小反芻獸疫病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可視化快速檢測方法的建立

黃超華,阮周曦,路 平,吳 江,曹琛福,林彥星,花群義*

(1.深圳海關 動植物檢驗檢疫技術中心,廣東 深圳 518045;2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,山東 青島 370200)

小反芻獸疫(peste des petits ruminants,PPR)是一種由小反芻獸疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的動物疫病,其易感動物主要為山羊、綿羊、鹿、駱駝以及其他野生小反芻動物。PPR典型臨床癥狀為發(fā)熱、腹瀉、呼吸困難、口腔與鼻黏膜潰瘍和結膜炎等,病死率可達90%以上[1-2];PPR是世界動物衛(wèi)生組織(WOAH)規(guī)定的必須報告的動物疫病,在我國屬于一類動物疫病。該病自2007年在西藏阿里地區(qū)首次發(fā)生以來,已在我國多個地區(qū)多次發(fā)生,尤其在2013—2014年發(fā)生的PPR大流行期間,給我國的養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的經濟損失[3]。我國農業(yè)農村部于2015年底制定了全國PPR根除計劃,直到2021年我國基本完成了全國消滅PPR的任務。但由于PPR在我國周邊國家仍呈地方性流行狀態(tài),且近年的野外調查發(fā)現PPR有在國內形成自然疫源地的風險[4-6],因此加強入境小反芻動物及其產品的PPRV篩查以及對國內野生小反芻動物開展PPR疫情調查成為我國PPR防控工作的重點。我國國家標準《小反芻獸疫診斷技術》中推薦的PPRV分子生物學檢測方法為針對PPRVN基因的普通RT-PCR、實時熒光RT-PCR,但耗時較長,且需要大型儀器設備,不適合用于PPRV的快速篩查和野外調查。因此建立一種快速靈敏的便攜式的PPRV可視化檢測方法十分必要。

RT-RAA-CRISPR/Cas12a可視化快速檢測方法是一種將CRISPR/Cas12a的反式切割活性與RT-RAA擴增技術相結合并通過側向流試紙實現結果的可視化核酸檢測方法。2018年DOUDNA等[7]首次將CRISPR/Cas12a與 RPA 方法結合在一起建立了DETECTR檢測平臺,可在常溫下快速特異性地檢測 HPV16 和 HPV18 核酸。其原理即通過特異性的 crRNA(CRISPR RNA) 引導CRISPR/Cas12a特異性識別RPA擴增的目的DNA序列,進而激活CRISPR/Cas12a反式切割活性、對反應體系中的ssDNA報告探針進行切割,從而實現熒光信號的釋放,最終通過側流層析試紙實現反應結果的可視化。該方法因具有快速、準確、操作簡單、且不需要特殊儀器設備等優(yōu)點而在近年得到快速發(fā)展和應用。該技術已在新冠病毒、非洲豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等病毒核酸及其他病原微生物的檢測等方面得到應用[8-11]。目前,尚無基于RT-RAA-CRISPR/Cas12a技術的PPRV檢測方法。因此,本研究結合RT-RAA擴增技術與CRISPR/Cas12a反式切割和側向流試紙建立了一種小反芻獸疫病毒核酸的快速可視化檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料小反芻獸疫滅活疫苗、藍舌病毒(BTV)、鹿流行性出血熱病毒(EHDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、羊痘病毒(CaPV)、豬水泡病毒(SVDV)、偽狂犬病病毒(PRV)等病毒核酸為深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心提供;CRISPR/Cas12a蛋白(M0653T)、HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(E2050S)、NEBuffer r2.1(B6002V)、10×NEB buffer 3(B7003S)為New England Biolabs 公司產品;RNA純化試劑盒miRNeasy Mini Kit (50)(217004)為德國QIAGEN公司產品;RT-RAA擴增試劑盒(基礎型)(S003ZC)為杭州眾測生物科技有限公司產品;側向流試紙條(JY0301)為北京寶盈同匯生物技術有限公司產品;RT-qPCR母液(4442135)為美國賽默飛公司產品;相關引物探針及質粒均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1RT-RAA引物的設計合成及篩選 利用NCBI BLAST功能對PPRVN基因進行比對,分析其保守區(qū)域,并以Primer Premier 5軟件設計獲得了12組特異性引物對,利用RT-RAA擴增進行篩選。RT-RAA體系為:A buffer 41.5 μL、特異性上、下游引物各2.0 μL、PPRV核酸2.0 μL和B buffer 2.5 μL,反應條件為42℃ 30 min;反應后通過全自動毛細管電泳分析系統(tǒng)進行分析,篩選出可用于后續(xù)試驗的引物組合。

1.2.2crRNA的設計合成 CRISPR/Cas12a識別的PAM為TTTN,分析PPRVN基因序列,選取PAM 序列后的20～23 bp,并在其前加上T7 啟動子(TAA TAC GAC TCA CTA TAG G)+LbCas12a的 scaffold 序列(aatttctactaagtgtagat),從而獲得多條PPRV特異性crRNA序列;由生工生物工程(上海)股份有限公司合成 crRNA-F以及反向互補鏈 crRNA-R,并通過退火合成相應的 DNA 雙鏈;以T7體外轉錄試劑盒(HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit)將DNA雙鏈轉錄成RNA,并利用RNA純化試劑盒(miRNeasy Mini Kit (50))進行純化,最終獲得crRNA,-80℃保存待用。

1.2.3CRISPR/Cas12a反應體系 CRISPR/Cas12a反應體系:200 nmol/L Cas12a、250 nmol/L crRNA、200 nmol/L 報告探針(5′ 6-FAM-TTATT-Biotin 3′)、10 μL NEBuffer r2.1、5 μL RT-RAA產物、2 U RNase 抑制劑、DEPC處理的H2O補足至100 μL。反應條件為37℃ 20 min。隨后將側向流試紙條插入到體系,觀察檢測線(test-line)和質控線(control-line)顯示情況。結果判讀:清晰顯示檢測線的即為陽性結果;僅顯示質控線的為陰性結果。

1.2.4crRNA的篩選 以1.2.1篩選獲得的特異性引物組合和反應體系與條件進行RT-RAA擴增,取其產物進行CRISPR/Cas12a反應,從而對1.2.2獲得的crRNA進行篩選。20 min后,取CRISPR/Ca-s12a反應產物測定熒光強度,篩選出最佳的RT-RAA擴增引物和最佳的crRNA。

1.2.5特異性試驗 為確定方法的特異性,以建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可視化檢測方法對BTV、EHDV、FMDV、CaPV、SVDV、PRV等病毒核酸進行檢測。

1.2.6敏感性試驗 為確定方法的敏感性,將PPRV核酸稀釋至4.30×106～4.30×100拷貝/μL,同時以建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可視化檢測方法和國家標準《小反芻獸疫診斷技術》中推薦的實時熒光RT-PCR方法進行檢測。

1.2.7重復性試驗 為確定方法的重復性,以建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a可視化檢測方法對4.30×101,4.30×103,4.30×105拷貝/μL 3個濃度的PPRV核酸進行3次重復檢測。

1.2.8符合性試驗 為評估本研究建立的方法與國家標準推薦的實時熒光RT-PCR方法的符合性,本研究制備了60份模擬樣品,分別以這2種方法進行檢測,比較兩者的檢測結果,并計算兩者的符合率以及Kappa值。若0

2 結果

2.1 RT-RAA引物的篩選結果以RT-RAA擴增試驗對設計、合成的12組引物進行篩選。結果表明,3對引物組合沒有擴增條帶,9對引物組合出現擴增條帶;其中,2,3,6,10和11組的擴增條帶最為清晰且無非特異性擴增,結果見圖1。因此,選取2,3,6,10和11組為RT-RAA特異性引物,進行下一步的試驗。

圖1 不同引物組合RT-RAA擴增結果

2.2 crRNA 的篩選結果以2.1篩選獲得的特異性引物組合和反應體系與條件進行RT-RAA擴增,取其產物進行CRISPR/Cas12a反應,從而對制備的crRNA進行篩選。結果表明,crRNA2所產生的熒光最強,結果見圖2。由于crRNA2的序列在RT-RAA特異性引物組合3所在的序列之中,為此,最終確定RT-RAA特異性引物組合為組合3,最佳crRNA為crRNA2,具體序列:

圖2 不同 crRNA的熒光強度

PPRV-F:5′-TGG TGC TGA TTT AGA CAA CGA GGC AGA CAT-3′;

PPRV-R:5′-TGT GCT AGT ATG GAG GCT AAC AAC ATA TTG AAC T-3′;

PPRV-crRNA:5′-AAU UUC UAC UAA GUG UAG AUG AGA ACA GAG AAA UAA UAG AC-3′(下劃線為PPRV特異性RNA序列)。

2.3 特異性試驗結果以對BTV、EHDV、FMDV、 CaPV、SVDV、PRV等病毒核酸為模板進行特異性試驗,評價本方法的特異性。試驗結果(圖3)顯示,PPRV陽性對照有明顯的檢測線顯示,其他病毒核酸及對照均未出現檢測線,說明本方法特異性強,能準確檢測出PPRV核酸,而與其他病原核酸無交叉反應。

1.PPRV;2.BTV;3.EHDV;4.FMDV;5.CaPV;6.SVDV;7.PRV;8.H2O

2.4 敏感性試驗結果為確定本方法的敏感性,將PPRV核酸稀釋至4.30×106～4.30×100拷貝/μL,同時以本方法和國家標準《小反芻獸疫診斷技術》推薦的實時熒光RT-PCR方法進行檢測。結果顯示,本方法的最低檢出限可達到4.30×101拷貝/μL,與實時熒光RT-PCR方法相當(圖4)。

A.RT-RAA-CRISPR/12a方法的敏感性試驗;B.國家標準推薦的RT-qPCR的敏感性試驗;1～7.4.30×106 ～4.30×100拷貝/μL

2.5 重復性試驗結果以建立的檢測方法對4.30×101,4.30×103,4.30×105拷貝/μL 3個濃度的PPRV核酸進行3次重復性試驗。結果顯示,本方法均能檢出前述3個濃度的PPRV核酸,且結果一致性良好(圖5),表明本方法的重復性良好。

1～3.4.30×105拷貝/μL;4～6.4.30×103拷貝/μL;7～9.4.30×101拷貝/μL

2.6 符合性結果為確定本方法與國家標準《小反芻獸疫診斷技術》推薦的實時熒光RT-PCR方法的符合性,本研究制備了60份模擬樣品,分別以前述2種方法進行平行檢測。結果顯示,陽性符合率為88%(16/18),Kappa值為0.918>0.750。說明本研究建立的PPRV RT-RAA-CRISPR/Cas12a檢測方法與國家標準《小反芻獸疫診斷技術》推薦的實時熒光RT-PCR方法具有高度一致性(表1)。

表1 符合性試驗結果 份

3 討論

由于PPR可造成巨大損失,我國農業(yè)農村部于2015年底制定了全國PPR消滅計劃,并于2021年基本實現了PPR根除任務。但是我國研究者多次在野生小反芻動物中檢出PPRV,周邊鄰國也有野生動物感染PPRV的報道。因此在野生動物中篩查PPRV,防止PPRV自然疫源地的形成,是目前我國PPR防控的重點之一。另一個重點在于加強入境動物檢疫,在關口一線實現PPRV精準快速篩查,防止PPRV境外輸入。雖然實時熒光RT-PCR是PPRV核酸檢測的金標準,但由于需要大型的儀器和固定場所,所以不適用于PPRV野外篩查和邊境關口一線的快速篩查。

為實現PPRV的快速檢測,本研究借鑒DOUDNA等[7]的DETECTR 檢測平臺,把RT-RAA擴增技術與CRISPR/Cas12a反式切割反應結合起來,并通過側向流試紙實現結果的可視化,建立了一種PPRV核酸的快速可視化檢測方法。PPRV特異性的RT-RAA擴增引物和PPRV特異性的crRNA,雙重特異性增強了檢測方法的特異性,規(guī)避了RT-RAA的非特異性擴增。特異性試驗結果顯示,本研究建立的方法對常見反芻動物病毒如BTV、EHDV、FMDV、CaPV、SVDV、PRV均無交叉反應,說明本方法具有良好的特異性。在敏感性方面,本方法最低檢出限可達4.30×101拷貝/μL,靈敏性高于單獨使用RT-RAA方法,與實時熒光RT-PCR相當。而與實時熒光RT-PCR相比,本方法通過側向流試紙顯示,結果直觀可見;且方法在37～42℃即可完成檢測,可在缺少大型儀器設備的基層實驗室或野外現場檢測中使用,操作便捷快速。

綜上,本研究建立了一種基于RT-RAA-CRISPR/Cas12a的可視化PPRV核酸檢測方法,具有特異性好、敏感性高、且操作簡單、無需特殊儀器等優(yōu)點,可應用于野外或基層農場以及口岸現場的PPRV快速篩查檢測工作。