弓形蟲LAMP熒光檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

杜鵑，吳迪，張瑋，程敏姮，李蕊，李剛，陳會(huì)玲，王天梓，苗東影，王林*

(1. 北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629；2. 北京市大興區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局檢測(cè)檢疫和疫病防控中心，北京 102629)

弓形蟲病是由原生動(dòng)物寄生蟲剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)引起的一種人畜共患傳染病[1]，可感染所有溫血?jiǎng)游颷2]，我國(guó)將其列為三類動(dòng)物疫病[3]。貓科動(dòng)物是弓形蟲唯一的終末宿主，被感染的貓能夠在感染后的幾天內(nèi)在糞便中排出數(shù)百萬個(gè)感染性卵囊[4-5]。人類、嚙齒動(dòng)物和其他動(dòng)物作為中間宿主，通過攝入來自環(huán)境中的卵囊，即食用受污染的食物、含有弓形蟲的未煮熟的肉或直接接觸貓糞便排出的卵囊而被感染[6-7]。流浪犬在人類弓形蟲病流行病學(xué)中的作用也不可被低估，因?yàn)樗鼈兘?jīng)常接觸受污染的環(huán)境，可以很容易地作為弓形蟲的傳播載體[8]。弓形蟲侵入動(dòng)物機(jī)體后，可經(jīng)血流輸送至各器官，寄生在這些器官細(xì)胞中，并加速分裂增殖，導(dǎo)致組織炎癥、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、壞死。犬感染弓形蟲后可出現(xiàn)發(fā)熱、肌肉麻痹、昏睡及角弓反張等癥狀，貓感染后不會(huì)有明顯的臨床癥狀[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上30%[10]的人感染弓形蟲，其中，中國(guó)有7.88%[11]的人口感染過弓形蟲。目前弓形蟲檢測(cè)方法分為病原分離鑒定、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)與酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)等，但病原分離鑒定操作復(fù)雜、對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求高，傳統(tǒng)PCR檢測(cè)靈敏度低、易污染，免疫學(xué)檢測(cè)可能存在假陽性等問題[12]，因此亟需建立一種快速、準(zhǔn)確、不易污染、儀器設(shè)備適配性高的檢測(cè)方法。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法(LAMP)是一種新型的體外等溫?cái)U(kuò)增核酸檢測(cè)技術(shù)[13]，該方法針對(duì)靶基因的6個(gè)特定區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異性引物[14]，在鏈置換脫氧核糖核酸(DNA)聚合酶作用下，可實(shí)現(xiàn)在15～60 min，60～65 ℃條件下完成109～1010倍的擴(kuò)增反應(yīng)[15]，是一種快速、無污染、準(zhǔn)確的新型核酸擴(kuò)增方法。本研究建立了一種基于SYTO9熒光染料的弓形蟲LAMP熒光檢測(cè)方法，可通過熒光曲線判讀結(jié)果，無需開蓋電泳，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、儀器設(shè)備適配范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，適合現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑

LoopampDNA 擴(kuò)增試劑盒購自榮研生物科技(中國(guó))有限公司，弓形蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：TOX20220809P)購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司。弓形蟲、血吸蟲、貓弓首蛔蟲、犬巴貝斯蟲、犬新孢子蟲、鉤端螺旋體核酸，由北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存。弓形蟲基因組質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈(zèng)，質(zhì)粒濃度為450 ng/μL。SYTO9熒光染料購自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

便攜式MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀購自北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限責(zé)任公司。QuantStudio7熒光定量PCR儀器購自ABI公司，UNOП基因擴(kuò)增儀購自德國(guó)Whutmun，移液器購自德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已發(fā)表弓形蟲特異基因片段(GenBank：AF146527)，運(yùn)用PrimerExplorer 在線生物軟件(http：//primerexplorer.jp/)，通過調(diào)整GC含量、Tm值、dG臨界值等參數(shù)值，設(shè)計(jì)出2組LAMP熒光檢測(cè)的引物組，包括基礎(chǔ)引物(F3、B3、FIP、BIP)和環(huán)引物(LB)，引物序列見表1和表2。根據(jù)《動(dòng)物弓形蟲病診斷技術(shù)》(NY/T 573—2022)中聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)提供的引物進(jìn)行引物序列合成。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 引物組1序列

表2 引物組2序列

1.4 LAMP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

按照LoopampDNA 擴(kuò)增試劑盒說明書配制25 μL LAMP反應(yīng)體系，見表3。

表3 LAMP熒光反應(yīng)體系

1.4.1 引物組的篩選

將450 ng/μL濃度弓形蟲基因組質(zhì)粒稀釋為104copies/μL，并以此為模板利用引物組1與引物組2進(jìn)行LAMP熒光擴(kuò)增反應(yīng)，比較兩組引物組熒光曲線、擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間，篩選出最優(yōu)引物組。

1.4.2 反應(yīng)溫度篩選

以104copies/μL濃度弓形蟲基因組質(zhì)粒為模板，利用MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀分別在反應(yīng)溫度為62、64、66、68 ℃的條件下進(jìn)行LAMP熒光擴(kuò)增反應(yīng)，比較各反應(yīng)溫度下的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間。

1.5 靈敏度試驗(yàn)

將450 ng/μL弓形蟲基因組質(zhì)粒稀釋為104copies/μL，定量后將總DNA按1∶10進(jìn)行倍比稀釋至0.1 copies/μL，并使其最終稀釋拷貝數(shù)為104copies/μL～10-1copies/μL，并以ddH2O作為陰性對(duì)照，使用MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀與熒光定量PCR儀進(jìn)行LAMP熒光反應(yīng)，評(píng)價(jià)建立方法的靈敏度。同時(shí)，將建立的LAMP熒光檢測(cè)方法靈敏度與中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：《動(dòng)物弓形蟲病診斷技術(shù)》(NY/T 573—2022)中規(guī)定的PCR檢測(cè)方法與某一市售的弓形蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(Ct值<36并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線判定為弓形蟲陽性，無Ct值或無特異性擴(kuò)增曲線判為陰性)進(jìn)行比對(duì)。

1.6 特異性試驗(yàn)

以弓形蟲陽性樣品，血吸蟲、貓弓首蛔蟲、犬巴貝斯蟲、犬新孢子蟲、鉤端螺旋體核酸為模板進(jìn)行LAMP特異性檢測(cè)，評(píng)價(jià)LAMP熒光檢測(cè)特異性。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

分別以濃度為104copies/μL～1 copies/μL的弓形蟲基因組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行LAMP熒光擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度重復(fù)4次，根據(jù)其Ct值計(jì)算變異系數(shù)，評(píng)價(jià)該方法的重復(fù)性。

1.8 儀器設(shè)備適配性試驗(yàn)

將104copies/μL弓形蟲基因組質(zhì)粒，按1∶10倍比稀釋至0.1 copies/μL，分別應(yīng)用QuantStudio7熒光定量PCR儀與MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀進(jìn)行LAMP熒光擴(kuò)增反應(yīng)，開機(jī)預(yù)熱并檢驗(yàn)儀器性能后，取配制好體系的PCR反應(yīng)管，放置在樣品槽相應(yīng)位置，記錄順序，按表4設(shè)置擴(kuò)增參數(shù)，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。

表4 儀器LAMP擴(kuò)增參數(shù)

1.9 臨床樣品檢測(cè)

用已建立的LAMP熒光檢測(cè)方法、市售的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及《動(dòng)物弓形蟲病診斷技術(shù)》(NY/T 573—2022)中規(guī)定的PCR檢測(cè)方法，同時(shí)檢測(cè)已知背景的200份臨床樣品(其中190份為陰性樣品，10份為陽性樣品)，臨床樣品根據(jù)《北京市動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃(2021—2025)》采集全市動(dòng)物醫(yī)院、散養(yǎng)戶、流浪場(chǎng)所等犬、貓糞便與全血樣品，比對(duì)3種檢測(cè)方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物組合的篩選

設(shè)計(jì)的弓形蟲引物組1與引物組2 LAMP熒光擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果見圖1。可以看出，引物組1擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為11 min，引物組2擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為16 min，因此引物組1優(yōu)于引物組2。

1. 引物組1擴(kuò)增反應(yīng)曲線；2. 引物組2擴(kuò)增反應(yīng)曲線；3. 引物組1陰性對(duì)照；4. 引物組2陰性對(duì)照。

2.2 反應(yīng)溫度的篩選

不同反應(yīng)溫度條件下擴(kuò)增曲線見圖2。可以看出，62 ℃條件下擴(kuò)增時(shí)間為12 min，64 ℃條件下擴(kuò)增時(shí)間為19 min，66 ℃條件下擴(kuò)增時(shí)間為21 min，68 ℃條件下擴(kuò)增時(shí)間為32 min，因此弓形蟲LAMP熒光檢測(cè)反應(yīng)條件最佳溫度為62 ℃。

A. 62 ℃；B. 64 ℃；C. 66 ℃；D. 68 ℃。

2.3 靈敏度試驗(yàn)

評(píng)價(jià)確定所建立的LAMP熒光檢測(cè)方法的靈敏度，檢測(cè)結(jié)果如圖3、圖4所示，可檢測(cè)到1 copies/μL。PCR擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，樣品在529 bp出現(xiàn)條帶即為陽性，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，可檢測(cè)到100 copies/μL。應(yīng)用弓形蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，判定標(biāo)準(zhǔn)為Ct值<36并出現(xiàn)特定擴(kuò)增曲線判定為弓形蟲陽性，無Ct值或無特異性擴(kuò)增曲線判定為陰性，檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，可檢測(cè)到10 copies/μL。建立的LAMP熒光檢測(cè)方法靈敏度高于標(biāo)準(zhǔn)方法與市售某一實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。

1～6.不同稀釋濃度質(zhì)粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7～8. 陰性對(duì)照。

1～6. 不同稀釋濃度質(zhì)粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7～8. 陰性對(duì)照。

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1～6. 質(zhì)粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7. 陰性對(duì)照。

1～6. 質(zhì)粒(104 copies/μL～0.1 copies/μL)；7. 陽性對(duì)照；8. 陰性對(duì)照。

各檢測(cè)方法靈敏度比較結(jié)果見表5。

表5 弓形蟲各檢測(cè)方法靈敏度比較

2.4 特異性試驗(yàn)

本研究建立的弓形蟲LAMP熒光檢測(cè)方法特異性結(jié)果見圖7?？梢钥闯?，建立的LAMP熒光檢測(cè)方法特異性良好，可以特異性檢出弓形蟲，與血吸蟲、貓弓首蛔蟲、犬巴貝斯蟲、犬新孢子蟲、鉤端螺旋體無交叉反應(yīng)。

1.弓形蟲；2. 血吸蟲；3. 貓弓首蛔蟲；4. 犬巴貝斯蟲；5. 犬新孢子蟲；6. 鉤端螺旋體；7-8. 陰性對(duì)照。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

采用104copies/μL～1 copies/μL的弓形蟲基因組質(zhì)粒為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增，每個(gè)稀釋度重復(fù) 4 次，結(jié)果如表6所示，變異系數(shù)均小于5%，說明該方法重復(fù)性較好。

表6 ASFV熒光LAMP重復(fù)性驗(yàn)證

2.6 儀器設(shè)備適用性試驗(yàn)

分別使用MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀與ABI QuantStudio7熒光定量PCR儀對(duì)104copies/μL～0.1 copies/μL質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果見表7。在50 min內(nèi)兩種設(shè)備均可檢測(cè)到1 copies/μL，表明本研究建立的弓形蟲LAMP熒光檢測(cè)方法對(duì)兩種型號(hào)的PCR檢測(cè)設(shè)備均可適用，既可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室QuantStudio7熒光定量PCR儀，又可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)設(shè)備MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀，且檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定。

表7 儀器設(shè)備適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 LAMP熒光的臨床檢測(cè)

用已建立的LAMP熒光檢測(cè)方法與市售的弓形蟲實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 573—2022)同時(shí)檢測(cè)已知背景的200份臨床樣品(其中190份為陰性樣品，10份為陽性樣品)，比對(duì)3種檢測(cè)方法的符合率，結(jié)果見表8?？梢钥闯?，建立的LAMP熒光檢測(cè)方法與實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法、行標(biāo)方法檢測(cè)結(jié)果一致，三者符合率為100%。

表8 LAMP熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、普通PCR檢測(cè)結(jié)果

3 討論

傳統(tǒng)的弓形蟲病診斷方法依賴于特異性抗體的血清學(xué)檢測(cè)，然而這種方法有其局限性[16]，在感染的活躍階段，可能無法檢測(cè)到特異性的抗弓形蟲IgG或IgM，因?yàn)檫@些抗體可能直到寄生蟲血癥發(fā)生幾周后才能產(chǎn)生[17]。分子法檢測(cè)弓形蟲感染具有較高的靈敏度和特異性，具有一定優(yōu)勢(shì)。一些基于PCR的弓形蟲檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)，然而由于PCR儀器的昂貴成本和反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，這些技術(shù)在臨床使用中存在一些局限性[18]。本研究建立的LAMP熒光檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、儀器適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，可以很好地彌補(bǔ)PCR檢測(cè)方法的劣勢(shì)。

本研究選取弓形蟲基因片段(NCBI GenBank：AF146527)為模板進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，該基因片段大小為529 bp，在剛地弓形蟲基因組中重復(fù)200～300次，是一段高度保守的重復(fù)序列，通常被用作弓形蟲PCR診斷。Du等[19]分別利用弓形蟲529 bp重復(fù)片段(AF146527)與B1基因(AF179871)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示選取529 bp基因?yàn)榘谢驍U(kuò)增弓形蟲靈敏度與特異性均高于B1基因。因此本試驗(yàn)以弓形蟲529 bp基因?yàn)槟０暹M(jìn)行LAMP引物設(shè)計(jì)，目的是使建立的LAMP檢測(cè)方法更具代表性。與Du等[20]基于弓形蟲529 bp基因片段為模板建立的LAMP檢測(cè)方法(檢測(cè)限為5 copies/μL弓形蟲速殖子)相比，本研究通過摸索優(yōu)化LAMP引物建立的熒光LAMP檢測(cè)方法靈敏度更優(yōu)且無需凝膠電泳，具有快速、無污染、靈敏度更高的優(yōu)勢(shì)。

本研究建立的弓形蟲LAMP熒光檢測(cè)方法靈敏度為1 copies/μL，高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的靈敏度(100 copies/μL)與市售的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的靈敏度(10 copies/μL)。與近年來國(guó)內(nèi)建立的弓形蟲LAMP檢測(cè)方法靈敏度比較，朱志偉[20]在2021年建立的弓形蟲LAMP熒光檢測(cè)方法的靈敏度為10 copies/μL。王萌[21]建立的弓形蟲LAMP診斷方法采用瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增法可檢測(cè)到10 copies/μL。因此，本研究建立的檢測(cè)方法靈敏度在國(guó)內(nèi)處于領(lǐng)先水平。同時(shí)，本研究建立的檢測(cè)方法在50 min內(nèi)即可完成，時(shí)間快于某市售實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(75 min)。

本研究在反應(yīng)體系中加入SYTO9熒光染料，目的是使儀器設(shè)備的適配性更加多樣化，試驗(yàn)表明，建立的LAMP熒光反應(yīng)體系既可在專用儀器MA-1610型等溫?zé)晒釶CR儀上進(jìn)行擴(kuò)增并讀取結(jié)果，也可通過設(shè)置實(shí)驗(yàn)室熒光定量PCR儀等設(shè)備參數(shù)進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增，且兩種設(shè)備均無需開蓋即可判讀結(jié)果，大大降低了因瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)生的氣溶膠污染。

總之，本研究建立的弓形蟲LAMP熒光檢測(cè)方法在62 ℃ 50 min內(nèi)對(duì)弓形蟲的檢測(cè)靈敏度為1 copies/μL，靈敏度高于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY-T 573—2022)與某市售的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的靈敏度，與血吸蟲、貓弓首蛔蟲、犬巴貝斯蟲、犬新孢子蟲、鉤端螺旋體均無交叉反應(yīng)，檢測(cè)時(shí)間快，儀器適配性高，便于在基層動(dòng)物醫(yī)院及獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。