不同來源多酚對奶牛瘤胃體外營養(yǎng)物質(zhì)降解率和甲烷產(chǎn)量的影響

滕戰(zhàn)偉,陳秋楠,王笑笑,張黎杰,張寧寧,常美楠,夏小靜,賀永惠*,高騰云*

(1.河南科技學(xué)院 動物科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院,河南 鄭州 450046;3.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物科技學(xué)院,河南 鄭州 450046)

中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號公告指出于2020年底全面禁止飼料抗生素使用,無抗時代已經(jīng)到來。尋求安全有效的抗生素替代品,實施“無抗與綠色低碳養(yǎng)殖”,是我國畜牧業(yè)亟待解決的問題。天然植物活性物質(zhì)具有種類多、無藥物殘留和刺激小等優(yōu)點,是實現(xiàn)畜禽安全健康生產(chǎn)的重要紐帶。植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的具有酚醛基的次級代謝物,其包含的范圍較廣,從簡單結(jié)構(gòu)的酚醛樹脂(鞣花酸和沒食子酸)到二聚或低聚物(原花青素)甚至是高分子的聚合物(單寧酸)[1]?？蒲泄ぷ髡邍@多酚的應(yīng)用開展了大量科學(xué)研究,發(fā)現(xiàn)多酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎及促進動物健康生產(chǎn)的功能[2-3]。

反芻動物以甲烷(CH4)形式損失的能量占總攝入能的8%～14%,從而降低飼糧的利用效率,并加劇溫室效應(yīng)[4]。反芻動物產(chǎn)生的CH4約85%來自于瘤胃發(fā)酵,瘤胃內(nèi)CH4的生成主要是產(chǎn)甲烷菌轉(zhuǎn)化的結(jié)果[5]。一項薈萃分析(數(shù)據(jù)包含體內(nèi)、體外30個試驗共171個處理)研究發(fā)現(xiàn),無論采用何種方式,單寧的添加均能減少CH4生成,并且體外試驗?zāi)軌蝾A(yù)測體內(nèi)試驗CH4產(chǎn)量[6]。進一步分析發(fā)現(xiàn),單寧能夠抑制產(chǎn)甲烷菌,從而減少CH4的排放[7]。但由于單寧具有廣譜的抑菌性,會導(dǎo)致反芻動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率降低[8]。另有研究同樣表明多酚類物質(zhì)可以減少CH4排放[9],但多酚的使用劑量和不同來源的特異性效應(yīng)仍有待闡明[10]。

基于上述思考,本試驗選擇綠原酸、單寧酸、茶多酚和褐藻多酚為研究對象,通過體外培養(yǎng)法分析其對奶牛瘤胃體外CH4生成和飼料降解率的影響,擬篩選出一種既能降低CH4排放又可提高飼料降解率的多酚,為多酚在反芻動物生產(chǎn)中的精準應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料選取花生秧作為發(fā)酵底物,花生秧取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧試驗站?；ㄉ碜匀伙L(fēng)干后采用錘片式粉碎機進行粉碎,過0.5 mm篩,裝于樣品袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

所選用多酚的基本信息如下:綠原酸(上海源葉生物科技有限公司,98%)、單寧酸(西亞試劑,98%)、茶多酚(西亞試劑,GR級)和褐藻多酚(山東潔晶集團贈予)。

1.2 試驗設(shè)計采用體外培養(yǎng)法研究不同來源多酚對奶牛瘤胃CH4產(chǎn)量和營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響。體外培養(yǎng)體系為150 mL,準確稱取2 g花生秧粉作為發(fā)酵底物。選取4種不同來源的多酚:綠原酸、單寧酸、茶多酚和褐藻多酚,每種多酚添加水平為發(fā)酵底物干物質(zhì)(DM)質(zhì)量的0%,1%,2%,3%和4%。采用單因素試驗設(shè)計,每個處理設(shè)置5個重復(fù),每批次發(fā)酵時設(shè)置5個空白用以校正產(chǎn)氣量和CH4產(chǎn)量(空白組僅加入人工瘤胃緩沖液,不添加底物和多酚)。體外培養(yǎng)24 h停止發(fā)酵。

1.3 模擬瘤胃緩沖液構(gòu)成瘤胃緩沖液參考MENKE等[11]的方法進行配制,瘤胃緩沖液共包括5部分,具體組成如表1所示。試驗當(dāng)天,按照表2所示的比例進行瘤胃緩沖液的配制,將配制好的瘤胃緩沖液置于39℃恒溫水浴鍋中水浴,并持續(xù)通入CO2,直到溶液顏色由淡藍色轉(zhuǎn)為無色,即刻使用。

1.6.2CH4產(chǎn)量測定 采用集氣袋收集氣體,用氣相色譜儀進行CH4含量的測定。具體測定步驟參考孫凱佳[12]的方法進行。

德育課其實是一門促進學(xué)生形成正確世界觀、人生觀和價值觀的課程，是學(xué)生生動活潑地主動參與探究從而獲得人生經(jīng)驗或指導(dǎo)思想的課程，是一門真正關(guān)注個人全面發(fā)展的課程。教師在進行教學(xué)設(shè)計時要充分利用中職生的觸覺型與合作型學(xué)習(xí)風(fēng)格特點，發(fā)揮學(xué)生學(xué)習(xí)潛能。

⑤中小河流洪水和山洪災(zāi)害防御能力不高。松花江、黑龍江流域中小河流堤防防洪標準低，很多河段處于不設(shè)防狀態(tài)；諾敏河、綽爾河等一些較大支流尚未建成骨干控制性工程，洪水調(diào)蓄能力不足。山洪災(zāi)害防治體系還不完善，防御能力仍顯不足。2013年松花江、黑龍江流域因洪澇災(zāi)害死亡人員基本都是由局地強降雨引發(fā)中小河流洪水或山洪災(zāi)害造成的。

1.6 測定指標和方法

1.6.4常規(guī)營養(yǎng)成分指標的測定 尼龍袋過濾出的殘渣為發(fā)酵后的飼料樣品,65℃烘干后,參照AOAC[14]的方法測定飼料中DM的含量,參照VAN SOEST等[15]的方法測定飼料中NDF和ADF的含量。待測營養(yǎng)成分的降解率按如下公式進行計算:

愛國主義是對祖國的忠誠和熱愛，是中華民族精神的核心，是中國人民的行為準則體系。新時代愛國主義的本質(zhì)體現(xiàn)為愛國和愛黨、愛社會主義的有機統(tǒng)一，新時代愛國主義的鮮明主題是實現(xiàn)中華民族偉大復(fù)興的中國夢，新時代愛國主義的突出特征是愛國情懷和改革精神、世界眼光相結(jié)合。

GP=p×(v-10)/(101.3×w)

其中,GP為培養(yǎng)瓶中實際產(chǎn)氣量(mL);p為壓力表的實際壓力值(kPa);v為發(fā)酵瓶的體積(mL);w為發(fā)酵底物的質(zhì)量(g)。

1.4 瘤胃液的供體動物及采集試驗所用瘤胃液取自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧試驗站3頭裝有永久性瘤胃瘺管的荷斯坦奶牛,在試驗當(dāng)天晨飼前2 h從3頭瘺管牛瘤胃內(nèi)的不同位置采集瘤胃液,將采集的瘤胃液立即裝入充滿CO2的保溫飯盒中(提前預(yù)熱至39℃)并迅速帶回實驗室。瘤胃液使用前,在厭氧箱中經(jīng)4層紗布過濾到燒杯中,然后將其置于39℃恒溫水浴鍋中保存,并持續(xù)通入CO2保證其處于厭氧環(huán)境。

1.6.1總產(chǎn)氣量測定 在每批次培養(yǎng)24 h后終止發(fā)酵。用精密壓力表(陜西美控電子科技有限公司,中國 西安)測定培養(yǎng)瓶的氣體壓力,并按照以下公式計算每個試驗組的總產(chǎn)氣量(GP):

按照鐘昕[8]方法測定裂褶多糖的重均分子量(Mw)、數(shù)均分子量(Mn)和分散系數(shù)(Mw/Mn)。采用Astra軟件進行數(shù)據(jù)分析。

高職教育是一種跨界教育，教師核心素養(yǎng)和能力的培養(yǎng)需要“政校行企”四方的聯(lián)合培養(yǎng)，學(xué)校和企業(yè)需要參與教師的培養(yǎng)，在監(jiān)督方面存在一定嫌疑。對此，行業(yè)應(yīng)該發(fā)揮出考核官的作用，有效地監(jiān)督高職院校教師核心素養(yǎng)和能力建設(shè)的情況。目前，隨著教學(xué)改革以及人才培養(yǎng)需求的不斷提升，高職院校的校企合作工作有了一定的進展，不斷完善合作過程中的各種細節(jié)。然而，對高職教師核心素養(yǎng)和能力建設(shè)監(jiān)督方面，行業(yè)并沒有起到明顯的監(jiān)督作用。行業(yè)發(fā)展規(guī)劃中并沒有涉及職業(yè)教育教師能力的培養(yǎng)，缺乏對教師核心素養(yǎng)、能力和行業(yè)人才教育之間關(guān)系的梳理。行業(yè)應(yīng)該把高職院校教師核心素養(yǎng)和能力作為企業(yè)認證的重要指標之一，加大校企雙方合作的力度。

被測定成分的降解率=(降解前底物的質(zhì)量×被測成分的含量-降解后殘渣的質(zhì)量×被測成分的含量)/(降解前底物的質(zhì)量×被測成分的含量)×100%。

1.6.3瘤胃發(fā)酵狀態(tài)指標測定 pH測定,打開瓶蓋后,用尼龍袋將發(fā)酵液過濾到燒杯中,用pH計立即測定發(fā)酵液的pH;氨態(tài)氮(NH3-N)的測定參考WEATHERBURN[13]的方法進行。

1.5 瘤胃液的接種將瘤胃液與緩沖溶液按體積比1∶2混合均勻后,準確量取150 mL混合液加入到每個培養(yǎng)瓶中(操作過程中需通入CO2,以保證厭氧環(huán)境),然后立即用壓蓋鉗將膠塞和鋁蓋壓緊并用封口膜封住。將培養(yǎng)瓶置于39℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行發(fā)酵,期間每隔2 h晃動一下培養(yǎng)瓶。

2 結(jié)果

2.1 不同來源多酚對奶牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)和CH4生成的影響多酚對奶牛體外發(fā)酵參數(shù)和CH4生成的影響結(jié)果如表3所示。由表3可知,與對照組相比,添加不同水平的茶多酚均能顯著降低產(chǎn)氣量(GP)和CH4產(chǎn)量(P<0.05),當(dāng)茶多酚添加水平為4%時顯著降低NH3-N的含量(P<0.05)。單寧酸添加水平為1%時顯著降低CH4產(chǎn)量(P<0.05),而單寧酸添水平為4%時,GP和CH4產(chǎn)量顯著提高(P<0.05)。褐藻多酚添加水平為4%時顯著降低NH3-N的含量(P<0.05)。綠原酸添加水平為2%,3%和4%時顯著提高GP產(chǎn)量(P<0.05),添加水平為2%時提高了CH4產(chǎn)量(P<0.05),當(dāng)綠原酸添加水平為3%和4%時顯著降低CH4濃度(P<0.05)。不同多酚處理組均對瘤胃pH產(chǎn)生顯著影響(P<0.05),但pH的波動均在正常范圍內(nèi)。

表3 不同來源多酚對奶牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)和CH4生成的影響

2.2 不同來源多酚對奶牛瘤胃體外營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響由表4可知,添加不同劑量的茶多酚均能顯著提高DM和NDF的降解率(P<0.05)。單寧酸添加水平為4%時,顯著降低DM的降解率(P<0.05),其他添加水平的單寧酸對DM、NDF和ADF降解率未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。褐藻多酚和綠原酸對DM、NDF和ADF降解率未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

總之，在磁性理念引導(dǎo)下的護理人員具有較高的組織忠誠度及主人翁意識，工作滿意度，職業(yè)幸福感，較強的隊伍凝聚力，維持了護理隊伍的穩(wěn)定性。磁性醫(yī)院能夠有效降低患者病死率，預(yù)防并發(fā)癥，改善患者安全和護理質(zhì)量，提高患者滿意度，建立良好的工作環(huán)境。因此，磁性文化的推廣對我們提升臨床護理人員專業(yè)能力、構(gòu)建安全醫(yī)療服務(wù)環(huán)境提供了開闊思維和理論依據(jù)，為臨床護理管理工作開拓了視野，為深入持續(xù)開展優(yōu)質(zhì)護理服務(wù)提供更多創(chuàng)新性方案。

表4 不同來源多酚對奶牛瘤胃體外發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響

3 討論

3.1 不同來源多酚對奶牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)和CH4生成的影響瘤胃是反芻動物營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要場所。通常評價飼料或添加劑在反芻動物上的應(yīng)用效果,主要是評價其對瘤胃發(fā)酵狀態(tài)的影響。反芻動物體型大、個體差異大、價格昂貴,從而增加了試驗研究的難度。因此,國內(nèi)外科研工作者一直在研究能夠替代活體動物進行瘤胃消化代謝試驗的方法。瘤胃體外培養(yǎng)法以成本低、操作簡單、易于標準化且可用于大批飼料樣本的測定的優(yōu)點,常被用于飼料或添加劑的初步評價[16]。薈萃分析結(jié)果表明體外試驗?zāi)軌蝾A(yù)測體內(nèi)試驗的CH4產(chǎn)量[6]。因此,本試驗采用瘤胃體外培養(yǎng)的方法研究不同來源的多酚對奶牛瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)和CH4生成的影響。

反芻動物瘤胃內(nèi)的氣體是由瘤胃微生物降解營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生的,主要由CH4、CO2、H2和低級的脂肪酸組成。有研究表明,單寧能夠降低CH4的生成[6]。魏晨[17]也研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸和單寧均能夠抑制CH4的生成。本試驗研究發(fā)現(xiàn),添加茶多酚能夠降低GP和CH4產(chǎn)量,添加1%水平的單寧酸也可顯著降低CH4產(chǎn)量,3%和4%添加水平的綠原酸顯著降低CH4的濃度。這表明不同來源的多酚對CH4生成的影響程度不一,并且降低CH4生成的添加劑量也存在差異,這可能與多酚的分子結(jié)構(gòu)或者是相對分子質(zhì)量有關(guān)。魏歡等[18]通過比較單寧酸、對羥基苯甲酸、鞣花酸、丁香酸和蘆丁等5種酚類化合物對瘤胃體外CH4生成的影響,發(fā)現(xiàn)不同種類的多酚化合物對CH4產(chǎn)量影響程度不一,這進一步證實不同來源的多酚對CH4生成的影響程度存在差異。NH3-N是瘤胃消化代謝蛋白類有機物產(chǎn)生的中間產(chǎn)物,其水平能夠反映瘤胃微生物降解飼料蛋白生成NH3-N和利用NH3-N合成微生物蛋白的平衡情況。本研究發(fā)現(xiàn)茶多酚和褐藻多酚添加量為4%時均顯著降低NH3-N的含量。有研究發(fā)現(xiàn),添加一定劑量的鞣花酸和蘆丁能夠降低NH3-N的含量[18],這與本研究結(jié)果相吻合。另外,MIN等[19]研究發(fā)現(xiàn),百脈根單寧能夠減緩瘤胃微生物對蛋白質(zhì)的降解速度,并且能夠抑制蛋白降解菌的生長,這或許是酚類物質(zhì)能夠降低NH3-N的根本原因。

3.2 不同來源多酚對奶牛瘤胃體外發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響飼料DM降解率是評價飼料營養(yǎng)價值和可利用性的重要指標,其受到多種因素的影響,不同飼料由于自身的生理特點和營養(yǎng)成分不同,其瘤胃降解率會產(chǎn)生差異[20]。NDF降解率也是表示粗飼料營養(yǎng)價值的關(guān)鍵指標,NDF和ADF降解率能夠反映粗飼料在瘤胃中降解的難易程度。本試驗研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比,添加不同劑量的茶多酚能夠顯著提高DM和NDF的降解率,添加4%的單寧酸顯著降低DM的降解率,而褐藻多酚和綠原酸對體外發(fā)酵DM、NDF和ADF降解率未產(chǎn)生顯著影響。楊凱[21]研究發(fā)現(xiàn),在肉牛日糧中添加26 g/kg單寧酸能夠降低DM和有機物的表觀消化率。單寧酸之所以能夠抑制纖維的降解,主要是通過阻止微生物對植物細胞壁的附著、抑制微生物降解酶活性或是改變瘤胃微生物的功能來抑制纖維的降解[22-23]。在綿羊的飼糧中添加香芹酚能夠顯著提高DM和CP的表觀消化率,這是因為其可以調(diào)控瘤胃的纖維降解菌的數(shù)量,提高消化酶活性,從而促進瘤胃微生物對飼糧進行消化[24]。同樣也有學(xué)者研究表明,在瘤胃液中添加黃酮類的酚類化合物可以提高碳水化合物水解酶的活性,進而提高纖維的降解率[25]。綜合上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同來源的多酚對瘤胃微生物菌群和消化酶活性的影響不同,從而導(dǎo)致瘤胃營養(yǎng)物質(zhì)的降解率存在差異。因此,關(guān)于多酚類物質(zhì)影響飼料降解的具體作用機制仍需要進一步深入研究。