陽離子固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜法測定食品中生物堿

陳衛(wèi)平，何志豪，王偉影，章小洪，陳 夢

（麗水市質(zhì)量檢驗檢測研究院，浙江 麗水 323000）

罌粟殼屬于國家管制藥品，具有止咳、鎮(zhèn)痛等功效，但也存在一定成癮性，部分不法商販利用其成癮性特點在食品中非法添加罌粟殼以達到吸引回頭客的目的［1-2］。目前食品中罌粟殼生物堿的檢測方法尚無國家標準?！妒称钒踩O(jiān)督抽檢實施細則（2022 年版）》［3］明確的檢測方法是2018 國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布的BJS 201802《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》規(guī)定的方法［4］，該法僅限于調(diào)味品和火鍋食品，適用范圍小，對于可能添加罌粟殼生物堿的食品，例如對調(diào)味面制品、功能性飲料等不適用。目前尚未發(fā)現(xiàn)同時針對高油脂、高蛋白、高水分食品中罌粟殼生物堿的相關檢測報道。本研究選取了4 種有代表性的食品（火鍋底料、醬鹵肉、調(diào)味面制品、功能性飲料）作為研究對象，采用陽離子固相萃取柱對樣品進行凈化，優(yōu)化色譜和質(zhì)譜條件，考察基質(zhì)效應的影響，運用陽離子固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜法測定食品中5種罌粟殼生物堿，旨在擴展食品中罌粟殼生物堿的檢測范圍，為檢測食品中罌粟殼生物堿殘留量提供技術支撐。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

高效液相色譜-質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；超純水發(fā)生器（德國Think-lab公司）；ST16高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；Micro17高速離心機（美國Thermo Fisher公司）；DMT-2500多管渦旋混合儀（杭州米歐公司）；MS3 basic渦旋（德國IKA公司）。

1.2 試劑

嗎啡（含量：97.9%，批號：171201-201123，中國藥品生物制品檢定所）；可待因（含量：100%，批號：171203-200303，中國藥品生物制品檢定所）；罌粟堿（含量：99.9%，批號：0704-RA-0012，CATO）；那可?。ê浚?8.32%，批號：TC201128-18，Stanford Chemicals）；蒂巴因（含量：100%，批號：171216-200403，中國藥品生物制品檢定所）；甲醇、乙腈（色譜純，美國默克公司）；鹽酸（優(yōu)級純，廣東西隴科學）；甲酸、氨水（色譜純，上海CNW公司）；甲酸銨（色譜純，美國Fisher Scientific 公司）；MCX固相萃取柱（500 mg/6mL，北京凱斯科公司）；SCX 固相萃取柱（500 mg/6mL，北京凱斯科公司）；WCX固相萃取柱（500 mg/6mL，上海艾杰爾公司）；有機相濾膜（0.22 μm，天津津騰公司）；Acquity UPLC BEH HILIC 色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm，美國沃特世公司）。

2 方法與結果

2.1 品前處理

提取：準確稱取混勻試樣2 g 于50 mL 離心管中，加入25 mL 0.1 mol/L 鹽酸溶液-乙腈（體積比1∶4），渦旋振蕩1 min，4 000 r/min 離心5 min，提取液待凈化。

凈化：MCX 固相萃取柱依次用6 mL 乙腈、6 mL 水活化，準確移取5 mL 提取液以2～3 mL/min 的速度上柱，依次用6 mL 水、6 mL 乙腈淋洗，最后用6 mL 5%氨化乙腈洗脫，收集洗脫液，40 ℃水浴旋蒸至近干，氮氣吹干，加入1 mL 乙腈復溶，經(jīng)0.22 μm 有機相濾膜過濾，供高效液相色譜-質(zhì)譜儀測定。

2.2 標準溶液的配制

準確稱取5 種生物堿標準品，用體積分數(shù)為0.5%的甲酸甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL的標準儲備液，準確吸取那可丁、罌粟堿、蒂巴因標準儲備液各1.0 mL，可待因、嗎啡標準儲備液各5.0 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈定容，搖勻，作為混合標準溶液。移取適量混合標準溶液用空白樣品提取液配制基質(zhì)標準工作溶液，罌粟堿、那可丁、蒂巴因質(zhì)量濃度為1、2、5、10、50、100 ng/mL，嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為5、10、25、50、250、500 ng/mL。

2.3 儀器條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱：HILIC 色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.7 μm）；進樣量：1 μL；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；梯度洗脫程序及流動相見表1。

2.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子；載氣：高純氮氣；碰撞氣：高純氬氣；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：500 ℃；毛細管電壓：3.0 kV；檢測方式：多反應監(jiān)測；其他參數(shù)見表2。在該儀器條件下，標準溶液的色譜圖見圖1。

圖1 5種生物堿和2種同位素內(nèi)標的總離子流圖

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2.4 線性關系、檢出限與定量限

分別吸取混合標準溶液適量，用空白樣品提取液稀釋液配制基質(zhì)標準工作溶液，那可丁、蒂巴因、罌粟堿質(zhì)量濃度為1、2、5、10、50、100 ng/mL，嗎啡、可待因質(zhì)量濃度為5、10、25、50、250、500 ng/mL，采用外標法定量，以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，分別以5 種生物堿色譜峰的3倍信噪比和10倍信噪比對應的質(zhì)量分數(shù)來計算檢出限、定量限，見表3。

表3 標準工作曲線、檢出限和定量限

2.5 回收率與精密度

取空白樣品（火鍋底料、醬鹵肉、調(diào)味面制品、功能性飲料）添加低、中、高（5、25、50 μg/kg）質(zhì)量分數(shù)水平的混合標準溶液進行回收率試驗，每個質(zhì)量分數(shù)水平重復測定6 次，回收率64.6%～110.9%，相對標準偏差1.2%～15.5%（表4），試驗結果符合GB/T 27403—2008檢測方法確認的技術要求，表明本方法具有較好的通用性。

表4 回收率和精密度

2.6 實際樣品分析

對市售的20 份食品樣品（火鍋底料、醬鹵肉、調(diào)味面制品、功能性飲料各5 份）采用筆者所建立的試驗方法進行測定，其中有一份火鍋底料疑似檢出罌粟殼生物堿，質(zhì)量分數(shù)為47.6 μg/kg，為排除其假陽性情況，將進一步采用高分辨質(zhì)譜儀進行定性確證［5-6］。

3 討論

3.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

5種生物堿呈堿性或兩性，在酸性條件下形成易溶于水的鹽類，樣品用乙腈提取，提取液經(jīng)鹽析處理后轉(zhuǎn)移至乙腈相中，本試驗分別考察了0.1 mol/L 鹽酸溶液-乙腈（體積比1∶1）、0.1 mol/L鹽酸溶液-乙腈（體積比1∶2）、0.1 mol/L鹽酸溶液-乙腈（體積比1∶4）作為提取溶劑的提取效果。以體積比1∶1為提取溶劑時，提取效率低且樣品易乳化，隨著提取溶劑有機相比例升高，嗎啡、可待因的回收率有一定程度提高，因此選擇0.1 mol/L 鹽酸溶液-乙腈（體積比1∶4）作為提取溶劑。

目前文獻報道的前處理方法主要是操作簡便的QuEChERS 法［7-8］，然而在試驗過程中發(fā)現(xiàn)分散固相萃取劑C18、PSA對嗎啡和可待因的吸附能力較強，易導致回收率較低，固相萃取法［9-10］利用吸附劑將樣品中的目標化合物吸附然后再洗脫，實現(xiàn)目標物的分離和富集，增強對分析物的檢出能力。生物堿鹽酸溶液提取后呈陽離子狀態(tài)，因此考慮采用陽離子固相萃取柱。筆者選擇離子交換能力不同的固相萃取柱凈化樣品提取液，SCX 強陽離子固相萃取柱、MCX 弱陽離子固相萃取柱、WCX 弱陽離子固相萃取柱，回收率結果如圖2 所示。結果顯示樣品提取液經(jīng)SCX 柱凈化后5 種罌粟殼生物堿回收率均較差，經(jīng)WCX 柱凈化后罌粟堿、蒂巴因和那可丁回收率有一定程度提升，然而嗎啡、可待因回收率低于10%，經(jīng)MCX 柱凈化后，生物堿回收率為47.0%～94.3%。綜合考慮目標物回收率和基質(zhì)效應的影響，選擇MCX柱凈化樣品。

圖2 采用不同固相萃取柱時5種生物堿的回收率

3.2 色譜條件的優(yōu)化

生物堿多呈弱堿性、極性強，在普通的C18 柱上難以實現(xiàn)保留，筆者考慮目標物極性強的特點選擇BEH HILIC 親水色譜柱，并結合高比例有機相、低比例水相實現(xiàn)對極性化合物的保留。由于可待因和嗎啡極性相似難以分離，現(xiàn)有文獻報道的色譜方法均未能實現(xiàn)有效分離。筆者以甲酸銨為流動相，用甲酸調(diào)節(jié)流動相pH至5.5，使pH小于目標物pKa（酸度系數(shù)），增強目標物保留能力，同時在酸性條件下提升了質(zhì)譜離子化效率，5種生物堿實現(xiàn)完全分離，色譜峰型好，靈敏度高，具體見圖1。

3.3 基質(zhì)效應消除

采用高效液相色譜-質(zhì)譜法分析樣品時，基質(zhì)效應在一定程度上會影響定量的準確性［11-12］，樣品類型及樣品前處理過程均會對基質(zhì)效應產(chǎn)生不同程度的影響。為減弱基質(zhì)效應的影響，可以采用空白樣品的提取溶液作為標準溶液的稀釋液，用相同的離子化條件來消除樣品的基質(zhì)效應。試驗證明采用基質(zhì)標準曲線能有效降低樣品基質(zhì)對嗎啡、可待因和那可丁的響應，提高樣品回收率。

本研究運用陽離子固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜法測定高油脂、高蛋白、高水分食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的殘留量，方法準確性高，樣品適用性強，有效擴展了罌粟殼生物堿的檢測范圍，研究結果可為食品安全領域監(jiān)管提供有力支撐。