用于識(shí)別細(xì)菌的有機(jī)熒光探針研究進(jìn)展

劉志偉,袁振偉

(中國藥科大學(xué) 工學(xué)院,江蘇 南京 211198)

青霉素的出現(xiàn)曾被認(rèn)為是人類現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和健康領(lǐng)域的一座豐碑,在二戰(zhàn)爭期間挽救了無數(shù)的生命。然而,隨著抗生素的廣泛使用,多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)越來越普遍。特別是那些接受過外科移植和癌癥治療的人更容易受到細(xì)菌感染。事實(shí)上,抗菌素耐藥性已被世界衛(wèi)生組織宣布為對(duì)人類健康的十大威脅之一[1]。 根據(jù)WHO的統(tǒng)計(jì),到2035年耐藥菌感染將超越癌癥成為造成人類死亡(每年1 000萬人)的主要原因[2]。因此,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌感染早期檢測(cè)在細(xì)菌感染治療中起著至關(guān)重要的作用,不僅可以篩選合適的抗生素,而且可以將益生菌與感染菌分選出來。目前臨床采用的細(xì)菌檢測(cè)方法是基于患者臨床標(biāo)本(血、尿、痰)進(jìn)行的組織活檢和細(xì)菌培養(yǎng),這些操作不僅耗時(shí)費(fèi)力,而且臨床樣本取樣過程中不可避免地被污染,因此并不能反映真實(shí)的細(xì)菌情況。雖然新技術(shù)的細(xì)菌檢測(cè)已經(jīng)發(fā)展,如電化學(xué)測(cè)量[3], 實(shí)時(shí)的聚合酶鏈反應(yīng)[4],表面強(qiáng)化的拉曼散射[5]等,但這些技術(shù)需要復(fù)雜的專業(yè)操作,同時(shí)缺乏足夠的靈敏度。與上述方法和技術(shù)相比,基于熒光探針的熒光成像用來檢測(cè)細(xì)菌感染是一種快速、可行的方法,其中熒光探針是一種精巧、靈敏的工具可以有效地對(duì)細(xì)菌進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。本文總結(jié)了目前存在的能夠可視化檢測(cè)細(xì)菌和感染的探針。這些探針根據(jù)其識(shí)別細(xì)菌的機(jī)制可分為共價(jià)結(jié)合型熒光探針和代謝標(biāo)記型熒光探針。

1 基于化學(xué)結(jié)合策略的細(xì)菌識(shí)別熒光探針研究進(jìn)展

與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞膜成分不同,細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞膜外有一層細(xì)胞壁,使細(xì)菌細(xì)胞免受惡劣環(huán)境的侵害。細(xì)菌的細(xì)胞壁是一個(gè)相當(dāng)豐富和復(fù)雜的結(jié)構(gòu),并且有許多獨(dú)特的成分,如肽聚糖、脂多糖和分支菌酸,因此,細(xì)菌的細(xì)胞壁被認(rèn)為是檢測(cè)和識(shí)別細(xì)菌的理想靶點(diǎn),根據(jù)與細(xì)菌細(xì)胞壁上化學(xué)結(jié)合物的不同,基于化學(xué)結(jié)合策略的細(xì)菌探針包括基于抗生素結(jié)構(gòu)的探針、基于鋅(Ⅱ)二甲基吡啶胺和基于其它結(jié)構(gòu)的探針。

1.1 基于抗生素結(jié)構(gòu)的細(xì)菌識(shí)別探針研究進(jìn)展

抗生素通過破壞細(xì)菌形態(tài)以及干擾功能底物的生物合成過程來消滅細(xì)菌,也就是說,具有與細(xì)菌結(jié)合能力的抗生素被認(rèn)為是一種合理的細(xì)菌成像和可視化探針識(shí)別基團(tuán)[6]。目前為止臨床上批準(zhǔn)用于治療細(xì)菌感染的抗生素有6種,其中β-內(nèi)酰胺、碳青霉烯類萬古霉素和多粘菌素B啟發(fā)了一系列檢測(cè)細(xì)菌探針的設(shè)計(jì)。

1.1.1 基于B-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)的細(xì)菌探針研究進(jìn)展

細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖(PG),它可以有效維持細(xì)菌的形狀并保護(hù)它免受膨脹壓力。PG是由b-(1,4)-連接的n-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰氨基葡萄糖(MurNAc)酸聚糖鏈和含有4～5個(gè)氨基酸的多肽鏈組成的聚合物結(jié)構(gòu),如圖1所示,青霉素結(jié)合蛋白(PBP)作為轉(zhuǎn)肽酶將D-丙氨酸(D-Ala)的羧基和L-賴氨酸的氨基交聯(lián)成肽聚糖。B-內(nèi)酰胺類抗生素通過與青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合抑制肽聚糖正常交聯(lián)使肽聚糖不能常規(guī)合成而導(dǎo)致細(xì)菌裂解。

圖1 細(xì)菌肽聚糖的結(jié)構(gòu)

b-內(nèi)酰胺類抗生素為細(xì)菌成像提供了理想的識(shí)別基團(tuán)。熒光標(biāo)記的b-內(nèi)酰胺類抗生素,如BODIPY偶聯(lián)青霉素V類似物Bocilin(圖2A)[7], 已被用于識(shí)別細(xì)菌以及檢測(cè)活細(xì)菌中的PBP活性,這種策略也被稱為基于活性的蛋白標(biāo)[8-9]。此外一系列基于b-內(nèi)酰胺類抗生素的熒光探針已經(jīng)被陸續(xù)開發(fā)出來。Carlson[10]通過將四甲基羅丹明的熒光基團(tuán)偶聯(lián)到頭孢菌素C的骨架上計(jì)并合成了一種含頭孢菌素C的探針(圖2B),體外細(xì)菌培養(yǎng)證明了CephC-T可以實(shí)現(xiàn)枯草芽孢桿菌PY79和D39肺炎鏈球菌的特異性體內(nèi)成像。Xie[11]通過將頭孢噻肟與4-羥基-1,8-萘酰亞胺(HN)進(jìn)行偶聯(lián)構(gòu)建了一種比例型熒光探針CTX-HN(圖2C),其結(jié)構(gòu)中頭孢噻肟作為b內(nèi)酰胺酶識(shí)別片段,對(duì)ESBLs具有較好的選擇性而不被其它b-內(nèi)酰胺酶水解,在370 nm激發(fā)時(shí),PBS中的CTX-HN在455 nm處熒光強(qiáng)烈,加入廣譜b-內(nèi)酰胺酶(ESBL)后CTX-HN的β-內(nèi)酰胺環(huán)被水解并釋放HN后,從而使得HN在455 nm處的發(fā)射逐漸降低,同時(shí)由于HN的大斯托克斯位移,560 nm處的發(fā)射增強(qiáng)(在450 nm激發(fā))。在560 nm和455 nm處發(fā)射比的最大變化可達(dá)2 667倍。通過這種方法,CTH-HN可以有效區(qū)分產(chǎn)ESBL的耐藥菌(ESPO)與一般細(xì)菌。

(A)Bocilin;(B)CephC-T;(C)CTX-HN。

1.1.2 基于碳青霉烯結(jié)構(gòu)的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

碳青霉烯類抗生素在β-內(nèi)酰胺環(huán)上具有反式取代基,阻止了大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶的水解從而可以被碳青霉烯酶選擇性水解,因此碳青霉烯類抗生素探針有潛力作為探針的識(shí)別片段檢測(cè)碳青霉烯酶產(chǎn)生菌(CPO),這是近年來迫切需要解決的一種引起嚴(yán)重感染的耐多藥細(xì)菌[12]。Xie[13]設(shè)計(jì)了一種對(duì)CPO特異性響應(yīng)的熒光探針CB-1(圖3A)。CB-1以碳青霉烯母環(huán)為碳青霉烯酶識(shí)別基團(tuán)。因?yàn)樘记嗝瓜┙Y(jié)構(gòu)的取代有效猝滅了BODIPY熒光發(fā)射因此CB-1最初是無熒光的(與未取代BODIPY相比),一旦與CPO接觸后,碳青霉烯酶會(huì)特異性水解CB-1從而產(chǎn)生不穩(wěn)定的二胺I,二胺I會(huì)進(jìn)一步自發(fā)異構(gòu)化或降解,破壞碳青霉烯酶與BODIPY的偶聯(lián),從而恢復(fù)BODIPY的強(qiáng)綠色熒光信號(hào)發(fā)射。Min[14]設(shè)計(jì)了以碳青霉烯母環(huán)為識(shí)別基團(tuán),苯基醚為連接體,香豆素為響應(yīng)基團(tuán)的探針1b(圖3B)。1b可以全面識(shí)別產(chǎn)生各類碳青霉烯類酶的耐藥菌。1b與產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科(CPE)臨床標(biāo)本孵育后,1b可以發(fā)出明顯的熒光信號(hào),證明探針1b具有良好的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性。Yang[15]提出了一種比色型熒光探針CARBA-H(圖3C),CARBA-H通過甲氧基苯基醚為連接體將識(shí)別片段與間萘酚的熒光團(tuán)結(jié)合。CARBA-H與產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科(CPE)一起培養(yǎng)后,CARBA-H結(jié)構(gòu)中的碳青霉烯母環(huán)會(huì)被碳青霉烯酶水解從而恢復(fù)間萘酚的熒光發(fā)射信號(hào),因此CARBA-H可以實(shí)現(xiàn)對(duì)包括產(chǎn)Ambler在內(nèi)的所有三個(gè)類別的碳青霉烯酶的廣泛特異性鑒定和CPE臨床分離株的熒光成像,特別是產(chǎn)OXA-48和oxa-181類型碳青霉烯酶的耐藥菌株。

(A)CB-1;(B)1b;(C)CARBA-H。

1.1.3 基于萬古霉素結(jié)構(gòu)的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

萬古霉素(Van)是一種糖肽類抗生素,能特異性結(jié)合革蘭氏陽性菌壁上的D-Ala-D-Ala序列,從而使得萬古霉素成為構(gòu)建革蘭氏陽性菌特異性識(shí)別熒光探針的理想化識(shí)別基團(tuán)。Dijl and Dam[16]通過將萬古霉素偶聯(lián)到近紅外(NIR)熒光團(tuán)IR-Dye 800CW設(shè)計(jì)了革蘭氏陽性細(xì)菌識(shí)別探針Vanco-800CW(圖4A),Vanco-800CW既可以對(duì)實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠體內(nèi)革蘭氏陽性細(xì)菌感染模型活體成像,也可以對(duì)死亡的革蘭氏陽性菌進(jìn)行成像。Xu[17]以FeCl3為氧化劑構(gòu)建聚芴基噻吩-3-乙酸酯(PFPTA),所得聚噻吩(PFPTA)聚合物再與Van和a-甲氧基-鄰氨基聚乙二醇(mPEG-NH2)通過酯胺反應(yīng)偶聯(lián),成功構(gòu)建熒光探針PTPVan(圖4C)。

在體外MRSA培養(yǎng)模型中,PTPVan可作為革蘭氏陽性細(xì)菌的熒光探針對(duì)MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)進(jìn)行長時(shí)間的有效示蹤。受到聚集誘導(dǎo)發(fā)光熒光團(tuán)(AIEgen)優(yōu)越的光學(xué)性能的啟發(fā),Liu[18]通過在自組裝多肽鏈兩側(cè)分別偶聯(lián)和AIEgen成功構(gòu)建具有革蘭氏陽性菌診療一體化功能的探針E-Probe(圖4C)。E-probe與接觸后,可與MRSA表面共價(jià)結(jié)合并進(jìn)一步自組裝形成納米聚集體,激發(fā)光下E-Probe發(fā)光熒光信號(hào)并同時(shí)觸發(fā)活性氧(ROS)的釋放。在小鼠體內(nèi)MRSA肌肉炎模型中,E-Probe不僅可以對(duì)MRSA引發(fā)的感染進(jìn)行活體成像,而且可以治愈感染。

1.1.4 基于多黏菌素結(jié)構(gòu)的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

多黏菌素是一種結(jié)構(gòu)中含有陽離子、兩性、環(huán)狀的抗菌肽[19],可以選擇性地與革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁上的脂多糖(LPS)的Lipid A發(fā)生化學(xué)結(jié)合。因此多黏菌素可用于構(gòu)建對(duì)革蘭氏陰性菌具有高親和力的特異性探針Bradley[20]構(gòu)建了亞甲基藍(lán)-多黏菌素偶聯(lián)物MB-PMX(圖6A),可以同時(shí)對(duì)革蘭氏陰性菌實(shí)現(xiàn)成像和殺傷。Dhaliwal[21]通過將多黏菌素b與環(huán)境敏感的7-硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑(NBD)熒光基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)研制了一種水溶性光學(xué)成像探針NBD-PMX(圖6B),NBD的極性敏感特性使得NBD-PMX在細(xì)菌感染后產(chǎn)生的疏水環(huán)境下能激發(fā)出更高的信噪比,同時(shí)該探針化學(xué)穩(wěn)定無毒,經(jīng)喉鏡途徑在肺腔內(nèi)給入微量(MIC 1/10)的NBD-PMX后,能夠在短短的幾分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)于罹患呼吸機(jī)肺炎患者體內(nèi)遠(yuǎn)端人體氣道和肺泡中的革蘭氏陰性菌的高分辨率實(shí)時(shí)成像。

1.2 基于鋅(II)-二甲基吡啶胺結(jié)構(gòu)的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

鋅(II)-二甲基吡啶胺(ZnDPA)是一種含有鋅離子的化合物,可以特異性地與細(xì)菌包膜中普遍存在的磷酸化的兩親體、磷脂酰甘油、心磷脂發(fā)生化學(xué)結(jié)合[22],使得ZnDPA可以成功識(shí)別構(gòu)建細(xì)菌識(shí)別探針理想化識(shí)別基團(tuán)。Smith[23]以ZnDPA作為識(shí)別基團(tuán)和BODIPY作為熒光團(tuán)構(gòu)建了兩種結(jié)構(gòu)類似的熒光探針。一種探針是微生物靶向熒光顯像劑mSeek,另一種探針是氧光敏類似物mDestroy(圖5A)。這兩種ZnDPA-BODIPY偶聯(lián)物都能實(shí)現(xiàn)特異性的細(xì)菌成像,同時(shí)側(cè)鏈被碘原子修飾后的mDestroy可以在激發(fā)光下產(chǎn)生ROS從而有效殺死細(xì)菌。Smith[24]進(jìn)一步構(gòu)建了一個(gè)以花氰染料為熒光基團(tuán)的ZnDPA探針Cy-ZnDPA(圖5B),結(jié)果表明Cy-ZnDPA可以有效實(shí)現(xiàn)革蘭氏陽性菌感染的小鼠活體成像?；诜妓峒捌溲苌锝Y(jié)構(gòu)的染料及其偶聯(lián)物已被制備和評(píng)價(jià)用于各種類型的成像應(yīng)用[25-27]通過將芳酸類熒光基團(tuán)包封在保護(hù)性大環(huán)內(nèi),構(gòu)建了兩個(gè)高穩(wěn)定性的芳酸輪烷衍生物,然后將這兩個(gè)輪烷衍生物與ZnDPA偶聯(lián)到輪烷的兩側(cè),成功構(gòu)建出為兩個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)的細(xì)菌探針Squaraine-Zndpa1和Suqaraine-ZnDPA2(圖6C)。在腿部感染裸鼠模型中,兩個(gè)探針都實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌感染的成像, 并且Squaraine-ZnDPA-1比Squaraine-ZnDPA-2表現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度和更快的體內(nèi)清除速率。

(A)MB-PMX;(B)NBD-PMX。

(A)mSeek和mDestroy的結(jié)構(gòu);(B)Cy-ZnDPA;(C)squarine-ZnDPA1和squarine-ZnDPA2。

1.3 其它結(jié)構(gòu)的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

除了細(xì)胞壁的特殊成分以外,近年來還發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌中存在的一些其他靶點(diǎn)。有研究表明證明含有硼酸的染料可以通過與表面的糖蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合來標(biāo)記革蘭氏陽性細(xì)菌的孢子[27]。

Chang[29]合成并開發(fā)了一種基于BODIPY結(jié)構(gòu)的熒光探針BacGo(圖7A),體外細(xì)菌培養(yǎng)表明BacGo可以實(shí)現(xiàn)對(duì)幾乎所有革蘭氏陽性細(xì)菌的廣泛成像,而不染色革蘭氏陰性細(xì)菌。絲狀溫度敏感Z蛋白(FtsZ)已被證明在細(xì)菌細(xì)胞分裂過程[30-31]以及葡聚糖的生物合成[32]中發(fā)揮重要作用。也就是說,FtsZ蛋白被認(rèn)為是開發(fā)新型抗生素的一個(gè)有希望的新靶點(diǎn)[33-34]。Matsumura 和Pilch[35]通過將熒光基團(tuán)BPDIPY偶聯(lián)到一個(gè)惡唑-苯甲酰胺結(jié)構(gòu)的FtsZ抑制劑上開發(fā)了一種基于ftsz蛋白抑制劑的熒光探針BOFP(圖6B),體外細(xì)菌培養(yǎng)表明:BOFP可以有效地標(biāo)記上述所有革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原體,因此BOFP是一種優(yōu)越的熒光探針,具有廣譜的細(xì)菌識(shí)別和檢測(cè)能力。

(A)BacGo;(B)BOFP。

2 基于代謝標(biāo)記策略的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

細(xì)菌是一種活的生命有機(jī)體,因此需要從周圍環(huán)境中吸收營養(yǎng)并合成功能底物來滿足自身的繁殖和生長的需要。值得注意的是細(xì)菌和哺乳動(dòng)物的代謝途徑存在巨大差異[36],根據(jù)代謝物質(zhì)的不同,細(xì)菌代謝途徑可以具體分為碳水化合物代謝途徑,核苷,葉酸的代謝途徑。細(xì)菌細(xì)胞膜獨(dú)特組分的生物合成過程以及鐵離子的代謝途徑,其中碳水化合物的代謝和細(xì)菌細(xì)胞壁獨(dú)特組分的生物合成可以為熒光探針實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的敏感和選擇性可視化提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)的與細(xì)菌共價(jià)結(jié)合的探針相比,基于代謝標(biāo)記策略的探針具有背景信號(hào)低、靈敏度和特異性好等顯著優(yōu)勢(shì)。

2.1 基于糖代謝途徑標(biāo)記的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

糖類是細(xì)菌繁殖必不可少缺的營養(yǎng)物質(zhì)之一。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞類似,細(xì)菌通過活性轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收糖類,因此細(xì)菌細(xì)胞膜上有許多相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)體從而將胞外的糖轉(zhuǎn)運(yùn)到胞內(nèi)[37-39]。根據(jù)糖類具體種類的不同,細(xì)菌的糖類代謝途徑可以分為麥芽糖代謝途徑以及海藻糖代謝途徑。其中麥芽糖和麥芽糖己糖被各種活性細(xì)菌普遍利用,而海藻糖是分枝桿菌細(xì)胞壁上不可或缺獨(dú)特成分,被分枝桿菌特異性吸收[40]。

2.1.1 基于麥芽糖代謝途徑標(biāo)記的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

麥芽糖和麥芽己糖是細(xì)菌重要的供能物質(zhì)之一[41]因此細(xì)菌可以表達(dá)一種獨(dú)特的麥芽糖糊精轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[42]。然而這種麥芽糖糊精轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上是不表達(dá)的[43]。受到細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的獨(dú)特麥芽糖途徑差異的啟發(fā),Murthy[44]通過分別將炔功能化的苝和熒光染料IR-780與疊氮化的葡萄糖寡聚物進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng),構(gòu)建了兩個(gè)基于麥芽糖的探針MDP1和MDP-2(圖8A)。基于麥芽糖的探針充分利用了葡萄糖低聚物的親水性和不透膜性以及麥芽糖糊精被細(xì)菌選擇性內(nèi)化的優(yōu)勢(shì),并且在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中MDP-1和MDP-2均表現(xiàn)出良好的細(xì)菌成像能力。Gambhir[45]開發(fā)了一種麥芽糖的熒光衍生物Cy7-1(圖9B),在體外細(xì)菌培養(yǎng)中和小鼠體內(nèi)感染模型中Cy7-1可被多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌株吸收從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)熒光與光聲的雙重成像。在大腸桿菌誘導(dǎo)的肌炎和臨床相關(guān)的金黃色葡萄球菌傷口感染小鼠模型中證明了該探針不僅可以檢測(cè)感染、評(píng)估感染程度,而且可以對(duì)抗生素治療效果的能力進(jìn)行可視化評(píng)估。

從左至右分別為碳水化合物、葉酸、細(xì)胞壁 鐵離子和核苷代謝途徑。

(A)MDP-1和MDP-2;(B)Cy7-1。

2.1.2 基于海藻糖代謝途徑標(biāo)記的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展b

如圖10所示,海藻糖是海藻糖二羧酸酯(TDM)的前體,TDM是分枝桿菌菌膜的重要成分。外源性海藻糖分子可以通過兩種代謝途徑進(jìn)入分枝桿菌外膜。第一種途徑是通過糖abc-lpqy轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合物將海藻糖的雙糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中[46]使得海藻糖轉(zhuǎn)化為海藻糖二酸鹽(TDM),接著通過Mmpl3轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜[47]。第二種途徑定位于外周質(zhì),涉及抗原Ag85介導(dǎo)的海藻糖真菌化[48]。Ag85蛋白復(fù)合體由三種相關(guān)的?；D(zhuǎn)移酶Ag85A、Ag85B和Ag85C組成,它們負(fù)責(zé)海藻糖的?；?形成海藻糖菌酸[49]。

圖10 結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[50]

一些課題組已經(jīng)觀察到經(jīng)過結(jié)構(gòu)修飾的海藻糖熒光類似物[50-51]可以被整合到結(jié)核分枝桿菌的菌膜中。Bertozzi[52]通過將海藻糖與環(huán)境敏感的4-N,N-二甲氨基-1,8-萘酰亞胺(DMN)熒光基團(tuán)偶聯(lián),構(gòu)建了熒光模擬物DMN-Tre(圖11A)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)菌膜的準(zhǔn)確標(biāo)記和監(jiān)測(cè)。得益于DMN-Tre被整合到疏水菌膜的過程是由Ag38復(fù)合物進(jìn)行的,同時(shí)DMN從水環(huán)境過渡到疏水環(huán)境時(shí)可以觸發(fā)更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度,因此DMN-Tre被進(jìn)一步開發(fā)為快速識(shí)別和檢測(cè)患者痰液中存在的結(jié)核分枝桿菌的工具[53]。最近有研究證明[54-55]海藻糖二霉菌酸(TDM)可以被分枝桿菌特異性水解酶(Tdmh)水解從而增加結(jié)核分枝桿菌菌膜對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的通透性,使得分枝桿菌能夠主動(dòng)獲取更多的營養(yǎng)物質(zhì),以應(yīng)對(duì)宿主免疫系統(tǒng)引起的營養(yǎng)剝奪。受此啟發(fā)Swarts[56]構(gòu)建了一種基于FRET的TDM類似物FRET-TDM(圖11B),在與Tdmh接觸后,FRET-TDM結(jié)構(gòu)中的猝滅基團(tuán)DABCYL會(huì)因?yàn)門dmh水解作用而離去從而恢復(fù)熒光發(fā)射線信號(hào)。體外實(shí)驗(yàn)表明,FRET-TDM可被分枝桿菌產(chǎn)生的Tdmh特異性激活從而作為分枝桿菌鑒定和成像的探針。Kiessling[57]開發(fā)了一種含有猝滅劑的海藻糖探QTF,該探針由BODPI熒光團(tuán)和DABCYL猝滅劑組成,QTF可以被Ag85的真菌轉(zhuǎn)移酶特異性水解使得猝滅基團(tuán)DABCYL離去,結(jié)構(gòu)中殘留的海藻糖類似物作為供體被結(jié)核分枝桿菌吸收從而實(shí)現(xiàn)分枝桿菌生長的實(shí)時(shí)熒光成像。

(A)DMN-Tre;(B)FRET-Tdm;(C)QTF。

(A)TPEDy-D-Al;(B)Si-Rhodamine;(C)IR-FGN。

2.2 基于細(xì)胞壁合成途徑標(biāo)記的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

細(xì)胞壁是維持細(xì)菌重要組成部分可以有效維持細(xì)菌形態(tài)不受外界環(huán)境的影響。細(xì)胞壁是一個(gè)多維的復(fù)合體,其成分因細(xì)菌的種類而有所異,細(xì)菌需要吸收一系列的前體來形成細(xì)胞壁以維持自身形態(tài),因此這些熒光標(biāo)記前體類似物可以作為熒光探針來識(shí)別細(xì)菌。許多證據(jù)表明,d-氨基酸和3-脫氧-d-甘露-辛-2-酮糖酸(KDO)可以轉(zhuǎn)化為代謝標(biāo)記型熒光探針。

2.2.1 基于肽聚糖合成途徑代謝標(biāo)記的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

如圖11A所示,D-氨基酸是肽聚糖的成分之一,因此,熒光標(biāo)記D-氨基酸(FDAA)可以作為氨基酸的供體被參與細(xì)菌的復(fù)制過程從而摻入PG中,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的特異性成像[58]。同時(shí),由于D-氨基酸不能被哺乳動(dòng)物細(xì)胞吸收使得基于FDAA結(jié)構(gòu)的探針可以實(shí)現(xiàn)高對(duì)比度成像,區(qū)分細(xì)菌感染細(xì)胞和無菌細(xì)胞。在FDAA中D-Ala是最廣泛使用的熒光探針,因?yàn)镈-Ala是PG肽鏈第4和第5位的天然殘基,因此可以減弱FDAA標(biāo)記PG的潛在空間位阻更容易整合到PG當(dāng)中。Liu[59]通過將AIE光敏劑吡啶取代四苯基乙烯(TPEPy)與D-Ala結(jié)合構(gòu)建出代謝標(biāo)記性熒光探針TPEPy-d-Ala(圖11A),當(dāng)一旦代謝結(jié)合到細(xì)菌肽聚糖中,TPEPy-d-Ala的分子內(nèi)運(yùn)動(dòng)被抑制導(dǎo)致熒光信號(hào)增強(qiáng),與此同時(shí)TPEPy-d-Ala具備光敏劑特異性可以在激發(fā)光下產(chǎn)生單線態(tài)氧,有效清除細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌,更重要的是,由于結(jié)構(gòu)中D-Ala和吡啶的親水性,使得TPEPy-d-Ala在細(xì)胞內(nèi)親水環(huán)境中弱發(fā)射,從而保證了較低的背景信號(hào)實(shí)現(xiàn)高信噪比成像。生物正交化學(xué)的快速發(fā)展為熒光探針的設(shè)計(jì)提供了新的思路。Berottzi[60]將含羅丹明的疊氮化物基團(tuán)與硅原子修飾的羅丹明和環(huán)二烯基團(tuán)D-Ala進(jìn)行偶聯(lián)成功構(gòu)建了一種基于氨基酸的細(xì)菌探針Si-Rhodamine(圖11B)。既含D-Ala的環(huán)二烯先作為丙氨酸供體被摻入PG中,隨后Si-Rhodamine通過點(diǎn)擊反應(yīng)與D-Ala結(jié)合,一旦與環(huán)二烯反應(yīng)后,Si-Rhodamine的熒光量子產(chǎn)率提高到48倍,且Si-Rhodamine比羅丹明具有更長的發(fā)射波長。體外細(xì)菌培養(yǎng)證明Si-Rhodamine能夠?qū)崿F(xiàn)體內(nèi)細(xì)菌病原體感染的可視化成像。Tan[61]開發(fā)了一種基于近紅外二區(qū)(NIR-II)的代謝標(biāo)記熒光探針(圖11C),該探針由D-炔丙基甘氨酸和IR-FGN的NIR-II熒光團(tuán)組成。先將D-炔丙基甘氨酸灌胃給予取C57BL/6小鼠,間隔3 h后收集C57BL/6的盲腸微生物,清洗干凈后通過灌胃給與C57BL/6小鼠灌胃IR-FGN標(biāo)記的菌群,并且NIR-II激發(fā)光下照射。移植了IR-FGN標(biāo)記微生物群的C57BL/6小鼠模型腹部有清晰的熒光成像,當(dāng)移植小鼠接受乙醇?xì)⑺繧R-FGN標(biāo)記微生物群時(shí),熒光強(qiáng)度明顯下降,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明IR-FGN可以實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)腸桿菌的可視化實(shí)時(shí)成像。

2.2.2 基于KDO合成途徑標(biāo)記的細(xì)菌熒光探針研究進(jìn)展

圖13A所示,脂多糖(LPS)由三種結(jié)構(gòu)成分組成:最外層的多糖結(jié)構(gòu)域?yàn)镺抗原,核心結(jié)構(gòu)域由糖和LipidA組成,其中LipidA是一種與幾種脂肪酸連接的磷酸化的氨基葡萄糖二糖。而3-脫氧-d-甘露-辛-酮糖酸(KDO)是LPS內(nèi)核的一種特異性和必需成分,長期以來被認(rèn)為存在于幾乎所有革蘭氏陰性物種的LPS中[62-63],因此,熒光標(biāo)記的KDO可以實(shí)現(xiàn)革蘭氏陰性菌的特異性識(shí)別成像[64]。

(A)LPS的結(jié)構(gòu);(B)KOD的合成途徑。

受到生物正交與點(diǎn)擊化學(xué)的啟發(fā),Vauzeilles[65]合成了疊氮化物基團(tuán)偶聯(lián)類似物KDO和羅丹明與丁炔偶聯(lián)的熒光探針Rho-KDO(圖14A)。疊氮化的KDO可被革蘭氏陰性菌迅速吸收并結(jié)合到LPS中,隨后,羅丹明與丁炔偶聯(lián)的熒光團(tuán)與LPS定位的KDO結(jié)合,使羅丹明對(duì)革蘭氏陰性菌實(shí)現(xiàn)特異性成像。無獨(dú)有偶,Liu[66]通過使用具有AIE特性的四苯基乙烯開發(fā)了一種基于生物正交的細(xì)菌探針TPEPA-KDO(圖14B)。在體外細(xì)菌實(shí)驗(yàn)中,TPEPA不僅對(duì)革蘭氏陰性菌進(jìn)行了出色的特異性熒光成像,而且利用四苯基乙烯的光敏劑特性,實(shí)現(xiàn)了對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的特異性的診療一體化,綜上所述KDO是構(gòu)建革蘭氏陰性細(xì)菌特異性識(shí)別熒光探針的理想化靶點(diǎn)。

3 總結(jié)與展望

在本文中,我們總結(jié)了目前用于細(xì)菌識(shí)別和可視化的熒光探針,包括基于細(xì)菌化學(xué)結(jié)合策略的探針和基于代謝途徑標(biāo)記策略的探針,其中相當(dāng)一部分已用于臨床實(shí)際細(xì)菌檢測(cè)和篩選新的抗生素。展望未來,熒光探針在細(xì)菌成像和監(jiān)測(cè)方面既有機(jī)遇,也有挑戰(zhàn)。雖然熒光探針可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌的靈敏、快速的可視化,但其自身存在光漂白、聚集猝滅(ACQ)和激發(fā)光穿透深度有限等一系列缺點(diǎn)和缺陷,其中最困難的障礙之一可能是需要開發(fā)出易于穿透細(xì)菌細(xì)胞包膜的并且熒光發(fā)射信號(hào)強(qiáng)度高并且光穩(wěn)定的熒光團(tuán)。一般來說,熒光探針由識(shí)別片段連接體和熒光基團(tuán)組成,其中識(shí)別片段是必不可少的核心。生物化學(xué)和細(xì)菌細(xì)胞生物學(xué)的快速發(fā)展使我們對(duì)細(xì)胞的形態(tài)和分裂有了更深入的了解從而為高特異性與高靈敏度的細(xì)菌熒光探針的設(shè)計(jì)開發(fā)提供有效的理論基礎(chǔ)?？傊?熒光探針在未來幾年將繼續(xù)蓬勃發(fā)展,并且在可預(yù)見的未來,熒光探針將在細(xì)菌成像、新型抗生素篩選、細(xì)菌診療一體化等方面發(fā)揮不可或缺的作用。