蜂糖李采后病原菌分離鑒定及香芹酚對(duì)病原菌室內(nèi)毒力測(cè)試

羅冬蘭,王小崗,瞿光凡,巴良杰

(貴陽(yáng)學(xué)院,貴陽(yáng),550005)

李(PrunussalicinaLindl),屬于薔薇科(Rosaceae)李屬(Prunus)多年生核果類(lèi)樹(shù)種。近年來(lái),貴州的李種植面積逐漸增加[1-2],其栽培品種較多,主要有蜂糖李、四月李、玫瑰李、姜黃李、脆紅李、青脆李、布朗李、空心李、地方李等[3]。其中,蜂糖李果大甘甜,核小肉多,果面包裹天然蠟粉,質(zhì)地酥脆爽口,果肉致密且香味濃郁,品質(zhì)極優(yōu),市場(chǎng)售價(jià)高,經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[4]。蜂糖李采收于高溫多雨季節(jié),且果實(shí)含糖量高,采后呼吸代謝強(qiáng),果實(shí)貯藏過(guò)程易受機(jī)械損傷和病原微生物侵染,易造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。目前,國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道的李病害主要為褐腐病、炭疽病、黑霉病、黑斑病[3,7-9,10]。其中,美澳型褐腐病菌(Moniliniafructicola)、藤倉(cāng)鐮刀菌(Fusariumfujikuroi)、互隔交鏈孢霉(Alternariaalternata)[11]、膠孢炭疽復(fù)合群(Colletotrichumgloeosporioidesspecies complex)和暹羅炭疽復(fù)合群(C.siamensespecies complex)[12]是李果實(shí)采后主要致病菌。此外,瞿光凡等[13]發(fā)現(xiàn),引起脆紅李采后腐爛的病原菌為灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)和鏈格孢菌(Alternariaalternata)。王友升等[14]對(duì)“安哥諾”“黑琥珀”兩個(gè)李品種果實(shí)采后貯藏期病果進(jìn)行分離鑒定,獲得李果實(shí)在貯藏期內(nèi)的主要病原菌為串珠狀赤霉(Gibberellamoniliformis)、鏈格孢菌(Alternariaalternata)、草酸青霉(Penicilliumoxalicum)和塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)。但關(guān)于蜂糖李采后病原菌研究未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

香芹酚(carvacrol,CV)是天然植物精油中具有活性成分的一種單萜酚,具有廣譜抑菌性、安全性高、無(wú)污染等特性,被廣泛應(yīng)用于果蔬采后保鮮[15]。已有大量研究表明,香芹酚可通過(guò)破壞真菌細(xì)胞膜、細(xì)胞壁以及能量代謝平衡,影響膜脂代謝和能量代謝途徑,從而發(fā)揮抗菌作用[16-17];此外,香芹酚還可通過(guò)抑制真菌DNA、RNA、脂類(lèi)和蛋白質(zhì)等生物合成、相關(guān)基因表達(dá)及阻遏真菌產(chǎn)毒基因表達(dá),使相關(guān)代謝調(diào)控紊亂,最終使真菌細(xì)胞因不能正常進(jìn)行生理代謝而凋亡[18-19]。

本研究通過(guò)對(duì)貯藏期蜂糖李病果病原菌進(jìn)行分離鑒定,并進(jìn)一步探究不同濃度香芹酚對(duì)病原菌的體外抑制效果及進(jìn)行室內(nèi)毒力評(píng)價(jià),以期為蜂糖李采后病害防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂糖李果實(shí):2023年6月采摘于安順市鎮(zhèn)寧布依族苗族自治縣六馬鎮(zhèn),七八成成熟。采后常溫放置至果面品質(zhì)劣變,果面逐漸有絲狀物質(zhì)且其生長(zhǎng)面積逐漸擴(kuò)大,最終腐爛發(fā)病(見(jiàn)圖1),再進(jìn)行果面似菌物質(zhì)分離鑒定。香芹酚(純度99%,分子量150):江西海瑞天然植物有限公司。引物ITS1和ITS4、DNA Marker C、DNA提取試劑盒、雙蒸水(ddH2O):生工生物工程(上海)股份有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextroseagar,PDA):上海博微生物科技有限公司。

圖1 蜂糖李采后常溫狀態(tài)下自然發(fā)病狀況

1.2 儀器與設(shè)備

ChemiDoc免染型蛋白印跡成像系統(tǒng):成都百樂(lè)科技有限公司。CX21 光學(xué)顯微鏡:日本奧林斯有限公司。LRH-250F生化培養(yǎng)箱:上海一恒科學(xué)儀器有限公司。YM-50立式壓力蒸汽滅菌器:上海三申醫(yī)療器械有限公司。SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離與純化 采用組織分離法對(duì)采后自然發(fā)病蜂糖李果實(shí)進(jìn)行病原菌分離純化。首先將所有在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上用到的金屬工具統(tǒng)一120 ℃高溫滅菌20 min,再進(jìn)行下一步試驗(yàn)。將病果置于75%酒精中浸泡30 s后取出,立即用無(wú)菌水沖洗3次并置于超凈工作臺(tái)中,待其自然晾干。用手術(shù)刀切取病健交界處組織放于PDA培養(yǎng)基中,于(28±0.5) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待平板上長(zhǎng)出不同的菌落形態(tài)時(shí),進(jìn)行不同種菌落形態(tài)純化,通常分離頻率約3次,可根據(jù)菌落生長(zhǎng)狀況進(jìn)行多次分離,直至得到單一菌落。純化菌株部分凍存,其余用于試驗(yàn)。

1.3.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將純化菌株以菌餅方式重新接種至新培養(yǎng)基,置于(28±0.5)℃恒溫培養(yǎng),并觀察菌株生長(zhǎng)狀況以及菌落特征,拍照記錄。結(jié)合菌株在光學(xué)顯微鏡下菌絲、孢子梗及分生孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行種屬初步鑒定。

1.3.3 病原菌致病性檢測(cè) 選取光澤度好、硬度適中、成熟健康無(wú)病蟲(chóng)害及無(wú)機(jī)械損傷的果實(shí),分別進(jìn)行有傷(利用美工刀小刀片輕劃果實(shí)表面,形成大小約4 mm長(zhǎng)的十字小口,再用孔徑為5 mm的打孔器,去除果皮,最后形成大小約5 mm的圓形傷口)和無(wú)傷接種法接種分離菌株后,觀察果實(shí)發(fā)病情況,以檢測(cè)分離菌株是否致病;經(jīng)過(guò)人工將分離菌株轉(zhuǎn)導(dǎo)(利用直徑為5 mm的打孔器取若干菌餅,最后將菌餅接種至果實(shí)表面)至果實(shí)果皮,引發(fā)果實(shí)快速發(fā)病并出現(xiàn)不同程度發(fā)病現(xiàn)象,以檢測(cè)分離菌株致病性強(qiáng)弱。對(duì)挑選好的蜂糖李果實(shí),用蒸餾水快速清洗表面1次,再75%酒精擦拭消毒,用無(wú)菌水沖洗3次后,置于超凈工作臺(tái)中,自然晾干,用直徑為5 mm無(wú)菌打孔器取菌餅接種,每種分離菌株重復(fù)3個(gè)果。接種后果實(shí)置于(25±0.5) ℃、相對(duì)濕度85%～95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天定時(shí)記錄發(fā)病情況。待果實(shí)發(fā)病后,再次進(jìn)行病原菌分離純化,若與接種病原菌一致,則進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.4 病原菌ITS標(biāo)記鑒定 取適量菌絲體于無(wú)菌研缽中,用液氮研磨至粉末狀待用。利用北京索萊寶真菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行病原菌基因組總DNA提取。采用真菌通用引物 ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和 ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)進(jìn)行病原菌rDNA-ITS序列擴(kuò)增。制作成50 μL反應(yīng)體系,該體系需包含2×Taq PCR Master Mix 25 μL,DNA模板1 μL,10 mmoL/L ITS1 2 μL,10 mmoL/L ITS4 2 μL,ddH2O 20 μL。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(poly-merase chain reaction,PCR)擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,獲取同源性高的菌株序列,采用MEGA 7軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),并結(jié)合病原菌形態(tài)特征對(duì)其進(jìn)行最終鑒定。

1.3.5 香芹酚對(duì)病原菌室內(nèi)毒力測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行測(cè)定。分別稱取不同質(zhì)量香芹酚加入到滅菌PDA培養(yǎng)基中,充分搖勻,使每個(gè)平板PDA培養(yǎng)基中香芹酚濃度分別為100、150、200、250和300 μg/mL,對(duì)照(CK)不加香芹酚,待培養(yǎng)基冷卻后備用。在無(wú)菌超凈工作臺(tái)上,用直徑5 mm滅菌打孔器打取菌餅,接種到PDA平板中央。每個(gè)濃度重復(fù)3次。于(28±0.5) ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察,待對(duì)照(CK)平板菌落長(zhǎng)滿平板時(shí),采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并記錄數(shù)據(jù)。抑菌率的計(jì)算公式如下:抑菌率/%=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑)×100。采用Excel 2021軟件以香芹酚濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),抑菌率為縱坐標(biāo),計(jì)算毒力方程。在Graph Pad prism 8 軟件中,將抑菌率轉(zhuǎn)變?yōu)楦怕手岛笞鳛榭v坐標(biāo),將質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo),計(jì)算出半最大有效濃度(half-maximal effective concentration,EC50)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

從蜂糖李采后自然發(fā)病果實(shí)上分離的菌株,根據(jù)其在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)形態(tài)和在顯微鏡下孢子梗以及分生孢子形態(tài)特征(見(jiàn)圖2),可分為5種。其中,PL-1菌株,其菌落整體為淺棕色、中心部分呈現(xiàn)淡黃色,隨著菌落直徑擴(kuò)大,顏色逐漸變淡,菌落邊緣處紫灰色較為明顯且菌絲短而稀疏。PL-2菌株,菌絲生長(zhǎng)茂盛,菌絲較長(zhǎng)、似棉花狀;菌落呈米白色,隨著生長(zhǎng)時(shí)間增長(zhǎng),菌落會(huì)分泌似水珠液體。PL-3菌株,菌落較為稀疏且無(wú)規(guī)律性間隔,菌絲短而絨,菌落中間灰白色、外圍呈現(xiàn)灰綠色。PL-4菌株,菌落分布較為規(guī)律且均勻,菌絲呈現(xiàn)灰米白色,隨著菌落直徑不斷擴(kuò)大,菌絲顏色逐漸變淡,菌絲由米白色變成淺灰色。PL-5菌株,菌落分布較為均勻,主要以圓形態(tài)均勻分布在培養(yǎng)皿中,呈現(xiàn)灰白色菌絲,菌絲極短似“粉末”狀。

圖2 蜂糖李采后自然發(fā)病果實(shí)各分離菌株的形態(tài)特征(菌落形態(tài)、孢子梗以及孢子形態(tài))

2.2 病原菌致病性檢測(cè)

從圖3可以看出,與其他4株菌相比,PL-1和PL-3創(chuàng)傷接種,48 h(2 d)后蜂糖李發(fā)病明顯,其中PL-1果實(shí)表面出現(xiàn)灰白色絨毛狀菌絲,菌絲發(fā)達(dá)、質(zhì)地干燥易挑;但是,該菌無(wú)傷接種后第6天蜂糖李果實(shí)局部病變。由此可推斷,PL-1在傷口處發(fā)病較快,但是對(duì)無(wú)損傷的健康果實(shí)致病力較弱。PL-2致病力較弱,有傷接種48 h(2 d)后逐漸發(fā)病,在第4天時(shí)果實(shí)發(fā)病癥狀明顯且蜂糖李果實(shí)表皮開(kāi)始破裂;無(wú)傷接種,在第6天果實(shí)局部褐變發(fā)病。PL-3經(jīng)過(guò)創(chuàng)傷接種后果實(shí)發(fā)病,且發(fā)病與正常果實(shí)發(fā)病癥狀一致,即果皮裂開(kāi)并伴有水漬;無(wú)傷接種果實(shí)也發(fā)病,但發(fā)病較為遲緩。PL-4創(chuàng)傷接種后,菌絲顏色和菌落特征和培養(yǎng)皿上一致,且隨著果實(shí)發(fā)病果皮裂開(kāi),果實(shí)逐漸變軟;無(wú)傷接種致病一致,但發(fā)病遲緩。PL-5無(wú)傷接種與創(chuàng)傷接種發(fā)病癥狀一致,創(chuàng)傷接種發(fā)病更快,接種部位出現(xiàn)凹陷并產(chǎn)生褐斑,且病斑面積隨培養(yǎng)時(shí)間加長(zhǎng)而增大。綜上,蜂糖李采后貯藏過(guò)程中,完整無(wú)損的果面對(duì)果實(shí)整體具有一定保護(hù)作用,若被病原菌侵染發(fā)病較為遲緩,一旦果皮有傷口或劃痕將導(dǎo)致果實(shí)被外源病原菌快速侵染且發(fā)病較快,不利于果實(shí)貯藏。

圖3 蜂糖李采后自然發(fā)病果實(shí)分離菌株在健康果實(shí)上創(chuàng)傷或無(wú)損接種后的致病性

2.3 病原菌ITS鑒定

分離菌株用ITS基因通用引物擴(kuò)增后,對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序得到菌株核酸序列,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行BLAST,選取同源性較高的菌株序列用MEGA 7的Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明,菌株P(guān)L-1與Moniliniapolystroma(基因登錄號(hào):NR_154198.1)同源性100%,菌株P(guān)L-2與Bjerkanderaecuadorensis(基因登錄號(hào):NR_174062.1)同源性99%,菌株P(guān)L-3與Penicilliumexpansum(基因登錄號(hào):NR_077154.1)同源性100%,菌株P(guān)L-4與Flavodonambrosius(基因登錄號(hào):NR_154000.1)同源性100%(如圖4-A所示)。菌株P(guān)L-5與Penicilliumitalicum(基因登錄號(hào):NR_163528.1)同源性100%(如圖4-B所示)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征,判定引起蜂糖李采后腐爛的主要病原菌分別為多子座鏈核盤(pán)菌M.polystroma(PL-1)、煙管屬真菌B.ecuadorensis(PL-2)、擴(kuò)展青霉P.expansum(PL-3)、黃囊孔菌F.ambrosius(PL-4)以及意大利青霉P.italicum(PL-5)。

圖4 蜂糖李采后自然發(fā)病果實(shí)分離菌株基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 香芹酚對(duì)蜂糖李采后病原菌室內(nèi)毒力

從表1可以看出,當(dāng)香芹酚濃度在100～300 μg/mL范圍內(nèi)時(shí),對(duì)蜂糖李采后各病原菌的抑菌率分別為6.73%～80.21%、22.70%～60.66%、20.11%～80.07%、70.09%～91.19%以及65.61%～85.74%。其中,擴(kuò)展青霉P.expansum對(duì)香芹酚較為敏感,而黃囊孔菌F.ambrosius對(duì)香芹酚較為遲鈍;300 μg/mL香芹酚對(duì)多子座鏈核盤(pán)菌M.polystroma和煙管屬真菌B.ecuadorensis菌絲生長(zhǎng)的抑菌率差異無(wú)顯著性(p>0.05),其余菌之間均存在顯著性差異(p<0.05)。從毒力回歸方程及EC50可知,擴(kuò)展青霉P.expansum對(duì)香芹酚的敏感性最高,EC50為52.4 μg/mL,其他依次為意大利青霉P.italicum、煙管屬真菌B.ecuadorensis、多子座鏈核盤(pán)菌M.polystroma、黃囊孔菌F.ambrosius,EC50分別為55.8、169.9、212.1和227.5 μg/mL。

表1 香芹酚對(duì)蜂糖李采后病原菌菌絲生長(zhǎng)的體外抑制效果及毒力回歸方程

3 討論

蜂糖李是李屬的一種呼吸躍變型果實(shí),多在夏季高溫季節(jié)采收,果實(shí)含水量高、皮薄,易受微生物侵染而腐爛變質(zhì),從而造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[20]。本研究從蜂糖李采后自然貯藏發(fā)病果實(shí)中分離鑒定出5株病原菌。其中,多子座鏈核盤(pán)菌M.polystroma最早發(fā)現(xiàn)于歐洲,隨后在意大利的梨、葡萄和蘋(píng)果中相繼被發(fā)現(xiàn)報(bào)道[21-24],Spitaler等[25]研究發(fā)現(xiàn)該菌還引起木瓜發(fā)生褐腐病,李志偉等[26]研究發(fā)現(xiàn)在桃果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育期至成熟期和采后貯運(yùn)期該菌均可侵染而引發(fā)褐腐病。擴(kuò)展青霉P.expansum和意大利青霉P.italicum能夠引起新鮮核桃和柑桔發(fā)霉軟爛,發(fā)生青(綠)霉病,是果蔬常見(jiàn)的病原菌,嚴(yán)重影響果蔬品質(zhì)[27-29]。李樹(shù)成等[30]從采后翠冠梨果實(shí)中分離鑒定獲得擴(kuò)展青霉P.expansum是引起采后翠冠梨果實(shí)腐爛的主要病原菌之一。肖媛[31]鑒定出沙糖桔酸腐病的致病菌是意大利青霉P.italicum。煙管屬真菌B.ecuadorensis和黃囊孔菌F.ambrosius首次在蜂糖李果實(shí)中被發(fā)現(xiàn)。

多子座鏈核盤(pán)菌M.polystroma引起蜂糖李發(fā)生褐腐病。Goncalves等[32]研究發(fā)現(xiàn)用4.5%Copernicia cerifera蠟(巴西棕櫚蠟)對(duì)李果實(shí)進(jìn)行涂膜,顯著降低了貯藏期李褐腐病的發(fā)生,有效維持了果實(shí)品質(zhì)。凡先芳等[33]研究發(fā)現(xiàn),將1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)結(jié)合戊唑醇在適宜濃度下處理青脆李,能夠顯著控制貯藏期褐腐病的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn),在體外,香芹酚能夠抑制M.polystroma菌絲生長(zhǎng),且隨濃度呈現(xiàn)依賴性效應(yīng),當(dāng)香芹酚濃度為300 μg/mL時(shí),抑菌率可達(dá)80.21%。

通過(guò)對(duì)擴(kuò)展青霉P.expansum抑制研究發(fā)現(xiàn),70 mg/mL銀杏黃酮能較好地抑制擴(kuò)展青霉生長(zhǎng)[34]。咪鮮胺能夠提高細(xì)胞膜通透性,抑制P.italicum生長(zhǎng)發(fā)育[35]。在研究中,隨著香芹酚濃度增加,P.expansum和P.italicum菌落生長(zhǎng)均呈藥劑依賴性效應(yīng),300 μg/mL香芹酚對(duì)2株菌的抑菌率達(dá)91.19%和85.74%,能夠較好地抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)。有研究表明,香芹酚能夠有效抑制炭疽菌生長(zhǎng)發(fā)育,損傷沖繩炭疽菌(Colletotrichumokinawense)菌絲形態(tài)并對(duì)其可溶性蛋白和呼吸能量代謝等具有一定影響,有效抑制真菌病原菌的菌絲生長(zhǎng)[36];香芹酚處理降低楊梅果實(shí)腐爛指數(shù),抑制楊梅致病菌霉菌和酵母菌生長(zhǎng)[37]。100 μl/L的反式-2-己烯醛能較好抑制青霉生長(zhǎng),顯著降低擴(kuò)展青霉P.expansum對(duì)獼猴桃果實(shí)硬度、可滴定酸、維生素C的影響,極顯著降低了染菌果實(shí)腐爛率,較好地保持了果實(shí)品質(zhì)[38]。反式肉桂醛通過(guò)損傷意大利青霉Pitalicum細(xì)胞膜,導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)、鉀離子等細(xì)胞內(nèi)容物質(zhì)泄漏,破壞線粒體正常功能,引發(fā)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到良好的抑菌效果[39]。

煙管屬真菌B.ecuadorensis和黃囊孔菌.ambrosius侵染蜂糖李果實(shí)后,病斑不斷擴(kuò)大,嚴(yán)重時(shí)果皮裂開(kāi)并伴有水漬,導(dǎo)致采后蜂糖李果實(shí)軟化褐變并腐爛衰敗。體外試驗(yàn)表明,香芹酚對(duì)這2株菌具有明顯抑菌能力,300 μg/mL香芹酚的抑菌率分別為80.07%和60.66%,EC50分別為169.9和227.5 μg/mL,B.ecuadorensis對(duì)香芹酚較為敏感。在其他果實(shí)病原菌研究中,未見(jiàn)有關(guān)B.ecuadorensis和F.ambrosius的報(bào)道。

4 結(jié)論

采用組織分離法、致病性檢測(cè)、形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合分子生物學(xué)鑒定,明確引起蜂糖李采后貯藏期腐爛的病原菌包括擴(kuò)展青霉Penicilliumexpansum、意大利青霉P.italicum、多子座鏈核盤(pán)菌Moniliniapolystroma、黃囊孔菌Flavodonambrosius和煙管屬真菌Bjerkanderaecuadorensis。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定發(fā)現(xiàn),香芹酚對(duì)這5株病原菌具有較好的抑制效果,當(dāng)香芹酚濃度為300 μg/mL時(shí),對(duì)5株菌抑菌率的依次為91.19%、85.74%、80.21%、60.66%和80.07%,其EC50依次為52.4、55.8、212.1、227.5和169.9 μg/mL。因此,天然植物精油香芹酚可作為蜂糖李采后貯藏期病害防控的一種有效防治藥劑。