豬源ST3型多殺性巴氏桿菌(血清A型)的鑒定及致病性研究

趙苗苗，孫殿鋼，項(xiàng)維，王玲玲，劉峰，何斌，李豐陽，雷連成，*，張付賢*

(1. 長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434023；2. 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 武漢 430065；3. 吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

多殺性巴氏桿菌(Pm)是屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬的一種小型、無鞭毛、兼性厭氧的革蘭陰性短桿菌[1]。多殺性巴氏桿菌分布廣泛，可感染人引起腹膜炎、肺炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎或敗血癥[2-3]，也可感染野生動物和各種畜禽致其發(fā)病，如豬肺疫和萎縮性鼻炎[4]、禽霍亂[5]、牛出血性敗血癥[6]等，是一種重要的人獸共患病病原菌。豬多殺性巴氏桿菌在全世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)流行，同時(shí)該病原菌可與多種病毒、細(xì)菌等病原混合感染豬群，造成貍?cè)喊l(fā)病率和死亡率增多[7]，嚴(yán)重危害生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。Carter[8]根據(jù)其莢膜抗原將多殺性巴氏桿菌分為A、B、D、E和F 5個(gè)血清型；研究發(fā)現(xiàn)，豬是Pm的自然宿主，可感染A、B、D和E型，引起肺炎、萎縮性鼻炎、敗血癥等病癥[9-10]。豬巴氏桿菌病被我國列入二類動物疫病控制名單內(nèi)，在養(yǎng)殖和屠宰環(huán)節(jié)嚴(yán)格防控。然而，近年來多殺性巴氏桿菌在我國規(guī)?；i場出現(xiàn)繼發(fā)感染和混合感染率上升的問題，《獸醫(yī)公報(bào)》中收錄了2010年1月至2020年11月期間中國內(nèi)地31個(gè)省市地區(qū)共發(fā)生的19 686次多殺性巴氏桿菌疫情，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2021年12月貴州省六盤市某養(yǎng)殖場出現(xiàn)豬只呼吸困難、咳嗽，口鼻流出血色，伴有突發(fā)性死亡。無菌采集發(fā)病豬的口鼻拭子和病死豬組織進(jìn)行病原的分離鑒定，通過對細(xì)菌病原的分離得到豬多殺性巴氏桿菌，鑒定為序列型(ST)3型和血清A型，根據(jù)小鼠試驗(yàn)分析分離菌株的致病性，結(jié)合藥敏試驗(yàn)和耐藥基因檢測，篩選出對分離菌敏感的抗生素和中藥。本試驗(yàn)結(jié)果為豬源多殺性巴氏桿菌的流行病學(xué)監(jiān)測、致病機(jī)理研究和防控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料與菌株

自2021年8月至2022年1月，采集貴州省六盤水某豬場患呼吸道病豬口鼻拭子30份，無菌采集病死豬的肺臟、淋巴結(jié)、脾臟等組織共11份，低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室；豬源多殺型巴氏桿菌參考菌株由長江大學(xué)動物重要病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、胰蛋白大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)購買自青島海博生物科技有限公司；革蘭染色劑和四季青新生牛血清購買自北京索萊寶科技有限公司；Labselect聚苯乙烯96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購買自北京蘭杰柯科技有限公司；藥敏紙片和細(xì)菌生化微量鑒定管購買自杭州微生物試劑有限公司；Taq酶購買自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、RNA提取試劑盒購買自北京天根生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級昆明雌性小鼠60只，體重30～35 g，購自湖北宜昌三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.4 豬呼吸道疾病病原檢測

取病死豬的肺臟、淋巴結(jié)等病變組織以研磨器勻漿后用300 μL無菌PBS稀釋，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，按照組織基因組提取試劑盒操作說明書提取病料的DNA和RNA，RNA以FastKing gDNA dispelling RT SuperMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。合成豬呼吸道疾病病原引物[11-13]，以提取的DNA與反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，通過PCR方法分別檢測豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬鏈球菌2型(SS2)、胸膜肺炎放線桿菌(APP)、多殺性巴氏桿菌(Pm)、副豬嗜血桿菌(HPS)和肺炎克雷伯菌(Kp)的特異性基因，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 細(xì)菌分離及生理生化鑒定

無菌條件下使用接種環(huán)蘸取PCR檢測豬多殺性巴氏桿菌陽性樣品在含5%血清的TSA平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)14 h；挑取單個(gè)可疑菌落接種于含5%血清的TSA培養(yǎng)基上，37 ℃純化培養(yǎng)12～18 h。觀察TSA平板上單菌落的形態(tài)，挑取典型菌落，均勻涂布于載玻片上，革蘭染色后鏡檢觀察。

取分離菌株的純培養(yǎng)物接種至含5%血清的TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，取10 μL菌液加入細(xì)菌微量生化管中，37 ℃培養(yǎng)24 h，按照細(xì)菌生化微量鑒定管說明書進(jìn)行結(jié)果判定。

1.6 PCR鑒定

以細(xì)菌基因組提取試劑盒提取的分離菌株DNA為模板，用多殺性巴氏桿菌基因kmt1引物(F：5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′，R：5′-GCTGTAAACGAA-CTCGCCAC-3′)對其進(jìn)行擴(kuò)增[14]。反應(yīng)體系(20 μL)：2×TaqPCR master mix酶 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dd H2O 7 μL，模板1 μL。PCR的擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸4 min。1.2%凝膠對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

1.7 16S rDNA基因序列鑒定

合成細(xì)菌16S rDNA通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′與1492R：5′-TACGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dd H2O 7 μL，模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸3 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序部，使用NCBI BLAST對測序結(jié)果分析；選擇相似度高的菌株作為內(nèi)群，選取恰當(dāng)?shù)耐馊?，通過MEGA 8.0軟件中的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.8 菌株血清型分型

合成多殺型巴氏桿菌莢膜分型引物[14](表1)，以細(xì)菌基因組提取試劑盒提取的分離菌株DNA為模板，對分離菌株進(jìn)行血清型鑒定。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dd H2O 7 μL，模板1 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸3 min。

表1 多殺性巴氏桿菌莢膜分型引物

1.9 多位點(diǎn)序列分析(MLST)

根據(jù)MLST官網(wǎng)提供的多殺性巴氏桿菌信息，合成其7個(gè)管家基因(adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh和pgi)的引物，以分離菌株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測序，將測序結(jié)果上傳至MLST網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫獲取等位基因信息，通過eBURST程序分析繪圖。

1.10 生物被膜試驗(yàn)

采用96孔板結(jié)晶紫染色法分析分離菌株的生物被膜形成能力[15]。分離菌株的純培養(yǎng)物按1∶100接種于含5%血清的TSB液體培養(yǎng)基內(nèi)，取200 μL菌液至96孔板內(nèi)，做3個(gè)重復(fù)，以液體培養(yǎng)基為對照，37 ℃恒溫培養(yǎng)20～24 h；棄去菌液，無菌PBS洗滌3次，用100 μL甲醇固定15 min；洗滌、烘干后，加入100 μL結(jié)晶紫溶液染色5 min；棄掉染色液，PBS洗滌3次，烘干后每孔加入100 μL 33%(體積比)冰醋酸，使用酶標(biāo)儀測定每孔的OD590值。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，依據(jù)臨界的ODc值(對照孔的平均值)將生物被膜形成能力分為：ODc4ODc為強(qiáng)成膜能力。

1.11 菌株致病性試驗(yàn)

1.11.1 分離菌毒力基因檢測

合成多殺性巴氏桿菌23種毒力基因的引物[16]，以提取的分離菌株基因組為模板，特異性PCR方法檢測分離菌株攜帶毒力基因情況。

1.11.2 小鼠致病性試驗(yàn)

將分離菌株純化和鑒定后，取單個(gè)菌落接種于含5%血清的TSB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期，用無菌PBS梯度稀釋并涂板計(jì)數(shù)，制備攻毒菌液濃度分別為1.6×108、1.6×106、1.6×104、1.6×102、1.6×101CFU/mL。60只昆明鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，每組注射不同菌液濃度，每只注射0.2 mL，對照組小鼠每只注射0.2 mL的無菌PBS；攻毒后觀察記錄小鼠狀態(tài)及死亡情況，剖檢死亡小鼠，記錄臟器病變情況，并對死亡小鼠臟器做病原菌的分離與鑒定。

1.12 菌株藥物敏感性試驗(yàn)

1.12.1 抗菌藥物敏感試驗(yàn)

采用Kirby-Bauer(K-B)紙片擴(kuò)散法[17]，分析分離菌株對抗菌藥物的敏感情況。以金黃色葡萄球菌ATCC25923作為質(zhì)控菌株進(jìn)行試驗(yàn)，保證藥敏片的有效性。挑取分離菌株的單菌落置于含5%血清TSB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h；用無菌棉簽蘸取菌液并均勻涂布在含5%血清的TSA固體培養(yǎng)基表面，使用無菌鑷子夾取藥敏片置于涂布菌液的培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，測量抑菌圈直徑，判定分離菌株對不同藥物的敏感性。

1.12.2 分離菌耐藥基因檢測

合成多殺性巴氏桿菌耐藥基因的引物[18]，以分離菌株的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，dd H2O 7 μL，模板1 μL。

1.12.3 中藥抑制試驗(yàn)

選取桑皮、黃連、秦皮、蒲公英、烏梅、五味子、黃芩、三七、桔梗、連翹、生地榆、茯苓、金銀花、枳殼、羌活、板藍(lán)根16味中藥，各中藥分別水煎2次，將水煎2次的藥液過濾合并、濃縮藥液，制備成終濃度為1 g/mL的中藥藥液[19]。取分離菌株的菌液，用無菌棉簽蘸取菌液并均勻涂布在含5%血清的TSA固體培養(yǎng)基表面，在牛津杯中加入中藥藥液，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h，測量不同中藥藥液的抑菌圈直徑。試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為該中藥的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 豬呼吸道疾病病原檢測

從病豬病變組織組織中提取基因組，PCR檢測豬呼吸道疾病的病原，如圖1所示，多殺性巴氏桿菌的引物擴(kuò)增出460 bp大小的條帶，與多殺性巴氏桿菌參考菌株擴(kuò)增的條帶大小一致，其他病原檢測均為陰性，推測該豬場病豬的呼吸道疾病可能與多殺性巴氏桿菌感染相關(guān)。

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1～7. 分別檢測樣品HPS、APP、Kp、SS2、PRRSV、PCV2和Pm；8～14. 分別檢測陰性對照HPs、APP、Kp、SS2、PRRSV、PCV2和Pm；15～21. 分別檢測陽性對照HPs、APP、Kp、SS2、PRRSV、PCV2和Pm。

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1. 分離菌株；2. 陽性對照；3. 陰性對照。

2.2 細(xì)菌的形態(tài)及生理生化鑒定

對所采集的病豬肺組織勻漿后在固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，在TSA固體培養(yǎng)基上長出表面濕潤、有光澤感的圓形露珠樣菌落，在血瓊脂培養(yǎng)基上可見中間隆起的水滴樣菌落，革蘭染色后，鏡檢可見紅色菌體，兩極著染較深的短桿菌，多呈單個(gè)存在，表明分離菌為革蘭陰性菌。

分離菌株的生化特性顯示，分離菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、山梨醇和果糖，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能發(fā)酵衛(wèi)茅醇、鼠李糖、麥芽糖、甘露醇、乳糖，甲基醇和V-P試驗(yàn)為陰性，靛基試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)為陽性。結(jié)果顯示，分離菌株的與《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第8版)中Pm的生化特性一致。

2.3 PCR鑒定

使用特異性Pm引物對分離菌株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，分離菌株擴(kuò)增出一條460 bp大小的條帶，與多殺性巴氏桿菌陽性對照的條帶大小一致，表明分離菌株為多殺性巴氏桿菌。

2.4 16S rDNA擴(kuò)增及進(jìn)化樹構(gòu)建

以27F和1492R為引物，以分離菌株DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA并測序，將基因序列拼接后在NCBI上進(jìn)行序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3所示，分離菌株與NCBI收錄的多殺性巴氏桿菌參考菌株相似度為100%，與多殺性巴氏桿菌Pm strain E10/09 16s(HM746979.1)聚為一支，確定分離菌株為多殺性巴氏桿菌，命名為PM0712。采用相同的方法對同一養(yǎng)殖場的病料進(jìn)行細(xì)菌的分離、純化和鑒定，最終從肺組織獲得2株多殺性巴氏桿菌分離株；16S rRNA測序發(fā)現(xiàn)，2株分離菌株序列一致，判斷其處于同一進(jìn)化分支，本研究隨機(jī)選擇1株分離菌株作為后續(xù)研究的試驗(yàn)菌株。

方框中為多殺性巴氏桿菌分離株。

M.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1～5. A 型，B 型，型，E 型，F(xiàn) 型。

2.5 血清型鑒定

以多殺性巴氏桿菌莢膜分型引物對分離菌株進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果如圖4所示。

分離菌株P(guān)M0712擴(kuò)增出1 044 bp大小的條帶，與A型多殺性巴氏桿菌目標(biāo)基因預(yù)期大小一致；而其他血清型引物均無條帶擴(kuò)增，表明分離菌株P(guān)M0712為A型多殺性巴氏桿菌。

2.6 MLST分型

對多殺性巴氏桿菌PM0712的管家基因進(jìn)行測序，通過MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，如表2所示，PM0712的7個(gè)管家基因(adk、aroA、deoD、gdhA、g6pd、mdh和pgi)編號分別為2、1、1、1、1、1、3，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的ST3型相匹配。在數(shù)據(jù)庫中下載相關(guān)分離株的MLST信息，如圖5所示，ST3型與ST1、ST2、ST4、ST69、ST70、ST71、ST163、ST165等型匯聚一支，具有較近的親緣關(guān)系。

圖例方框中數(shù)字為同類型分離株數(shù)量。

表2 ST3型多殺性巴氏桿菌的部分信息

2.7 生物被膜試驗(yàn)

如圖6所示，根據(jù)結(jié)晶紫染色法測得分離菌株P(guān)M0712的OD590 nm為0.249 0，而ODc值為0.114 7，表明分離菌株在590 nm處的OD值介于2ODc～4ODc之間，表明分離菌株P(guān)M0712具有中等的生物被膜形成能力。

***表示P<0.001。

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1～23. ptfA，fimA，hsf-1，hsf-2，ptfA，tadD，toxA，sodA，tbpA，sodC，nanB，nanH，hgbA，exbB，exbD，tonB，F(xiàn)ur，hgbB，ompA，ompH，oma87，plpB，pmHAS。

2.8 致病性試驗(yàn)

2.8.1 毒力基因檢測

采用PCR的方法對多殺性巴氏桿菌分離株P(guān)M0712攜帶的毒力基因進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7所示，分離菌株P(guān)M0712共攜帶17種毒力基因，表明PM0712的毒力型為ptfA+、fimA+、hsf-2、+pfhA+、tadD+、sodA+、sodC+、nanH+、hgbA+exbB+、exbD+、Fur+、ompA+、ompH+、oma87+、plpB+、pmHAS+。

2.8.2 小鼠致病性試驗(yàn)

分離菌株P(guān)M0712以不同濃度腹腔注射試驗(yàn)組小鼠后，小鼠出現(xiàn)精神不振、呼吸急促、被毛凌亂等臨床癥狀，以高濃度組最為顯著；1.6×108CFU/mL組小鼠在攻毒后4.5 h內(nèi)全部死亡；1.6×106CFU/mL組小鼠在攻毒后7 h后開始出現(xiàn)死亡，在攻毒后16.5 h內(nèi)全部死亡；1.6×104CFU/mL組小鼠在攻毒后16 h后小鼠開始出現(xiàn)死亡，在攻毒24.5 h內(nèi)小鼠全部死亡；1.6×102CFU/mL組小鼠在攻毒后48 h內(nèi)死亡8只；1.6×101CFU/mL小鼠在攻毒后50 h內(nèi)死亡2只，在攻毒5 d后未死亡小鼠精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)；對照組小鼠未見異常(圖8B)。

圖8 小鼠生存曲線

根據(jù)攻毒后小鼠死亡情況，統(tǒng)計(jì)分離菌株P(guān)M0712的半數(shù)致死量(LD50)為1.6×101CFU/mL。剖檢發(fā)現(xiàn)，死亡小鼠的肺臟病變明顯，出現(xiàn)肺部腫大、出血和肺間質(zhì)增寬；肝臟腫大，邊緣梗死；脾臟、腎臟有不同程度的腫大、壞死，局部有出血(圖9)。

圖9 攻毒小鼠的臟器病變觀察

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1～5. 心臟，肝臟，脾臟，肺臟，腎臟，-為陰性對照，+為陽性對照。

M. DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)；1～21. 分別為bla-SHV，bla-IMP，ermA，ermC，lunA，tet(A)，tet(G)，tetC，dfrA5，dfrA7，dfrA13，SulⅠ，SulⅡ，sul3，blaOXA，blaCTX，tetB，bla-TEM，bla-DHA，tet(H)和tet(R)。

無菌采集死亡小鼠病變組織進(jìn)行病原菌的分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)從死亡小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中均可檢測和分離到致病菌(圖10)，經(jīng)PCR檢測和測序鑒定，分離的菌株與攻毒菌株一致，表明分離菌株P(guān)M0712具有較強(qiáng)的致病性。

2.9 藥物敏感性檢測

2.9.1 抗菌藥物藥敏試驗(yàn)

金黃色葡萄球菌(ATCC25923)作為質(zhì)控菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，其藥敏試驗(yàn)結(jié)果在質(zhì)控規(guī)定范圍內(nèi)；分離株P(guān)M0712的藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，其對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氯霉素、氨芐西林、阿莫西林、頭孢氨芐、頭孢咪唑、頭孢拉定、慶大霉素等10種藥物敏感，對氯霉素、頭孢呋辛、丁胺卡那、氧氟沙星為中介，對四環(huán)素和克林霉素耐藥。

表3 分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.9.2 耐藥基因檢測

分離株P(guān)M0712的耐藥基因檢測結(jié)果顯示，PM0712攜帶tetC、dfrA13、SulⅡ和bla-TEM等4種耐藥基因(圖11)。

2.9.3 中藥抑制試驗(yàn)

16種中草藥對多殺性巴氏桿菌分離菌株P(guān)M0712的抑菌效果如表4所示，黃連和烏梅對分離菌株P(guān)M0712的抑菌效果最好，黃連和烏梅抑菌圈直徑分別為17 mm和14 mm，為中度敏感；其他中藥對分離菌株P(guān)M0712無抑制作用。

表4 中藥抑制試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

多殺性巴氏桿菌在世界范圍內(nèi)廣泛流行，是一種人獸共患的條件致病菌，能引起多種畜禽發(fā)生呼吸道疾病和出血性疾病，同時(shí)也威脅著人類健康[20]。豬多殺性巴氏桿菌病引起豬急性、熱性傳染病，對生豬養(yǎng)殖業(yè)危害較大[21]。研究表明，在豬多殺性巴氏桿菌5種莢膜血清型中，A型為近年來中國豬群中主要流行的莢膜血清型[22]。本研究從病豬肺組織中分離到一株豬多殺性巴氏桿菌，經(jīng)莢膜抗原分析確定分離株為血清型A型，這也與彭忠等[23]和席曉劍等[24]流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國豬源Pm主要以莢膜A型和D型為主的結(jié)果相一致。多位點(diǎn)序列分析進(jìn)一步確定豬多殺性巴氏桿菌為ST3型。目前已知的多殺性巴氏桿菌為ST3型均分布在國外，來源于豬和牛的肺組織，本研究系國內(nèi)首次分離到豬源ST3型豬多殺性巴氏桿菌，提示豬多殺性巴氏桿菌存在跨區(qū)域流行的風(fēng)險(xiǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，A型豬多殺性巴氏桿菌病普遍具有較強(qiáng)的致病性，部分豬場因A型菌株導(dǎo)致病死率高達(dá)70%[23]。本研究多殺性巴氏桿菌分離菌株P(guān)M0712人工感染小鼠后出現(xiàn)明顯的致病性，即使在攻毒劑量為1.6×104CFU/mL時(shí)，小鼠也在攻毒后24 h左右全部死亡；試驗(yàn)組死亡小鼠剖檢可見肺組織明顯腫大、出血，肝臟、腎臟和心臟也出現(xiàn)明顯病變，這一結(jié)果與臨床發(fā)病豬的癥狀和內(nèi)臟病變比較吻合，也與已報(bào)道的豬源A型分離株感染小鼠出現(xiàn)肺臟、肝臟出血等多器官損傷的病變情況相似[25-26]。統(tǒng)計(jì)分離菌株的半數(shù)致死量為1.6×101CFU/mL，同時(shí)從死亡小鼠的脾臟、肺臟、肝臟等器官中均可分離到攻毒菌株，印證了具有較強(qiáng)致病性的豬源PM0712菌株與六盤水某養(yǎng)豬場暴發(fā)的呼吸道疾病的關(guān)聯(lián)性。Pm的致病性與其攜帶的毒力因子密切相關(guān)，如脂多糖、莢膜、神經(jīng)氨酸酶和定植因子等，其中莢膜蛋白和脂多糖是其主要的毒力因子[2，7，28]。本研究分離的豬源PM0712菌株的毒力基因篩查發(fā)現(xiàn)，其攜帶ptfA、fim、hsf-2、pfhA、tadD、sodA、sodC、nanH、hgbA、exbB、exbD、Fur、ompA、ompH、oma87、plpB和pmHAS等17種毒力基因，其中ptfA、fimA、hsf-2、pfhA與細(xì)菌的菌毛、黏附和定植因子相關(guān)；hgbA、exbB、tonB、Fur與細(xì)菌的鐵調(diào)節(jié)和獲得蛋白相關(guān)；nanB與細(xì)菌的神經(jīng)氨酸酶相關(guān)；plpB、ompA、oma87與細(xì)菌的外膜蛋白相關(guān)，分離株的毒力譜型與已報(bào)道的豬源分離株具有較高的相似性[27-28]。

藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多殺性巴氏桿菌PM0712對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氯霉素等12種藥物敏感，對四環(huán)素和克林霉素耐藥；分離菌株的藥物敏感性與貢嘎等[29]對藏豬源D型Pm的藥敏試驗(yàn)結(jié)果部分一致，與李天芝等[30]分離的A型Pm的藥敏試驗(yàn)結(jié)果有較大差異，這可能與分離株的血清型、耐藥基因以及不同地區(qū)用藥習(xí)慣有關(guān)。耐藥基因檢測分析發(fā)現(xiàn)，PM0712攜帶耐藥基因tetC、dfrA13、SulⅡ和bla-TEM，其對四環(huán)素類藥物的耐藥性可能與其攜帶的tetC基因有關(guān)。本研究通過結(jié)晶紫染色法發(fā)現(xiàn)PM0712具有中等的生物被膜形成能力，提示分離菌株在抗生素壓力下容易產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，中藥在抗生素治療革蘭陰性菌過程中具有緩解病情降低死亡率的作用[31]。本研究通過中藥體外抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PM0712對中藥黃連和烏梅敏感，研究結(jié)果為下一步開展抗耐藥菌感染的治療和中西聯(lián)合用藥等研究奠定了基礎(chǔ)。結(jié)合豬源ST3型多殺性巴氏桿菌分離株的生物學(xué)特性，生產(chǎn)上應(yīng)加強(qiáng)疫苗免疫，充分考慮細(xì)菌的血清型、流行特點(diǎn)、致病性和耐藥性，兼顧敏感抗生素和中藥的使用，做到精準(zhǔn)用藥和綜合防控。

綜上，本試驗(yàn)分離出一株豬源ST3型多殺性巴氏桿菌，其血清型為A型；該菌攜帶nanH、exbB、hsf-2、pfhA、ptfA、tonB、fimA、hgbA等17種毒力基因，具有中等生物被膜形成能力和較強(qiáng)的致病性，可致感染小鼠肺臟等多個(gè)器官出血、病變，LD50為1.6×101CFU/mL；攜帶tetC、dfrA13、SulⅡ和bla-TEM等4種耐藥基因，對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氯霉素、氨芐西林、阿莫西林等抗生素敏感，對四環(huán)素和克林霉素耐藥，對中藥黃連和烏梅敏感。