擬穴青蟹四種形態(tài)群體的形態(tài)比較和聚類分析

甄夢(mèng)婷，胡韻月，高麗娟，申情雨，吳露晨，劉子明

（麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院，浙江 麗水 323000）

0 引言

擬穴青蟹（Scylla paramamosain）是梭子蟹科中體型最大、生長(zhǎng)較快、適應(yīng)性強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)蟹類，具有肉味鮮美、營養(yǎng)豐富和藥用價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)。近年來，我國青蟹的生產(chǎn)規(guī)模不斷擴(kuò)大，2021年捕撈產(chǎn)量高于7萬噸，養(yǎng)殖產(chǎn)量超過16萬噸［1］。作為傳統(tǒng)出口水產(chǎn)品和主要養(yǎng)殖品種之一，青蟹產(chǎn)業(yè)已成為我國東南沿海漁業(yè)的重要組成部分。雖然我國青蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，但人工育苗產(chǎn)量有限，養(yǎng)殖苗種主要來源于野生蟹苗［2］。捕撈自不同區(qū)域的蟹苗在全國范圍內(nèi)調(diào)運(yùn)，未進(jìn)行區(qū)分便混養(yǎng)在一起，易造成不同地理群體間的種質(zhì)混雜，進(jìn)而降低青蟹種群多樣性。為合理開發(fā)和保護(hù)青蟹自然資源，并規(guī)范青蟹養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)，開展青蟹種群遺傳多樣性的研究顯得十分重要。

青蟹廣泛分布于我國東南沿海的不同海區(qū)，緯度高和緯度低的東南海區(qū)其季節(jié)水溫變化存在很大差異。例如：浙江屬亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，夏季高溫，冬季水溫可低于零度；海南屬熱帶季風(fēng)氣候，長(zhǎng)夏無冬，在最冷的一月份水溫仍可達(dá)到17～24 ℃。經(jīng)過漫長(zhǎng)歷史的適應(yīng)，不同地理群體的青蟹對(duì)溫度變化的響應(yīng)機(jī)制可能存在可遺傳的代謝差異?；诖?，我們開展 “擬穴青蟹不同群體對(duì)溫度變化的適應(yīng)性機(jī)制研究” ，并取得了一些成果：將擬穴青蟹分為 “一對(duì)螯足腕節(jié)外緣中部都不具有發(fā)達(dá)的刺——多數(shù)個(gè)體” 與 “至少一只螯足腕節(jié)外緣中部具有發(fā)達(dá)的刺——少數(shù)個(gè)體” 兩大類形態(tài)群體，比較這兩個(gè)群體線粒體呼吸速率和呼吸酶活性的季節(jié)變化，結(jié)果表明這兩個(gè)群體呼吸代謝的季節(jié)變化模式差異很顯著［3］；棲息于浙江、福建和海南的擬穴青蟹群體其線粒體呼吸速率存在顯著差異，在緯度越高的海區(qū)兩個(gè)形態(tài)群體線粒體呼吸速率的差異越大［4］；在37℃高溫應(yīng)激中擬穴青蟹兩個(gè)形態(tài)群體抗氧化酶活性和熱休克蛋白表達(dá)呈現(xiàn)出不一致的響應(yīng)機(jī)制［5］；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，低溫應(yīng)激第6 h在兩個(gè)形態(tài)群體的肝胰腺中檢測(cè)到264個(gè)差異表達(dá)基因［6］，同時(shí)采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)到4個(gè)與低溫適應(yīng)相關(guān)的基因［7］。

前期研究結(jié)果表明：擬穴青蟹兩大類形態(tài)群體的生理生化代謝存在顯著差異，且形態(tài)群體的進(jìn)一步細(xì)分將有助于闡明擬穴青蟹不同群體的遺傳多樣性。本文在已有工作積累的基礎(chǔ)上，根據(jù)左螯足和右螯足腕節(jié)外緣刺的數(shù)量進(jìn)一步將擬穴青蟹細(xì)分為四種不同形態(tài)的群體，采用形態(tài)學(xué)方法比較四種形態(tài)群體的主要形態(tài)特征差異并對(duì)其進(jìn)行聚類分析，探究擬穴青蟹四種形態(tài)群體的表型多樣性。這項(xiàng)工作的開展將有利于擬穴青蟹種質(zhì)資源的開發(fā)和保護(hù)及其水產(chǎn)養(yǎng)殖的生產(chǎn)和管理。

1 材料與方法

1.1 青蟹采集和鑒定

80 只肢體完整、大小相似的雄性青蟹采集自福建省泉州海區(qū)，參照Keenan 等［8］的方法鑒定擬穴青蟹：（1）頭胸甲背面無白色斑點(diǎn)，其顏色與螯足相似（圖1-a）；（2）頭胸甲額緣4 齒長(zhǎng)度長(zhǎng)，尖銳，呈三角形（圖1-b）；（3）最后兩對(duì)附肢上網(wǎng)格狀圖案不明顯，圖案顏色較淡（圖1-c）。再基于左螯足腕節(jié)外緣有1 根刺（圖1-d）、右螯足腕節(jié)外緣有1 根刺（圖1-e）、左螯足腕節(jié)外緣有2 根刺（圖1-f）、右螯足腕節(jié)外緣有2 根刺（圖1-g）這4個(gè)特征將擬穴青蟹分為四種不同形態(tài)的個(gè)體：Z1Y1（圖1-A）、Z2Y1（圖1-B）、Z1Y2（圖1-C）、Z2Y2（圖1-D）。

圖1 擬穴青蟹四種形態(tài)個(gè)體的主要形態(tài)特征

1.2 形態(tài)測(cè)量

參照Keenan 等［8］的方法測(cè)量擬穴青蟹的形態(tài)參數(shù)，Keenan 等共測(cè)定青蟹23 個(gè)形態(tài)指標(biāo)，包括頭胸甲長(zhǎng)、頭胸甲寬、頭胸甲內(nèi)寬、第八齒頭胸甲寬、頭胸甲后部寬、腹部寬、腹甲寬、額緣寬、額緣中齒距、額緣側(cè)齒距、額緣中齒高、第3 步足長(zhǎng)節(jié)長(zhǎng)、第5步足指節(jié)長(zhǎng)、第5步足指節(jié)寬、螯足長(zhǎng)節(jié)長(zhǎng)、螯足指節(jié)長(zhǎng)、螯足腕節(jié)外刺、螯足腕節(jié)內(nèi)刺、螯足掌節(jié)外刺、螯足掌節(jié)內(nèi)刺、螯足掌節(jié)高、螯足掌節(jié)長(zhǎng)、螯足掌節(jié)寬。前期研究結(jié)果顯示，擬穴青蟹左螯足和右螯足的形態(tài)測(cè)定指標(biāo)可能存在差異，故實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定左螯足和右螯足的形態(tài)指標(biāo)，一共測(cè)量30 個(gè)形態(tài)參數(shù)指標(biāo)。參照Keenan 等［8］的方法將這30個(gè)形態(tài)參數(shù)換算得到34個(gè)形態(tài)比值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。根據(jù)34 個(gè)形態(tài)比值對(duì)擬穴青蟹四種形態(tài)群體進(jìn)行單因素方差分析和聚類分析。單因素方差分析中任意兩個(gè)形態(tài)群體的顯著差異性分析采用LSD（least significant digit，最低有效位）法多重比較，聚類方法為歐氏距離的最短距離系統(tǒng)聚類法。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 四種形態(tài)群體的采樣和鑒定

經(jīng)形態(tài)鑒定，采集的80只青蟹均為擬穴青蟹，未發(fā)現(xiàn)鋸緣青蟹、紫螯青蟹和欖綠青蟹。采集的擬穴青蟹中近三分之二個(gè)體為Z1Y1 群體，Z1Y2、Z2Y1 和Z2Y2 群體的數(shù)量比例分別為12.50%、11.25%和10.00%。單因素方差分析的結(jié)果表明擬穴青蟹四種形態(tài)群體之間的殼寬和體質(zhì)量均無顯著差異（表1）。

表1 擬穴青蟹四種形態(tài)群體的數(shù)量比例、殼寬和體質(zhì)量

2.2 四種形態(tài)群體形態(tài)比值的比較

測(cè)定的34 個(gè)形態(tài)參數(shù)比值中，四種形態(tài)群體的比較有19 個(gè)指標(biāo)達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05）（表2），15個(gè)指標(biāo)未達(dá)到顯著差異水平（表3）。數(shù)量最多的Z1Y1 群體分別有6、11、13 個(gè)指標(biāo)與Z2Y1、Z2Y2、Z1Y2 群體的比較達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05）。其中右螯足掌節(jié)長(zhǎng)/頭胸甲內(nèi)寬、右螯足掌節(jié)寬/右螯足掌節(jié)長(zhǎng)、右螯足掌節(jié)高/右螯足掌節(jié)長(zhǎng)、右螯足掌節(jié)寬*右螯足掌節(jié)高/右螯足掌節(jié)長(zhǎng)、右螯足掌節(jié)外刺/右螯足掌節(jié)長(zhǎng)這5 個(gè)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果均表現(xiàn)為Z1Y1 和Z2Y1 群體的數(shù)值與Z1Y2和Z2Y2群體的數(shù)值存在顯著差異（P＜0.05）。右螯足指節(jié)長(zhǎng)/右螯足掌節(jié)長(zhǎng)、右螯足掌節(jié)內(nèi)刺/右螯足掌節(jié)長(zhǎng)、左螯足長(zhǎng)節(jié)長(zhǎng)/左螯足掌節(jié)長(zhǎng)這3 個(gè)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果均表現(xiàn)為Z1Y1 群體的數(shù)值與Z1Y2和Z2Y2群體的數(shù)值存在顯著差異（P＜0.05）。四種形態(tài)群體形態(tài)特征差異的詳細(xì)情況見表2。

2.3 四種形態(tài)群體的聚類情況

基于34個(gè)形態(tài)參數(shù)比值，80只擬穴青蟹的聚類分析結(jié)果如圖2所示。最先由21只青蟹聚成的分支中，Z1Y1 群體有18 只，剩余3 只都為Z2Y1 群體。最后聚入的7 只青蟹均不屬Z1Y1 群體，其中Z2Y1群體有3只（Z2Y1-1、2、5），Z1Y2群體有2只（Z1Y2-1、4），Z2Y2群體有2只（Z2Y2-1、8）。對(duì)于Z1Y1 群體，Z1Y1-1、4、15、24、37、53；Z1Y1-6、11、12、18、31、43；Z1Y1-25、28、29、51；Z1Y1-2、9、21、45 都單獨(dú)聚為一個(gè)小分支。由11 只青蟹聚成的小分支中，有6只青蟹（Z1Y2-2、5、6、7、8、10）均為Z1Y2群體，占Z1Y2群體總數(shù)的54.55%。

圖2 擬穴青蟹四種形態(tài)群體的聚類圖

3 討論

3.1 青蟹形態(tài)鑒定

青蟹螯足腕節(jié)外緣刺的數(shù)量是青蟹屬分類鑒定的重要依據(jù)之一。在Keenan 等［8］的青蟹屬分類檢索系統(tǒng)中，4種青蟹根據(jù)習(xí)性和形態(tài)可分為Mamosain 和Banhawin 兩大類。Mamosain 指的是體型較小、會(huì)挖穴的青蟹，即擬穴青蟹（S.paramamosain）和欖綠青蟹（S.olivacea），這類青蟹的螯足腕節(jié)外緣中部的刺退化且甲殼背面沒有白色斑點(diǎn)。Banhawin 指的是體型較大、行自由生活的青蟹，即鋸緣青蟹（S.serrata）和紫螯青蟹（S.tranquebarica），這兩種青蟹的螯足腕節(jié)外緣有兩根發(fā)達(dá)的刺且甲殼背面有白色斑點(diǎn)。然而，林琪等［9］采集中國東南沿海13個(gè)地區(qū)的擬穴青蟹進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)擬穴青蟹有33.3%未成熟個(gè)體的螯足腕節(jié)外緣有兩根發(fā)達(dá)的刺。本實(shí)驗(yàn)的采樣和鑒定結(jié)果表明，左螯足或右螯足腕節(jié)外緣有兩根發(fā)達(dá)刺的擬穴青蟹（Z1Y2、Z2Y1 和Z2Y2）其數(shù)量比例為33.75%，這與林琪等［9］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。由此可知，不能憑借螯足腕節(jié)外緣刺的數(shù)量這一特征來鑒別擬穴青蟹。

3.2 四種形態(tài)群體的形態(tài)特征差異

形態(tài)特征測(cè)量是種質(zhì)資源鑒定的常用方法之一，具有簡(jiǎn)單、快速、直觀的優(yōu)點(diǎn)。喻國洪等［10］比較擬穴青蟹（S.paramamosain）浙江寧波和越南群體的24 個(gè)形態(tài)參數(shù)比值，結(jié)果顯示兩個(gè)地理群體的形態(tài)差異主要集中在頭胸甲，其中寧波群體的頭胸甲長(zhǎng)/頭胸甲寬和腹部寬/頭胸甲寬比越南群體大，體高/頭胸甲寬比越南群體小。姜曉東等［11］采用地標(biāo)點(diǎn)法比較中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）中國長(zhǎng)江和荷蘭群體頭胸甲的形態(tài)差異，結(jié)果顯示兩個(gè)地理群體形態(tài)特征的主要差異為頭胸甲邊緣額刺和側(cè)刺的位置，且選取5個(gè)貢獻(xiàn)率大的變量建立判別方程，長(zhǎng)江和荷蘭群體的判別準(zhǔn)確率都為100%。本實(shí)驗(yàn)比較擬穴青蟹四種形態(tài)群體之間的形態(tài)差異，測(cè)得的19個(gè)顯著形態(tài)參數(shù)比值中，18 個(gè)指標(biāo)均為左螯足或右螯足的差異，頭胸甲的形態(tài)差異只有1 個(gè)（額緣中齒高/額緣中齒距），原因可能在于擬穴青蟹這四種群體的劃分本身就是基于螯足形態(tài)的差異——左螯足和右螯足腕節(jié)外緣刺的數(shù)量。將擬穴青蟹分為兩大類形態(tài)群體（Z1Y1 群體和其他三種形態(tài)群體），前期研究結(jié)果表明在季節(jié)馴化、不同緯度、高溫應(yīng)激和低溫應(yīng)激條件下擬穴青蟹這兩類形態(tài)群體的生理、生化和分子水平上均存在著代謝差異［3-7］。對(duì)于四種形態(tài)群體之間的形態(tài)特征差異，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明數(shù)量最多的Z1Y1 群體與其他三種形態(tài)群體的差異最為明顯，這與前期的多個(gè)研究結(jié)果相呼應(yīng)。由此說明左右螯足腕節(jié)外緣都只有一根刺與左螯足或右螯足腕節(jié)外緣有兩根刺的擬穴青蟹在形態(tài)和代謝水平上有著明顯的區(qū)別。

3.3 四種形態(tài)群體的聚類分析

有關(guān)魚、蝦、貝、蟹等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物群體多樣性的形態(tài)學(xué)研究，研究對(duì)象主要集中在不同地理群體［11-14］。結(jié)合多年的探究結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)首次將擬穴青蟹分為四種形態(tài)群體進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，80只擬穴青蟹的聚類分析結(jié)果顯示：Z1Y1 群體的有些個(gè)體能夠獨(dú)自地聚為一小支，Z1Y2 群體有一半多的個(gè)體聚在一塊，最后聚入的7只青蟹都是數(shù)量很少的Z1Y2、Z2Y1、Z2Y2 群體，這些都表明擬穴青蟹這四類形態(tài)群體有一定程度的表型分化，也再一次說明群體多樣性研究中將擬穴青蟹劃分為四種形態(tài)群體具有可行性。對(duì)于四種形態(tài)群體之間的形態(tài)差異比較，在最先聚集的分支中共有21只青蟹，其中18 只為Z1Y1 群體，剩余3 只為Z2Y1群體，這說明相比Z1Y2和Z2Y2群體，Z1Y1群體與Z2Y1群體的形態(tài)相似度更高。此外，相比Z1Y2群體的13 個(gè)和Z2Y2 群體的11 個(gè)形態(tài)參數(shù)比值，Z2Y1 群體只有6 個(gè)形態(tài)參數(shù)比值與Z1Y1 群體的比較達(dá)到顯著差異水平，這同樣說明相較于Z1Y2和Z2Y2 群體，Z1Y1 和Z2Y1 這兩個(gè)群體的形態(tài)特征更為相似。一般而言，水生動(dòng)物的形態(tài)特征往往與其棲息的環(huán)境相適應(yīng)。此外，水環(huán)境的溫度、酸堿度、硬度，土壤底質(zhì)，捕食關(guān)系等因素也會(huì)對(duì)動(dòng)物的外部形態(tài)產(chǎn)生影響［15］。因此，在今后的研究中，筆者將從基因水平進(jìn)一步揭示擬穴青蟹這四個(gè)形態(tài)群體的遺傳差異，為擬穴青蟹種質(zhì)資源的開發(fā)和保護(hù)奠定相關(guān)的基礎(chǔ)。