yàn)中50 μg/mL的青頭菌多酚對·OH的清除率可達(dá)47.32%.相比,青頭菌多酚對·OH的清除率要高很多,說明青頭菌多酚對·OH具有良好的清除效果.

圖5 羥基自由基清除率測定結(jié)果

2.4.2 青頭菌多酚對DPPH自由基的清除率測定結(jié)果

由圖6可知,青頭菌多酚和Vc的質(zhì)量濃度越大,對DPPH的清除率越大,即清除能力越強(qiáng).當(dāng)質(zhì)量濃度為20.36 μg/mL時(shí),青頭菌多酚和Vc對DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值,分別為61.11%、95.32%,Vc對DPPH自由基的清除率明顯高于青頭菌多酚對DPPH自由基的清除率.在汪群等人[15]的海帶多酚對DPPH自由基的清除能力的實(shí)驗(yàn)中,2.0 mg/mL的海帶游離多酚、結(jié)合多酚對DPPH自由基的清除率分別為41.72%、19.37%,本實(shí)驗(yàn)中的0.02 mg/mL的青頭菌多酚對DPPH自由基的清除率為61.11%.相比較,青頭菌多酚對DPPH自由基的清除率要高很多,說明青頭菌多酚對DPPH自由基具有良好的清除效果.

圖6 DPPH自由基清除率測定結(jié)果

2.4.3 青頭菌多酚對總還原能力的測定結(jié)果

由圖7可知,青頭菌多酚溶液和Vc溶液的質(zhì)量濃度增加,吸光度也增加,即青頭菌多酚提取液和Vc溶液的總還原能力是增強(qiáng)的,青頭菌多酚提取液的總還原能力略低于Vc溶液.

圖7 總還原能力測定結(jié)果

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇提取青頭菌多酚.通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取方案,青頭菌多酚的最佳的提取方案為:乙醇體積分?jǐn)?shù)30%,料液比1∶30,超聲時(shí)間40 min.在此方案下青頭菌多酚的提取率為9.81mg/g.通過進(jìn)行·OH和DPPH自由基的清除以及總還原能力的實(shí)驗(yàn)來研究青頭菌多酚的抗氧化活性.抗氧化實(shí)驗(yàn)中,·OH和DPPH自由基的清除率與青頭菌多酚的質(zhì)量濃度的相關(guān)性較好,質(zhì)量濃度增加,清除率增加.在總還原能力的實(shí)驗(yàn)中,青頭菌多酚的總還原能力與青頭菌多酚的質(zhì)量濃度的相關(guān)性好,濃度增加,吸光度增加,還原能力增強(qiáng).