穩(wěn)定表達(dá)GM-CSF的重組塞內(nèi)卡病毒A的構(gòu)建與鑒定

郭笑然,韓 穎,劉帥峰,劉小娜,雷白時(shí),張武超,趙 款,2*,袁萬(wàn)哲,2*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071001;2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 保定 071001)

塞內(nèi)卡病毒A(Senecavirus A,SVA)是一種單股正鏈RNA病毒,該病毒屬于小核糖核酸病毒科、塞內(nèi)卡病毒屬,其病毒基因組約為7.2 kb[1]。最初SVA在PER.C6的細(xì)胞培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái),后來(lái)發(fā)現(xiàn)豬可以感染SVA,感染后吻端和蹄部冠狀帶出現(xiàn)水泡、并伴有跛行、厭食和嗜睡,與口蹄疫、豬水皰性口炎、豬水皰病等具有相似的臨床癥狀[2-3]。

自2014年以來(lái),在加拿大、美國(guó)、巴西和中國(guó)等多個(gè)國(guó)家暴發(fā)了由SVA引起的水皰性相關(guān)疾病,造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-6]。雖然近年來(lái)SVA得到了廣泛研究,但是目前仍然沒(méi)有針對(duì)SVA的相關(guān)疫苗。美國(guó)布魯金斯州立大學(xué)SHARMA等[7]利用反向遺傳操作系統(tǒng)對(duì)SVA進(jìn)行改造,拯救出1株重組的致弱病毒(rSVA mSacⅡ),通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)該重組病毒感染豬后未表現(xiàn)出任何臨床癥狀,減弱了病毒血癥,口腔、鼻腔分泌物和糞便排毒量明顯減少。雖然該重組病毒被致弱,但是該病毒保留了良好的免疫原性,能夠刺激機(jī)體誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)SVA的中和抗體,對(duì)豬起到保護(hù)作用。雖然弱毒疫苗可以誘導(dǎo)更長(zhǎng)時(shí)間的免疫反應(yīng),但是弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)等安全性隱患[7]。YANG等[8]對(duì)SVA滅活疫苗進(jìn)行了相關(guān)研究和評(píng)價(jià),結(jié)果表明,SVA滅活疫苗也能夠?qū)ωi只起到很好的保護(hù)作用。但是傳統(tǒng)滅活苗免疫效果持續(xù)時(shí)間短,常需多次免疫才能得到較好保護(hù),費(fèi)時(shí)費(fèi)力且成本較高,有必要對(duì)其進(jìn)行改造。

粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)基因全長(zhǎng)為435 bp,編碼144個(gè)氨基酸,通過(guò)增殖、活化樹突狀細(xì)胞(DC),刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子,增強(qiáng)抗原遞呈能力,促進(jìn)T細(xì)胞的成熟和分化[9]。目前,GM-CSF已經(jīng)成為公認(rèn)的疫苗佐劑,在腫瘤、病毒疫苗研究中廣泛應(yīng)用,并具有良好的免疫應(yīng)答增強(qiáng)作用。已報(bào)道選用GM-CSF可以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒[10]、豬圓環(huán)病毒2型[11]、口蹄疫病毒[12]的免疫應(yīng)答能力?；诖?本研究利用實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的SVA反向遺傳操作系統(tǒng),在其基因組插入GM-CSF,獲得嵌合GM-CSF的重組A型塞內(nèi)卡病毒,為該病的預(yù)防和控制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病毒、細(xì)胞和載體SVA HeB-2019(GenBank:MZ375462)毒株的全長(zhǎng)cDNA感染性克隆rSVA由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存[13],重組質(zhì)粒pGM-CSF-T2A、pOK-CMV-Actin載體和幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK-21)均由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑PrimeSTAR?HS DNA Polymerase購(gòu)自TaKaRa公司;限制性核酸內(nèi)切酶和NEB-uilder HiFi DNA同源重組試劑盒購(gòu)自NEB公司;X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Roche公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自Gibico公司;抗豬GM-CSF蛋白的多克隆抗體(PAb)購(gòu)自RD公司;羊抗兔IgG-FITC 和羊抗豬IgG-RBITC均購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

1.3 嵌合GM-CSF的重組SVA的構(gòu)建與拯救

1.3.1rSVA-GM-CSF感染性克隆的構(gòu)建 以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的SVA/HeB-2019全長(zhǎng)感染性克隆rSVA為基礎(chǔ),在基因組2A和2B蛋白間插入GM-CSF-T2A基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒SVA-GM-CSF。其中T2A為明脈扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)的2A基因,其編碼的2A蛋白具有高效的體內(nèi)自我剪切活性[14]。根據(jù)已知SVA 2A、2B位置和序列設(shè)計(jì)相應(yīng)同源臂引物,以重組的pGM-CSF-T2A為模板,分別采用GM-CSF-F/R引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增得到pGM-CSF-T2A片段;以本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建rSVA cDNA感染性克隆質(zhì)粒為模板,分別利用B1-F/R、B3-F/R引物擴(kuò)增得到SVA-B1和SVA-B3片段;以B1-F/B3-R為引物,通過(guò)融合PCR方法將GM-CSF-T2A插入到SVA的2A和2B之間獲得融合片段SVA-B-GM-CSF;利用A-F/R和C-F/R引物,以rSVA cDNA感染性克隆質(zhì)粒為模板,PCR擴(kuò)增得到SVA-A和SVA-C片段,引物序列見(jiàn)表1。將pOK-CMV-Actin利用EcoR Ⅰ線性化,將線性化片段與SVA基因組的A、B-GM-CSF和C片段通過(guò)NEB-uilder HiFi DNA同源重組試劑盒克隆至pOK-CMV-Actin載體,轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)菌液PCR和測(cè)序鑒定陽(yáng)性即獲得基于真核雙啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒SVA-GM-CSF(圖1)。

圖1 重組病毒SVA-GM-CSF的構(gòu)建策略

A.Mock;B.SVA;C.rSVA-GM-CSF

M.DL2000 DNA Marker;1.rSVA-GM-CSF;2.SVA;3.Mock

表1 RT-qPCR引物

1.3.2rSVA-GM-CSF的拯救 當(dāng)單層BHK-21細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí),取3 μg rSVA-GM-CSF重組質(zhì)粒在6 μL X-tremeGENE HP DNA的介導(dǎo)下進(jìn)行轉(zhuǎn)染,同時(shí)用等量的X-tremeGENE HP DNA設(shè)空白對(duì)照,置于含5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后收獲病毒。反復(fù)凍融3次后繼續(xù)在BHK-21細(xì)胞上傳代,直到病毒能夠穩(wěn)定產(chǎn)生致細(xì)胞病變效應(yīng)。將拯救出的病毒命名為rSVA-GM-CSF。

1.3.3重組病毒的RT-PCR擴(kuò)增 提取重組病毒和親本病毒的RNA,以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以此為模板,利用特異性引物GM-CSF-F/R進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物為在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并測(cè)序。

1.3.4間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA) 將F5代重組病毒和親本病毒分別感染BHK-21細(xì)胞,24 h后棄培養(yǎng)液,用4%多聚甲醛固定20 min,0.1%Triton X-100通透20 min,5%BSA 37℃封閉1 h。分別用抗SVA VP2 蛋白的多克隆抗體(1∶200)和抗豬GM-CSF蛋白的多克隆抗體(1∶250)作為一抗,熒光標(biāo)記的羊抗兔IgG-FITC和羊抗豬IgG-RBITC為二抗進(jìn)行IFA鑒定。

1.3.5重組病毒的生長(zhǎng)曲線 為評(píng)價(jià)重組病毒的生長(zhǎng)特性,將F5代重組病毒和親本病毒以0.5 MOI分別感染BHK-21細(xì)胞,收取12,24,36,48,60,72 h病毒上清液。將收獲的病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋,每個(gè)稀釋度重復(fù)8次,觀察細(xì)胞病變情況并記錄細(xì)胞病變,利用Reed-Muench法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的TCID50,繪制病毒一步生長(zhǎng)曲線。

1.3.6遺傳穩(wěn)定性分析 為了評(píng)估插入外源片段重組病毒的遺傳穩(wěn)定性,將重組病毒在BHK-21細(xì)胞上連續(xù)傳至10代,取F5、F10代細(xì)胞培養(yǎng)上清提取病毒RNA,以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA,以此為模板,采用引物SVA-F/R對(duì)外源基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 SVA-GM-CSF全長(zhǎng)cDNA感染性克隆的構(gòu)建利用PCR方法分別擴(kuò)增得到SVA-A、SVA-B-GM-CSF和SVA-C片段,再利用NEB-uilder HiFi DNA同源重組試劑盒將3個(gè)片段克隆至pOK-CMV-Actin載體,最終構(gòu)成重組質(zhì)粒SVA-GM-CSF(圖2)。

2.2 rSVA-GM-CSF的拯救將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒SVA-GM-CSF轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞72 h后收取細(xì)胞上清,反復(fù)凍融3次后接種到BHK-21細(xì)胞盲傳。結(jié)果顯示,隨著代次的升高,出現(xiàn)CPE的時(shí)間逐漸變短,病變也更加明顯。當(dāng)傳至F5代時(shí),細(xì)胞在36 h出現(xiàn)明顯CPE,細(xì)胞圓縮,脫落,與其親本病毒產(chǎn)生的CPE一致(圖3)。

2.3 rSVA-GM-CSF的鑒定

2.3.1重組病毒的RT-PCR擴(kuò)增與測(cè)序鑒定 收取第5代重組病毒的細(xì)胞上清液,提取病毒RNA,用引物GM-CSF-F/R擴(kuò)增重組病毒所含的GM-CSF基因片段,1%瓊脂糖凝膠核酸電泳結(jié)果顯示,可得到長(zhǎng)約596 bp的目標(biāo)片段(圖4)。將目的片段正確的PCR產(chǎn)物純化回收后送至公司測(cè)序,結(jié)果表明插入的外源片段GM-CSF的序列沒(méi)有發(fā)生缺失和突變。

2.3.2rSVA-GM-CSF的間接免疫熒光鑒定 重組病毒rSVA-GM-CSF與親本毒分別感染BHK-21細(xì)胞,在感染后24 h,采用抗SVA VP2蛋白和GM-CSF的多克隆抗體分別進(jìn)行IFA檢測(cè),間接免疫熒光結(jié)果顯示,重組病毒和親本病毒感染BHK-21細(xì)胞均出現(xiàn)SVA特異性綠色熒光;重組病毒感染BHK-21細(xì)胞后可檢測(cè)到抗GM-CSF的特異性紅色熒光,而親本毒未觀察到熒光,表明重組病毒感染BHK-21細(xì)胞后插入的GM-CSF基因能夠正確表達(dá)(圖5)。

A,d.rSVA-GM-CSF;b,e.SVA;c,f.Mock

2.4 rSVA-GM-CSF的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析為驗(yàn)證rSVA-GM-CSF重組病毒與親本毒之間生長(zhǎng)特性的差異,分別將SVA和rSVA-GM-CSF感染BHK-21細(xì)胞,分析病毒生長(zhǎng)曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明,重組病毒與親本病毒在BHK-21細(xì)胞中表現(xiàn)相似的生長(zhǎng)曲線。均在感染12 h后病毒滴度逐步上升,在36 h病毒滴度達(dá)到最高值,之后趨于平穩(wěn)(圖6)。

圖6 rSVA-GM-CSF病毒及其親本毒株的生長(zhǎng)曲線

A.rSVA-GM-CSF的PCR鑒定(M.DL2000 DNA Marker;1.Mock;2.rSVA-GM-CSF F5;3.rSVA-GM-CSF F10;4.SVA);B.rSVA-GM-CSF測(cè)序鑒定

2.5 rSVA-GM-CSF的遺傳穩(wěn)定性分析為進(jìn)一步分析rSVA-GM-CSF重組病毒遺傳穩(wěn)定性,將rSVA-GM-CSF重組病毒連續(xù)在BHK-21細(xì)胞傳代10次,分析其插入的外源基因GM-CSF遺傳穩(wěn)定性。對(duì)重組病毒rSVA-GM-CSF F5和F10代進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明rSVA-GM-CSF重組病毒能夠擴(kuò)增出1 476 bp目的條帶,而不含有GM-CSF基因的親本病毒rSVA只能擴(kuò)增出990 bp的目的條帶(圖7A)。此外,對(duì)重組病毒rSVA-GM-CSF F5和F10代RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,發(fā)現(xiàn)GM-CSF-T2A基因序列沒(méi)有出現(xiàn)突變的現(xiàn)象(圖7B)。

3 討論

SVA自2015年傳入我國(guó)廣東,目前己蔓延至廣西、福建、湖北和黑龍江等多個(gè)省份,給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展帶來(lái)很大的潛在威脅[15]。雖然近年來(lái)SVA得到了廣泛研究,但是目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)防控該病的疫苗,部分實(shí)驗(yàn)室研制了SVA常規(guī)滅活疫苗可有效防控該病。但是傳統(tǒng)滅活苗免疫時(shí)間短,細(xì)胞免疫效果比較差,因此,提高滅活疫苗的免疫效果對(duì)于該病的防控有重要意義。

隨著病毒反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,通過(guò)對(duì)病毒基因組的操控可以對(duì)毒株進(jìn)行改造,以此來(lái)獲得理想的疫苗株。已有研究報(bào)道,利用反向遺傳操作技術(shù),建立SVA感染性克隆并表達(dá)外源基因已開(kāi)展了大量研究。例如,LIU等[16]構(gòu)建的綠色熒光蛋白標(biāo)記SVA重組病毒,并以此作為工具用于中和抗體的檢測(cè)及篩選抗病毒藥物;宋高媛等[17]構(gòu)建了一種嵌合FMDV抗原表位的重組SVA毒株,該重組病毒具有與親本病毒相似的增殖特性,并且有較高的遺傳穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)室前期利用反向遺傳操作技術(shù)構(gòu)建了一種能夠穩(wěn)定表達(dá)NLuc熒光素酶的SVA-Nluc重組報(bào)告病毒,它能夠快速檢測(cè)SVA的中和抗體效價(jià),高通量篩選SVA特異性抗病毒因子[13]。以上結(jié)果表明SVA作為載體具有容納一定外源基因的能力。

GM-CSF細(xì)胞因子是一種活躍的免疫效應(yīng)因子,在體內(nèi)有著廣泛的免疫活性,作為免疫佐劑,它不僅可以促進(jìn)APC(antigen presenting cell)的成熟,提高其抗原提呈能力,而且在抗腫瘤免疫中扮演著關(guān)鍵性作用[18]。近年來(lái),學(xué)者們嘗試將GM-CSF作為外源基因插入病毒疫苗載體序列中,以提高疫苗的免疫效果。ZHOU等[19]構(gòu)建了表達(dá)犬GM-CSF的重組減毒狂犬病疫苗,結(jié)果表明,重組病毒可激活外周血中更多的DC和B細(xì)胞,并且能產(chǎn)生較高的中和抗體水平。虞凌雪[20]構(gòu)建了表達(dá)豬GM-CSF重組PRRSV弱毒疫苗株,動(dòng)物試驗(yàn)表明重組病毒PRRSV抗體水平顯著高于親本疫苗病毒免疫組,且重組病毒免疫組誘導(dǎo)活化的CD8+T淋巴細(xì)胞和CD4+T淋巴細(xì)胞比例均顯著高于親本疫苗毒免疫組。GUO等[21]構(gòu)建了表達(dá)雞粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞的重組新城疫(NDV)病毒,研究表明重組病毒可有效提高NDV特異性抗體滴度。以上研究結(jié)果表明,嵌合GM-CSF疫苗株可有效提高毒株的特異性和中和抗體水平,提高機(jī)體免疫應(yīng)答能力。

為了更好地提高SVA滅活苗的免疫水平,本研究在SVA反向遺傳操作平臺(tái)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)豬源GM-CSF的重組病毒rSVA-GM-CSF,該病毒具有與親本毒相似的增殖特性,且具有良好遺傳穩(wěn)定性,可作為提高機(jī)體免疫水平的新型疫苗備選株,為在機(jī)體內(nèi)對(duì)重組病毒rSVA-GM-CSF進(jìn)行免疫效力評(píng)價(jià)奠定了基礎(chǔ)。