替米考星體內(nèi)抑制豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒復(fù)制的效果研究

趙永祥，宋旭，周金柱，范寶超，赫文龍，李彬

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014)

豬繁殖和呼吸障礙綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗稱“藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的一種嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益的豬傳染病。PRRSV可引起懷孕母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)和木乃伊胎等繁殖障礙，公豬精液質(zhì)量下降，仔豬和育肥豬呼吸困難等癥狀，已成為危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的最重要病原之一[1]。

替米考星是一種用于家畜和家禽的新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，對(duì)胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、支原體等均有抑制作用[2]。已有的研究表明，替米考星能夠抑制PRRSV的復(fù)制，且呈劑量依賴性，對(duì)PRRSVⅠ型和Ⅱ型均有抑制效果，還可以減少支原體、細(xì)菌等病原體的繼發(fā)感染[3-6]。國(guó)內(nèi)的研究也表明替米考星可以在體外抑制當(dāng)前流行的PRRSV高致病性毒株和類NADC30毒株在肺泡巨噬細(xì)胞中復(fù)制[7]，而替米考星在豬體內(nèi)抑制PRRSV復(fù)制的效果還有待進(jìn)一步研究。

本研究進(jìn)一步探索了替米考星在豬體內(nèi)抑制PRRSV復(fù)制的效果，研究了飼喂替米考星對(duì)豬感染PRRSV后的臨床表現(xiàn)、病毒血癥、肺臟病毒載量和病死率等方面的影響，以及飼喂替米考星對(duì)PRRSV感染前后仔豬生長(zhǎng)性能的影響，為臨床使用替米考星防控藍(lán)耳病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、藥物、病毒與主要試劑

替米考星預(yù)混劑(泰勇，替米考星含量20%)購(gòu)自禮藍(lán)(上海)動(dòng)物保健有限公司；4周齡健康仔豬(PRRSV、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒抗原和抗體均為陰性)購(gòu)自規(guī)模種豬場(chǎng)；PRRSV高致病性毒株NF分離株由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供；HiScript?反轉(zhuǎn)錄酶、探針?lè)晒舛吭噭┖?AceQ qPCR Probe Master Mix)以及RNA提取試劑盒購(gòu)自諾唯贊生物公司。

1.2 動(dòng)物分組、替米考星飼喂與PRRSV攻毒

如圖1所示，將20頭健康仔豬隨機(jī)分為2組，每組10頭。一組飼喂添加替米考星的飼料(10 kg飼料添加20 g泰勇混勻)，命名為“藥物組”。另一組飼喂不含藥飼料，作為無(wú)藥對(duì)照組。飼喂7 d后，2個(gè)組仔豬均進(jìn)行PRRSV攻毒，每頭豬肌肉注射2 mL病毒液(毒價(jià)105TCID50/mL)。

圖1 試驗(yàn)分組及流程

1.3 體溫監(jiān)測(cè)、采血及稱重

為監(jiān)測(cè)仔豬攻毒后的臨床表現(xiàn)，于攻毒后每天觀察仔豬臨床癥狀并測(cè)量直腸溫度。為檢測(cè)仔豬攻毒后的病毒血癥情況，于攻毒后第5天、第10天采血分離血清，提取RNA，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)血清中病毒拷貝數(shù)。為計(jì)算替米考星對(duì)生產(chǎn)性能的影響，分別于給藥前、攻毒前及剖檢前稱重，計(jì)算日增重。

1.4 剖檢、肺臟采集及組織切片制備

將豬撲殺，剖檢觀察臟器病變情況并拍照記錄，采集適量肺臟組織提取RNA，通過(guò)熒光定量PCR測(cè)定肺臟中PRRSV載量。另外在肺臟的病變與正常組織交界處剪取適量組織，用4%多聚甲醛固定，用于制備肺臟組織病理切片，并進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色。病理切片制備和HE染色方法參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.5 血清及肺臟病毒載量測(cè)定

為測(cè)定病毒血癥，每頭豬取200 μL血清提取RNA；為測(cè)定肺臟病毒載量，稱取1 g肺臟組織樣品，剪碎后加入1 mL PBS進(jìn)行勻漿。組織勻漿后于-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融3次，再離心2 min，然后取300 μL上清液提取RNA。將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV-N基因拷貝數(shù)。熒光定量引物及探針如表1所示。將pCDNA3.1-PRRSV-N真核表達(dá)質(zhì)粒10倍倍比稀釋為不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV-N基因不同拷貝數(shù)的Ct值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算測(cè)得的血清及肺臟樣品中病毒拷貝數(shù)，再換算出1 mL血清或1 g肺臟組織中的病毒載量。RNA提取、cDNA合成以及熒光定量PCR檢測(cè)方法按試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

表1 引物序列

A. 攻毒前日增重變化；B. PRRSV感染后日增重變化。

A. PRRSV感染仔豬的體溫變化；B. PRRSV感染仔豬的病毒血癥水平。

2 結(jié)果

2.1 飼喂替米考星對(duì)仔豬日增重的影響

分別記錄起始體重、攻毒前體重和剖殺時(shí)體重，計(jì)算仔豬平均日增重。結(jié)果顯示，攻毒前7 d，飼料中添加替米考星的試驗(yàn)組仔豬平均日增重為0.176 kg/d，飼料中無(wú)添加組仔豬生長(zhǎng)平均日增重為0.137 kg/d，藥物組仔豬日增重顯著高于無(wú)藥組(圖2A)。攻毒后，所有仔豬體重均呈負(fù)增長(zhǎng)，藥物組仔豬平均日減重0.056 kg/d，無(wú)藥組仔豬平均日減重0.086 kg/d，藥物組日減重低于無(wú)藥組(圖2B)。以上結(jié)果表明飼喂替米考星能夠提升仔豬的生長(zhǎng)性能，并改善PRRSV感染導(dǎo)致的減重現(xiàn)象。

2.2 仔豬攻毒后體溫和病毒血癥檢測(cè)

PRRSV感染后每天測(cè)量仔豬直腸溫度，結(jié)果顯示藥物組在攻毒后第1天和第5天體溫較高，攻毒8 d后逐漸恢復(fù)正常。無(wú)藥組仔豬在攻毒后9 d內(nèi)體溫均高于正常值，且持續(xù)處于較高水平，除第7天外平均體溫均高于藥物組(圖3A)。期間臨床癥狀表現(xiàn)為被毛粗亂、精神萎靡、嗜睡。攻毒后第5天和第10天分別采集仔豬血清，熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV的病毒載量。結(jié)果顯示，無(wú)藥組病毒血癥水平均顯著高于藥物組，且病毒血癥水平在第10天時(shí)較第5天有下降趨勢(shì)(圖3B)。上述結(jié)果表明飼喂替米考星可緩解PRRSV感染導(dǎo)致的體溫升高現(xiàn)象，減輕臨床癥狀，并顯著降低病毒血癥水平。

2.3 仔豬攻毒后的存活率

PRRSV攻毒后無(wú)藥組于第2、7、8、9天分別死亡4頭仔豬，藥物組于攻毒后第8、9天死亡2頭仔豬，藥物組仔豬存活率為80%，無(wú)藥組仔豬存活率為60%。表明飼喂替米考星可降低PRRSV感染導(dǎo)致仔豬死亡率(圖4)。

2.4 仔豬攻毒后肺臟病理變化及病毒載量

剖檢發(fā)現(xiàn)無(wú)藥飼喂組仔豬攻毒后肺臟有明顯病變，表現(xiàn)為腫脹、顯著實(shí)變，部分豬肺臟有出血或纖維樣滲出物；飼喂藥物組仔豬肺臟病變較輕微，稍微腫脹，存在散在實(shí)變。肺臟組織切片經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察顯示，無(wú)藥飼喂組豬肺泡壁明顯增厚、間質(zhì)增寬、肺泡空間狹小；藥物組仔豬肺泡壁輕微增厚，肺泡形態(tài)基本正常。肺臟病變及組織切片結(jié)果見(jiàn)圖5A。采集肺臟組織，提取RNA 通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)肺臟組織中病毒載量，結(jié)果顯示無(wú)藥對(duì)照組仔豬肺臟病毒載量顯著高于藥物組的肺臟病毒載量(圖5B)。上述結(jié)果表明飼喂替米考星能夠減輕肺臟病變，降低肺臟中的病毒載量。

A. 肺臟病變(a、b)及組織切片(c、d)；c、d放大倍數(shù)為100×；B. 肺臟病毒載量。

3 討論

PRRSV給我國(guó)生豬產(chǎn)業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也是影響全球養(yǎng)豬業(yè)最重要的病毒之一，探索PRRS防控措施具有重大意義。目前藍(lán)耳病的防控主要依靠疫苗免疫，由于PRRSV是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，容易發(fā)生變異和重組，使得臨床上不斷出現(xiàn)新的PRRSV毒株，而現(xiàn)有疫苗對(duì)異源毒株的保護(hù)力有限，不能滿足當(dāng)前藍(lán)耳病的防控需求[9-10]。同時(shí)，臨床上PRRSV經(jīng)常與支原體、胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌等存在混合感染，使得防控難度進(jìn)一步加大。在疫苗保護(hù)力不足、細(xì)菌混合感染嚴(yán)重的情況下，使用藥物抗病毒并控制細(xì)菌等病原的繼發(fā)感染，是藍(lán)耳病防控的另一個(gè)重要方向。

替米考星是Elanco研發(fā)的一種畜禽用新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素藥物，對(duì)支原體和多種細(xì)菌具有良好的抑制作用。替米考星口服吸收后肺臟中藥物濃度高，臨床上主要用于治療豬、奶牛和雞等畜禽的呼吸道感染性疾病[11]。已有研究表明替米考星可以抑制PRRSV的復(fù)制，包括Ⅰ型和Ⅱ型PRRSV，之前的體外研究結(jié)果也證實(shí)，替米考星可以有效抑制高致病性PRRSV和類NADC30 PRRSV毒株[7]。本研究進(jìn)一步在動(dòng)物體內(nèi)證實(shí)，替米考星可顯著抑制高致病性PRRSV的復(fù)制，降低病死率。因此替米考星在防控高致病性藍(lán)耳病和細(xì)菌繼發(fā)感染方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。替米考星在動(dòng)物體內(nèi)抑制類NADC30 PRRSV毒株的效果還有待進(jìn)一步研究。

替米考星作為一種新型的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，也具有一定的抗炎作用，研究表明大環(huán)內(nèi)酯類藥物可以調(diào)節(jié)宿主免疫細(xì)胞功能和組織炎癥，包括減少促炎介質(zhì)的積累以及調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞功能和凋亡[12-13]。替米考星還可以增加巨噬細(xì)胞IL-10的合成，可能是替米考星發(fā)揮抗炎作用的另一種機(jī)制[14]。在抗病毒方面，有研究表明替米考星是一種生物堿性藥，自身帶有堿性基團(tuán)，高濃度的替米考星可以改變巨噬細(xì)胞內(nèi)的酸堿度，還可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的趨化性、吞噬能力，提高巨噬細(xì)胞的活化水平，進(jìn)而抑制PRRSV的復(fù)制[15]。本研究中飼喂替米考星的仔豬肺臟炎癥相對(duì)無(wú)藥組顯著減輕，肺臟病毒載量也明顯降低，進(jìn)一步證實(shí)了替米考星的抗炎和抗病毒作用。

綜上，本研究表明飼料中添加替米考星飼喂仔豬可以減輕高致病性PRRSV感染導(dǎo)致的臨床癥狀，抑制血清和肺臟中的病毒復(fù)制，降低病死率，且可以提升日增重，表明替米考星對(duì)于PRRS的防控具有重要意義。