GRP94通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞分化

李 爽,付玉瑩,佟慧麗,李樹峰,嚴(yán)云勤*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150030;2.黑龍江省動(dòng)物細(xì)胞與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江 哈爾濱 150030)

肌肉衛(wèi)星細(xì)胞 (muscle derived satellite cells,MDSCs)是一種存在于成熟肌肉組織中的肌肉細(xì)胞的前體干細(xì)胞。正常條件下MDSCs保持靜息狀態(tài),當(dāng)肌肉受到損傷或刺激時(shí),存在于基底膜的MDSCs被激活并開始增殖,或退出細(xì)胞周期、遷移并相互融合形成新的肌纖維,這個(gè)過程被稱為細(xì)胞分化[1-2],受許多因素和信號(hào)通路的調(diào)控。MyoG是轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,在骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化時(shí)表達(dá)[3]。MHC為肌肉結(jié)構(gòu)蛋白,它們是檢測骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化的標(biāo)志分子[4]。

葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 94 (glucose-regulated protein 94,GRP94),也稱為 gp96 或熱休克蛋白 90 kDa β成員1( heat-shock protein 90 β1,HSP90b1),是分子伴侶家族的成員,主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[5]。研究表明,GRP94對(duì)于肌肉發(fā)育至關(guān)重要,GRP94基因敲除小鼠胚胎干細(xì)胞不能分化為肌肉組織,GRP94表達(dá)水平的降低會(huì)抑制C2C12細(xì)胞的分化。相反,GRP94 的過表達(dá)可以加速肌管的形成[6-7]。前期研究工作表明,GRP94促進(jìn)小鼠C2C12細(xì)胞分化[8]。但是GRP94對(duì)牛MDSCs分化的影響及其作用的分子機(jī)制尚不清楚。

PI3K信號(hào)介導(dǎo)多種關(guān)鍵的生物學(xué)過程,如葡萄糖穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖和存活[9]。PI3K的激活可以通過第二信使磷脂酰肌醇三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3)向AKT傳遞信號(hào),通過磷酸化激活A(yù)KT。 AKT進(jìn)一步激活mTOR,調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動(dòng),如細(xì)胞生長、增殖和遷移等[10-13]。此外,PI3K/AKT/mTOR 抑制分化并促進(jìn) C2C12 的增殖[8]。但是,PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路與牛MDSCs分化的關(guān)系尚不明確。

本研究旨在探討GRP94對(duì)牛MDSCs分化的影響,闡明GRP94調(diào)節(jié)牛MDSCs分化的分子機(jī)制,挖掘調(diào)控牛MDSCs分化的功能基因,從而為牛肌肉品種改良和育種提供有利支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自Gibco公司與Sigma公司;Anti-GRP94(bs-0147R)、Anti-Desmin (bs-1026R)、Anti-PI3K (bs-2067R)、Anti-phospho-PI3K (bs-5570R)、Anti-AKT1+2+3 (bs-6951R)、Anti-phospho-AKT1+AKT2+AKT3 antibody (bs-5193R)、Anti-mTOR (bs-1992R)、Anti-Phospho-mTOR antibody (bs-5329R)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L(bs-0295G)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L/FITC (bs-0295G-FITC) 購自博奧森公司;PI3K抑制劑(LY294002)、mTOR抑制劑(Rapamycin)購自Selleck公司;T4連接酶、BbsⅠ酶購自NEB公司;pSPgRNA、SP-dCas9、SP-dCas9-VPR購自Addgene公司。

A.牛MDSCs未分化與不同分化不同階段(1,3,5 d)的免疫熒光染色結(jié)果(×100)(綠色熒光為GRP94蛋白,藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核);B～E.未分化與分化不同天數(shù)的牛MDSCs中GRP94、MyoG和MHC的蛋白表達(dá)。**.P<0.01;ns.P>0.05。下同

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞培養(yǎng)本試驗(yàn)用新生胎牛肌肉經(jīng)黑龍江省東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)審查批準(zhǔn)后獲取。取新生胎牛脛骨前肌(n=3),剪碎后加入0.1% 膠原酶Ⅰ,37℃水浴搖床孵育2 h,離心后PBS清洗沉淀物,接下來利用含0.25% EDTA的胰蛋白酶消化30 min,過400目銅網(wǎng),離心去上清,向沉淀物中加入培養(yǎng)液,獲得原代牛MDSCs。

上述分離獲得的牛MDSCs培養(yǎng)在含10%FBS、含100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的高葡萄糖培養(yǎng)基中。每2 d更換1次培養(yǎng)基,當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%后利用含有0.1%EDTA的胰蛋白酶消化細(xì)胞,將細(xì)胞均勻接種至6孔板中。培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞密度達(dá)到70%,可用于細(xì)胞分化或細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用含2%馬血清的高糖培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化,根據(jù)試驗(yàn)需要分化培養(yǎng)不同的時(shí)間。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1GRP94基因sgRNA載體的構(gòu)建 用 TRIzol 試劑從細(xì)胞中提取總RNA,針對(duì)牛 GRP94(NCBI 基因 ID:282646)啟動(dòng)子序列(從-899～+1)設(shè)計(jì)sgRNA序列,在sgRNAs前面加上“CACC”,作為BbsⅠ酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基,具體序列如表1。由上海生工合成后進(jìn)行退火接合。將不同的sgRNA序列分別克隆到pSPgRNA載體中,并命名為 pSPgRNA-B(1～3)。

表1 針對(duì)牛GRP94基因啟動(dòng)子區(qū)的靶序列

1.3.2采用CRISPR技術(shù)激活或抑制GRP94的表達(dá) 將細(xì)胞傳代至六孔板中,待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí),利用PEI將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。其中,pSPgRNA-B(1～3)分別與SP-dCas9-VPR(VPR)載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,利用CRISPR系統(tǒng)達(dá)到高效啟動(dòng)GRP94基因的目的,以此激活GRP94基因的表達(dá);pSPgRNA-B(1～3)與dCas9共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,以此抑制GRP94基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后分化培養(yǎng)細(xì)胞72 h,收集樣品。

1.3.3PI3K和mTOR抑制劑添加對(duì)細(xì)胞分化的檢測 在牛MDSCs分化培養(yǎng)過程中分別加入PI3K的抑制劑LY294002(10 μmol/L)及mTOR抑制劑Rapamycin(Rapa)(500 nmol/L),對(duì)照組在培養(yǎng)液中加入2 μL DMSO,分化培養(yǎng)細(xì)胞72 h。每個(gè)平行試驗(yàn)重復(fù)3次。收集細(xì)胞用于后續(xù)Western blot及免疫熒光檢測。

1.3.4蛋白提取及Western blot 利用PBS清洗細(xì)胞3次,加入蛋白裂解液在冰上裂解細(xì)胞20 min,收集蛋白。利用BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入上樣buffer,煮沸10 min,離心10 min,儲(chǔ)存于-80℃冰箱中。配置濃度為5%濃縮膠和10%分離膠進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育等操作。最后利用ECL發(fā)光液及化學(xué)發(fā)光儀曝光,Image J軟件灰度掃描分析。

1.3.5免疫熒光染色 向上述試驗(yàn)樣品中加入冷甲醇固定20 min。利用0.5%Triton X-100的磷酸鹽緩沖液(PBST)透膜處理15 min,加入含有5% BSA的PBST 37℃培養(yǎng)箱孵育1 h進(jìn)行封閉。一抗4℃過夜。熒光標(biāo)記二抗37℃孵育2～3 h。DAPI染液室溫染色。用倒置熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 GRP94在牛MDSCs分化過程中的表達(dá)規(guī)律誘導(dǎo)牛MDSCs分化5 d,分別于未分化(0 d),分化1～5 d 收集蛋白樣品并固定細(xì)胞。利用免疫熒光染色檢測GRP94的表達(dá),綠色熒光表示GRP94蛋白陽性信號(hào)。結(jié)果如圖1A所示,隨著細(xì)胞的分化,綠色熒光逐漸加深,GRP94表達(dá)顯著增加。Western blot對(duì)細(xì)胞分化標(biāo)志基因MyoG及MHC的表達(dá)進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖1B～E所示,MyoG及MHC的表達(dá)顯著增加,表明細(xì)胞分化程度是逐漸增加的。同時(shí)隨著細(xì)胞分化的增加,GRP94表達(dá)顯著增加。綜上,隨著牛MDSCs分化的進(jìn)行GRP94表達(dá)顯著增加。

2.2 GRP94對(duì)牛MDSCs分化的影響為了明確GRP94對(duì)牛MDSCs分化的影響,本研究利用CRISPR/dCas9基因編輯系統(tǒng)來體外調(diào)控GRP94的表達(dá),檢測分化相關(guān)指標(biāo)。

2.2.1激活GRP94對(duì)牛MDSCs分化的影響 在牛MDSCs中共同轉(zhuǎn)染VPR及靶向GRP94基因啟動(dòng)子的sgRNA載體(pSPgRNA-B1、pSPgRNA-B2或pSPgRNA-B3),以實(shí)現(xiàn)GRP94表達(dá)的激活。Western blot結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,pSPgRNA-B3處理組激活GRP94表達(dá)量的效果最顯著。以此用于后續(xù)激活GRP94表達(dá)的試驗(yàn)研究。激活GRP94表達(dá)后誘導(dǎo)細(xì)胞分化至72 h,首先利用Western blot檢測MyoG及MHC的表達(dá)。結(jié)果如圖2C～F,GRP94表達(dá)增加后MyoG及MHC表達(dá)顯著增加。此外,Desmin的免疫熒光結(jié)果及肌管融合率顯示,激活GRP94表達(dá)后肌管明顯增多,與對(duì)照組相比肌管融合率增加了27.65%(圖2G、H)。上述結(jié)果表明,GRP94表達(dá)增加促進(jìn)牛MDSCs分化。

A、B.GRP94激活表達(dá)載體的篩選;C～F.Western blot檢測激活GRP94表達(dá)后MyoG和MHC蛋白表達(dá)變化;G、H.免疫熒光檢測激活GRP94的表達(dá)對(duì)肌管融合的影響(×100)。綠色熒光代表Desmin染色,藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核。下同

2.2.2抑制GRP94對(duì)牛MDSCs分化的影響 利用SP-dCas9(dCas9)載體與靶向GRP94基因啟動(dòng)子的sgRNA載體(pSPgRNA-B1、pSPgRNA-B2或pSPgRNA3)共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,誘導(dǎo)細(xì)胞分化至72 h,檢測GRP94的表達(dá)。結(jié)果如圖3A、B所示,pSPgRNA-B3處理組顯著抑制GRP94的表達(dá),以此用于后續(xù)試驗(yàn)。Western blot檢測結(jié)果如圖3C～F所示,抑制GRP94后MyoG和MHC的表達(dá)顯著降低。免疫熒光Desmin染色結(jié)果顯示,抑制GRP94表達(dá)后,細(xì)胞中肌管減少(圖3G),肌管融合率減少了18.91%(圖3H)。上述結(jié)果表明,GRP94表達(dá)減少阻礙牛MDSCs分化。

A、B.GRP94抑制表達(dá)載體的篩選;C～F.抑制GRP94表達(dá)后MyoG和MHC蛋白表達(dá)量的檢測;G、H.免疫熒光檢測抑制GRP94的表達(dá)對(duì)肌管融合的影響

綜上,GRP94的激活或抑制能促進(jìn)或阻礙牛MDSCs分化。因此,GRP94對(duì)牛MDSCs分化具有正向調(diào)控作用。

2.3 PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)牛MDSCs分化的影響

2.3.1抑制PI3K對(duì)牛MDSCs分化的影響 由于PI3K信號(hào)通路對(duì)牛MDSCs分化的影響并不明確,本試驗(yàn)在牛MDSCs分化過程中添加PI3K抑制劑LY294002后檢測細(xì)胞的肌管融合率及分化標(biāo)志基因的表達(dá)。Desmin免疫熒光結(jié)果如圖4,添加LY294002后肌管顯著增多(圖4A),與對(duì)照組相比肌管融合率增加27.32%(圖4B)。Western blot檢測如圖4C～H所示,添加抑制劑后,p-PI3K、p-AKT及p-mTOR的表達(dá)量均減少,但MyoG和MHC的表達(dá)上調(diào)。上述結(jié)果表明,抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活性促進(jìn)牛MDSCs分化。

A、B.免疫熒光檢測抑制PI3K的活性后對(duì)細(xì)胞分化的影響;C～H.LY294002對(duì)MyoG和MHC表達(dá)的影響

2.3.2抑制mTOR對(duì)牛MDSCs分化的影響 為了明確mTOR對(duì)牛MDSCs分化的影響,在牛MDSCs分化過程中持續(xù)添加mTOR的抑制劑Rapa。免疫熒光結(jié)果如圖5A、B所示,添加Rapa后細(xì)胞分化顯著增加,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明肌管融合率增加25.73%。Western blot結(jié)果如圖5C～F所示,p-mTOR表達(dá)量減少后,MyoG和MHC的表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)牛MDSCs分化。

A、B.免疫熒光檢測抑制mTOR的活性后對(duì)細(xì)胞分化的影響;C～F.mTOR抑制劑Rapa對(duì)MyoG和MHC表達(dá)的影響

2.4 GRP94對(duì)P3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響為了明確GRP94促進(jìn)牛MDSCs分化的機(jī)制,在激活GRP94表達(dá)的同時(shí)檢測PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的活化。Western blot結(jié)果表明GRP94表達(dá)增加后,p-PI3K、p-AKT和p-mTOR的表達(dá)量下調(diào)(圖6A～E);在牛MDSCs中抑制GRP94表達(dá),p-PI3K、p-AKT及p-mTOR的表達(dá)量顯著增加(6F～J)。上述結(jié)果表明,GRP94抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路活性。

A～E.激活GRP94表達(dá)對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響;F～J.抑制GRP94表達(dá)對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響(*表示P <0.05)

因此,GRP94可能通過負(fù)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)牛MDSCs分化。

3 討論

GRP94是94 kDa的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白,是一種廣泛存在于細(xì)胞中的分子伴侶, 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含量豐富[14]。因此GRP94在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激方面的研究獲得了廣泛關(guān)注,但是其在成肌細(xì)胞分化中的作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期研究工作表明,GRP94可以調(diào)節(jié)小鼠C2C12成肌細(xì)胞的分化,同時(shí)在小鼠肌肉損傷時(shí)表達(dá)顯著上調(diào),提示GRP94在成肌分化中具有重要作用[8]。本研究結(jié)果表明,GRP94的表達(dá)隨著牛MDSCs的分化而逐漸升高,其對(duì)牛MDSCs的分化具有正向調(diào)控作用。

本試驗(yàn)采用CRISPR/dCas9基因編輯系統(tǒng)激活或抑制牛MDSCs分化過程中GRP94的表達(dá)。針對(duì)GRP94基因啟動(dòng)子序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)并構(gòu)建了3個(gè)sgRNA表達(dá)載體(pSPgRNA-B1、pSPgRNA-B2和pSPgRNA-B3),分別通過與dCas9和VPR載體共轉(zhuǎn)染,實(shí)現(xiàn)對(duì)GRP94的干擾或激活。采用CRISPR技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)的調(diào)控具有高效性,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域[15-16]。本研究設(shè)計(jì)了多個(gè)sgRNA干擾片段,以防止脫靶效應(yīng),最終高效激活或抑制GRP94的表達(dá),以明確功能基因GRP94在MDSCs分化中的表達(dá)。為肉牛肉質(zhì)改良及育種提供理論依據(jù)。

目前,對(duì)于PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的研究主要聚焦于其在癌細(xì)胞增殖過程中的作用,其可能為癌細(xì)胞藥物作用的靶標(biāo)。此外,亦有研究表明PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在體內(nèi)促進(jìn)小鼠成肌分化[17]。本試驗(yàn)通過向牛MDSCs中添加PI3K和mTOR的抑制劑表明,抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)牛MDSCs分化,這與本實(shí)驗(yàn)室之前發(fā)表研究一致[18]。這與PI3K/AKT/mTOR能夠正向調(diào)控小鼠成肌細(xì)胞分化的報(bào)道不一致。推測其可能是由于物種的差異或者是體內(nèi)、體外環(huán)境的不一致所致。因此,PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路對(duì)于成肌分化的調(diào)節(jié)作用亟待深入挖掘。

在許多類型的癌細(xì)胞研究中表明,GRP94通過PI3K/AKT信號(hào)通路發(fā)揮作用[19-20]。但沒有明確GRP94對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的作用,并且GRP94如何通過PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)牛MDSCs分化的機(jī)制并不明確。GRP94作為分子伴侶,能幫助多種受體蛋白折疊、分泌及運(yùn)輸。前期研究表明其可能與PIK3IP1結(jié)合并影響PIK3IP1的表達(dá)(未發(fā)表數(shù)據(jù)),而PIK3IP1作為PI3K的負(fù)調(diào)節(jié)因子,推測其通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)牛MDSCs分化。因此,GRP94通過負(fù)調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)牛MDSCs分化,其機(jī)制亟待進(jìn)一步研究。該機(jī)制的明確不僅能夠闡明GRP94調(diào)控牛成肌分化的新機(jī)制,也為肉牛育種及肉質(zhì)改善提供新的思路。