黃芩苷碳點的制備表征及其對犬乳腺腫瘤細胞增殖的抑制作用

駱宗江，劉彪，林珈好

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193；2. 中國農(nóng)業(yè)大學中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心，北京 100193)

犬乳腺腫瘤(canine mammary tumour，CMT)是雌性犬最常見的腫瘤之一，占雌性犬腫瘤疾病的25%～42%[1]，其發(fā)病率是人類乳腺腫瘤的3倍[2-3]，嚴重威脅犬的健康。目前，手術(shù)切除是治療CMT最常見的方式，然而，對于惡性乳腺腫瘤的患犬，單純手術(shù)切除療法對其創(chuàng)傷大，術(shù)后并發(fā)癥多且容易復發(fā)或轉(zhuǎn)移[4]。CMT在中獸醫(yī)中屬于“乳巖”范疇，其主要病因病機為肝郁氣滯，瘀毒互結(jié)[5]，氣滯血瘀、痰濁淤積，阻于乳絡，久而生成癌毒。癌毒是乳腺腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，扶正祛邪、抗癌解毒是治療乳腺腫瘤的重要治則[6]。黃芩是清熱解毒中藥，尤其擅長解癰腫瘡毒，是治療乳腺腫瘤的常用中藥。黃芩苷(baicalin)是從黃芩干燥根中提取得到的黃酮類成分，為黃芩的主要活性成分。研究表明，黃芩苷能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖，誘導乳腺癌細胞凋亡，且具有時間和濃度依賴性[7]，但是黃芩苷存在水溶性差和生物利用度低的缺點，其臨床應用受到限制，亟需尋找有效的解決方法。

碳點是一類粒徑小于10 nm，主要元素為碳、氫、氧和氮的新型零維碳納米材料[8]。中草藥作為天然產(chǎn)物，其來源廣泛，含有豐富的活性成分，是碳點合成的理想前體之一[9]。以中草藥為碳源合成的中藥碳點作為碳點家族的最新成員，具有水溶性好、毒性低及雜原子豐富等優(yōu)點[10]，在生物成像[11]、抑菌[12]和腫瘤治療[13]等生物醫(yī)學領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應用。本研究以黃芩苷為碳源，制備黃芩苷碳點，并探究了其抗犬乳腺腫瘤的活性。

1 材料與方法

1.1 細胞

犬乳腺癌細胞系CIPp由日本東京大學獸醫(yī)學院饋贈；CMT-7364由本實驗室自臨床分離、鑒定及保存[14]。

1.2 主要試劑

黃芩苷(純度≥90%)，上海麥克林生化科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 主要儀器

水熱合成反應釜，西安儀創(chuàng)實驗室儀器設備有限公司產(chǎn)品；真空干燥箱，上海精宏儀器設備有限公司產(chǎn)品；Milli-Q 超純水儀，美國Millipore公司產(chǎn)品；真空冷凍干燥儀，上海葉拓科技有限公司產(chǎn)品；紫外-可見分光光度計，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；熒光分光光度計，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；傅里葉變換紅外光譜儀，德國Sigma公司產(chǎn)品；場發(fā)射透射電鏡，荷蘭Philips-FEI公司產(chǎn)品；X射線光電子能譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；透析袋(1 000 Da)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.4 黃芩苷碳點的制備

將20 mg黃芩苷粉末與30 mL超純水混合均勻后，轉(zhuǎn)移至水熱合成反應釜，隨后將其置于真空干燥箱中，反應溫度設為160 ℃，持續(xù)6 h。反應結(jié)束后，待反應釜自然冷卻至室溫，取出溶液，12 000g離心30 min，收集上清液，用0.22 μm濾膜過濾，取濾液透析24 h。最后，使用真空冷凍干燥儀對透析后的液體進行冷凍干燥[13-15]。

1.5 黃芩苷碳點的表征

1.5.1 黃芩苷碳點形態(tài)觀察

將制得的黃芩苷碳點配制成碳點水溶液，將碳點水溶液滴于超薄碳膜，待干燥后在高分辨率透射電子顯微鏡下觀察碳點的大小和形態(tài)。

1.5.2 黃芩苷碳點的紫外可見吸收光譜分析

將黃芩苷碳點配制成的碳點溶液置于紫外-可見分光光度計中，掃描檢測其250～700 nm的吸收圖譜。

1.5.3 黃芩苷碳點的熒光發(fā)射光譜分析

將黃芩苷碳點配制成的碳點溶液置于熒光光譜儀中，用380～480 nm波長的光激發(fā)，掃描并記錄黃芩苷碳點在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜。

1.5.4 黃芩苷碳點的紅外光譜分析

將碳點樣品置于傅利葉紅外光譜儀中進行紅外掃描，波數(shù)范圍為500 ～4 000 cm-1，記錄紅外譜圖，分析碳點的表面結(jié)構(gòu)。

1.6 黃芩苷碳點對犬乳腺腫瘤細胞的增殖抑制作用

將犬乳腺腫瘤細胞CIPp、CMT-7364培養(yǎng)于含10%胎牛血清和100 U/mL 青霉素鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)皿置于37 ℃，5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的CIPp和CMT-7364細胞系按照1.0×104個/μL接種于96孔板，為減少揮發(fā)，在96孔細胞板四周的孔中加入100 μL PBS，不接種細胞。待細胞貼壁后，棄去舊培養(yǎng)液，分別加入100 μL含有不同濃度黃芩苷碳點的完全培養(yǎng)基。共孵育48 h后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入100 μL含10% CCK-8試劑的DMEM，37 ℃避光孵育30～60 min后，檢測各孔在450 nm處的OD值，計算細胞存活率；用Graphpad Prism 8.0軟件計算碳點溶液作用于兩種細胞的IC50值。

細胞存活率=(OD試驗-OD對照)/(OD對照-OD空白)×100%。

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷碳點形態(tài)觀察

如圖1所示，黃芩苷碳點呈類球形，顆粒較均勻且分散性良好，顆粒的平均直徑為3～6 nm，晶格間距為0.253 nm。

A.透射電子顯微鏡成像；B. 高分辨率透射電子顯微鏡成像。

2.2 黃芩苷碳點的紫外可見吸收光譜分析

黃芩苷碳點水溶液在自然光照下呈黃色，在365 nm紫外光下發(fā)出藍色熒光。由紫外可見吸收光譜(圖2)可知，黃芩苷碳點在260 nm及350 nm附近存在吸收峰。

圖2 黃芩苷碳點的紫外可見吸收光譜

2.3 黃芩苷碳點的熒光發(fā)射光譜分析

熒光發(fā)射光譜(圖3)顯示，黃芩苷碳點的發(fā)射波長隨著激發(fā)波長的增加逐漸紅移，說明該碳點具有較好的熒光激發(fā)依賴特性。

圖3 黃芩苷碳點的熒光發(fā)射光譜

2.4 黃芩苷碳點的紅外光譜分析

如圖4所示，在黃芩苷碳點的紅外光譜中，3 432 cm-1附近的吸收峰歸因于O-H的伸縮振動，1 716 cm-1處吸收峰由C=O伸縮振動產(chǎn)生，1 450 cm-1處的吸收峰對應N-H的伸縮振動，1 099 cm-1附近的吸收峰歸因于C-O的伸縮振動。結(jié)果表明，黃芩苷碳點表面存在-OH、-COOH和-NH2等基團，提示該碳點具有較好的水溶性。

圖4 黃芩苷碳點的紅外光譜

2.5 黃芩苷碳點對犬乳腺腫瘤細胞增殖的抑制作用

如圖5所示，黃芩苷碳點作用犬乳腺腫瘤細胞CIPp、CMT-7364 48 h的IC50分別為41.65 μg/mL和42.78 μg/mL，表明黃芩苷碳點可有效抑制犬乳腺腫瘤細胞的增殖。

A.犬乳腺腫瘤細胞CIPp；B. 犬乳腺腫瘤細胞CMT-7364。

3 討論

水溶性是藥物發(fā)揮作用的關(guān)鍵性質(zhì)，水溶性的增加可增強藥物在體內(nèi)的溶解及吸收，從而改善藥物的生物利用度。本研究紅外圖譜顯示，黃芩苷碳點在3 432 cm-1、1 716 cm-1和1 450 cm-1附近出現(xiàn)吸收峰，分別歸因于O-H、C=O和N-H的伸縮振動，提示該碳點表面存在-OH、-COOH和-NH2等基團，表明黃芩苷在制成碳點后可獲得良好的水溶性，從而發(fā)揮更優(yōu)的療效。

無限增殖是惡性腫瘤的顯著特征之一，它可導致腫瘤組織的過度生長，從而掠奪正常組織的營養(yǎng)和生存空間，影響機體正常的生理功能，最終嚴重威脅到個體的生命健康[16]。藥物對腫瘤細胞增殖的抑制作用是考察其抗腫瘤活性的重要評價指標。CCK-8試驗結(jié)果顯示，黃芩苷碳點能夠有效抑制犬乳腺腫瘤細胞CIPp和CMT-7364的增殖，這與之前的報道相似。Yao等[13]基于人參皂苷Re成功合成出一種新型光致發(fā)光碳點，并對其體外抗癌作用進行評估，結(jié)果表明該碳點可抑制腫瘤細胞的增殖，并通過caspase介導的途徑誘導腫瘤細胞凋亡。Li等[17]發(fā)現(xiàn)用生姜制成的碳點能夠極顯著地抑制人肝癌細胞HepG2的生長，且對正常乳腺上皮細胞MCF-10A和小鼠肝細胞FL83B的毒性較低。

本研究以黃芩苷作為碳源，采用水熱法成功制備出粒徑小于10 nm的黃芩苷碳點，發(fā)現(xiàn)該碳點不僅具有良好的水溶性，且能夠有效抑制犬乳腺腫瘤細胞的增殖，可為抗犬乳腺腫瘤中藥的創(chuàng)制提供試驗依據(jù)。然而，黃芩苷碳點作為一種新型零維碳納米材料，其成藥性還需進一步探究，如增設陽性藥物對照組、采用正常細胞系進行試驗以及在犬乳腺腫瘤在體模型上進一步驗證等。