不同魚(yú)皮肽抗氧化活性及結(jié)構(gòu)特性的比較

張曉頔，戴志遠(yuǎn)

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310035 2 河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所 石家莊050035 3 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧大連 116000）

近年來(lái)，自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和抗氧化劑的研究備受關(guān)注[1]。自由基的大量生成會(huì)破壞細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和DNA，與機(jī)體的衰老和免疫系統(tǒng)的削弱密切相關(guān)[2]。抗氧化活性物質(zhì)可清除體內(nèi)多余的自由基，防止氧化應(yīng)激。食品在貯存過(guò)程中易發(fā)生氧化，導(dǎo)致食品質(zhì)量下降，因此需要使用抗氧化劑以延長(zhǎng)其貨架期。而常用的合成抗氧化劑具有潛在毒性，被嚴(yán)格控制使用[2]。亟需尋找安全、無(wú)毒的抗氧化活性物質(zhì)。

2020 年我國(guó)水產(chǎn)總產(chǎn)量為6 545 萬(wàn)t[3]，其中副產(chǎn)物占40%～55%。水產(chǎn)品副產(chǎn)物含有大量蛋白質(zhì)，水解后的多肽具有較高的抗氧化活性，有望成為合成抗氧化劑的安全替代品，已成為近年來(lái)制備抗氧化肽的重要原料[4-5]。研究表明，抗氧化肽的肽鏈通常含有1 個(gè)或多個(gè)疏水性氨基酸殘基或芳香族氨基酸殘基，氨基酸的組成會(huì)造成多肽抗氧化活性的差異[5]。盡管?chē)?guó)內(nèi)外對(duì)抗氧化活性的多肽進(jìn)行了大量研究，其結(jié)構(gòu)特性還需進(jìn)一步研究。

三文魚(yú)刺身、鱘魚(yú)子醬和鳙魚(yú)頭是三文魚(yú)、鱘魚(yú)和鳙魚(yú)的主要銷售形式，在加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生魚(yú)皮等副產(chǎn)物，這些魚(yú)皮的附加值及利用率較低。研究表明，魚(yú)皮多肽具有較高的抗氧化活性[6-7]，而不同魚(yú)皮多肽在抗氧化活性和結(jié)構(gòu)特性上存在一定差異。本研究采用堿性蛋白酶分別水解三文魚(yú)皮、鱘魚(yú)皮和鳙魚(yú)皮，對(duì)其水解效果、氨基酸組成和結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行比較，分析它們之間的差異性，并評(píng)價(jià)魚(yú)皮多肽的抗氧化活性，為提高魚(yú)皮的利用價(jià)值提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三文魚(yú)皮，悅勝行貿(mào)易有限公司；鳙魚(yú)皮，千島湖海苗森生態(tài)食品有限公司；鱘魚(yú)皮，鱘鰉生物科技有限公司；堿性蛋白酶（Alcalase，酶活力為1.2×105U/mg），丹麥Novozymes 公司；菲洛嗪、碳酸酐酶（29 000 u）、細(xì)胞色素C（12 400 u）、抑肽酶（6 500 u）和馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（HHL，429 u），美國(guó)Sigma 公司；三氯乙酸（TCA）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、8-苯胺-1-萘磺酸（ANS）、FeCl2和過(guò)氧化氫（H2O2）等均為分析純級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

數(shù)顯恒溫水浴鍋，邦西儀器科技（上海）有限公司；LYNX-4000 高速冷凍離心機(jī)、Evolution 60S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo 公司；冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco 公司；Spectra MAX190 酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司；高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；F-4500 熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi 公司。

1.3 方法

1.3.1 魚(yú)皮肽的制備 將新鮮魚(yú)皮切成小塊，置于40 ℃干燥箱中烘干，粉碎成粉末后密封保存。經(jīng)前期試驗(yàn)篩選得到堿性蛋白酶制得的魚(yú)皮多肽抗氧化活性最優(yōu)，因此本試驗(yàn)選擇堿性蛋白酶水解魚(yú)皮。魚(yú)皮粉末與蒸餾水按1∶8（m/V）的比例混勻，調(diào)節(jié)混合液溫度至55 ℃和pH 值至8.0，添加1%的堿性蛋白酶（m/V）。水解過(guò)程中連續(xù)加入0.1 mol/L NaOH 以維持反應(yīng)液的最適pH。反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃加熱10 min 滅活蛋白酶，8 000 r/min離心10 min 后，收集上清液真空冷凍干燥后，計(jì)算得率并于-20 ℃保存。

1.3.2 水解度的測(cè)定 水解度采用pH-stat 法測(cè)定[8]。

1.3.3 TCA-氮溶指數(shù)（TCA-NSI）的測(cè)定 取20%TCA 將蛋白沉淀，利用BCA 試劑盒測(cè)定樣品的TCA-NSI[7]。

1.3.4 分子質(zhì)量的測(cè)定 采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定抗氧化肽的分子質(zhì)量[7]。色譜柱為T(mén)SK-gel G2000SWxl（7.8 mm×30 mm）；流動(dòng)相為V（乙腈）∶V（水）∶V（三氟乙酸）=45 ∶55 ∶0.1；流速為0.5 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.5 氨基酸組成的測(cè)定 取1.00 g 樣品在110℃用6 mol/L HCl 水解22 h，離心過(guò)濾后用HPLC測(cè)定氨基酸[9]。

1.3.6 DPPH 自由基清除率 參考Lin 等[10]的方法測(cè)定DPPH 自由基清除率。取不同濃度的樣品溶液1.5 mL 與DPPH 溶液1 mL（0.02%，m/V，溶于95%乙醇）混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。式中，A1——樣品的吸光度；A2——95%乙醇與樣品反應(yīng)的吸光度；A3——蒸餾水與DPPH 溶液反應(yīng)的吸光度。按式（1）計(jì)算DPPH 自由基清除率：

1.3.7 ·OH 自由基清除率 參考張曉頔等[7]的方法測(cè)定·OH 自由基清除率。

1.3.8 Fe2+螯合活性 參考Lin 等[10]的方法測(cè)定Fe2+螯合活性。取0.1 mL 20 mmol/L FeCl2溶液與不同濃度的4.7 mL 樣品溶液混勻，室溫靜置30 min 后，加入0.2 mL 5 mmol/L 菲洛嗪，靜置10 min 后于562 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。式中，A1——樣品的吸光度值；A2——空白組的吸光度值。按式（2）計(jì)算Fe2+螯合活性：

1.3.9 還原力 參考Alavi 等[8]的方法測(cè)定還原力。

1.3.10 疏水性的測(cè)定 在4 mL 樣品溶液（0.3 mg/mL）中加入20 μL ANS（8 mmol/L）作為熒光探針。熒光光譜激發(fā)波長(zhǎng)為375 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為485 nm，波長(zhǎng)范圍為380～650 nm，狹縫寬度為5 nm[9]。

1.3.11 熒光發(fā)射光譜的掃描 用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）配制成0.2 mg/mL 的樣品溶液。熒光光譜激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)散光譜掃描范圍為300～500 nm，狹縫寬度為5 nm[11]。

1.3.12 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）的測(cè)定 取2 mg 樣品加入0.2 g KBr，充分研磨混勻、壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)測(cè)定FTIR[10]。

1.3.13 Zeta-電位的測(cè)定 將樣品溶解到50 mmol/L pH 7.0 PBS 中，配成10 mg/mL 的溶液。使用Zeta-電位分析儀測(cè)定，測(cè)試體積為1 mL，測(cè)試溫度為25 ℃[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每個(gè)處理重復(fù)3 次，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用多重比較分析法對(duì)各組進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（P〈0.05），用Origin 2019b 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同魚(yú)皮肽的水解程度

為評(píng)價(jià)3 種魚(yú)皮肽的水解效果，在最適的pH和溫度條件下水解魚(yú)皮肽4 h，3 種魚(yú)皮肽的水解曲線如圖1a 所示。DH 是衡量蛋白質(zhì)水解程度的重要參數(shù)[13]，表示水解物中斷裂的肽鍵占底物中總肽鍵的百分比[14]。堿性蛋白酶可作用于芳香族或疏水性氨基酸的C 端肽鍵，是非特異性內(nèi)切蛋白酶。前期研究表明，堿性蛋白酶為制備魚(yú)皮多肽的最適蛋白酶[7，15]。結(jié)果表明，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，各魚(yú)皮肽的DH 值呈上升趨勢(shì)；在3 h 后，DH曲線變得平緩。其中，鱘魚(yú)皮肽具有較高的DH值。水解4 h 后，三文魚(yú)皮肽、鱘魚(yú)皮肽、鳙魚(yú)皮肽的DH 值分別為19.51%，22.34%，20.37%。3 種魚(yú)皮肽的水解趨勢(shì)與魚(yú)骨蛋白肽[16]和核桃蛋白肽[17]相似。

圖1 不同魚(yú)皮肽的DH（a）、TCA-NSI 和得率（b）Fig.1 DH（a），TCA-NSI and yield（b）of different fsh skin peptide

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量色譜圖Fig.2 Chromatogram of relative molecular weight of standard substance

TCA-NSI 也可反映蛋白質(zhì)的水解情況，TCANSI 越高表明多肽得率越高。水解程度會(huì)影響水解物的分子質(zhì)量、氨基酸組成、結(jié)構(gòu)特性和生物活性[18-19]。3 種魚(yú)皮肽水解4 h 后的TCA-NSI 和得率如圖1b 所示。3 種魚(yú)皮肽的TCA-NSI 之間存在顯著性差異（P〈0.05）。鱘魚(yú)皮肽的TCA-NSI 值最高（48.65%），其次是鳙魚(yú)皮肽（45.41%）和三文魚(yú)皮肽（40.98%）。與其它魚(yú)皮肽相比，鱘魚(yú)皮肽的得率最高（70.36%）。對(duì)DH 和TCA-NSI 進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，3 種魚(yú)皮肽中DH 與TCA-NSI 均呈正相關(guān)。

2.2 不同魚(yú)皮肽的分子質(zhì)量分布

圖1 為標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量色譜圖，根據(jù)其對(duì)數(shù)與Kav值作曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.2099x+7.0174（R2=0.9907），說(shuō)明線性關(guān)系良好。由表1 可知，3 種魚(yú)皮肽分子質(zhì)量分布表現(xiàn)出一定的差異，小分子肽（180～3 000 u）含量為鱘魚(yú)皮肽〉鳙魚(yú)皮〉三文魚(yú)皮肽，表明鱘魚(yú)皮肽水解更為徹底。本研究表明，魚(yú)多肽分子質(zhì)量分布與DH值呈負(fù)相關(guān)，這與Zhang 等[15]和Alavi 等[8]的研究結(jié)果一致。此外，Wu 等[2]發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量〈3 000 u的多肽具有較好的抗氧化活性，分子質(zhì)量大小與抗氧化活性呈負(fù)相關(guān)。本研究制備的鱘魚(yú)皮肽具有較低的分子質(zhì)量，推測(cè)其可能具有較高的抗氧化活性。

表1 不同魚(yú)皮肽的分子質(zhì)量Table 1 Molecular weight of different fish skin peptides

2.3 不同魚(yú)皮肽的氨基酸組成

不同魚(yú)皮肽的氨基酸組成如表2 所示。鱘魚(yú)皮肽的總氨基酸含量最高（82.44 g/100 g），其次是鳙魚(yú)皮肽（78.14 g/100 g）和三文魚(yú)皮肽（77.44 g/100 g）。三文魚(yú)皮肽、鱘魚(yú)皮肽和鳙魚(yú)皮肽的酸性氨基酸（Glu 和Asp）分別占總氨基酸的15.98%，16.50%，15.5%，堿性氨基酸（Arg、Lys、His）分別占總氨基酸的11.41%，11.78%，11.31%，疏水性氨基酸（Trp、Phe、Val、Leu、Ile、Ala、Met 和Pro）分別占總氨基酸的26.74%，30.73%，31.30%。多肽中的疏水性氨基酸可清除自由基，與抗氧化活性相關(guān)[20]，水解過(guò)程中疏水性氨基酸C 末端的肽鍵斷裂，裂解后疏水性氨基酸處于新肽鏈的端基，可發(fā)揮其抗氧化效果[21]。His 的咪唑環(huán)可螯合金屬離子，進(jìn)而抑制由金屬離子催化產(chǎn)生的氧化反應(yīng)，使多肽具有良好的抗氧化活性[20]；Trp 可將質(zhì)子提供給缺少電子的自由基，從而使自由基淬滅[22]；Gly 是強(qiáng)抗氧化劑谷胱甘肽的重要組成氨基酸，同時(shí)也是3 種魚(yú)皮肽含量最多的氨基酸。此外，短鏈多肽C端的Leu 也可增強(qiáng)其抗氧化活性[21]。綜上所述，不同魚(yú)皮肽的氨基酸含量和組成有所差異，魚(yú)皮肽的氨基酸組成與抗氧化活性有關(guān)。

表2 不同魚(yú)皮肽氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of different fish skin peptides

2.4 不同魚(yú)皮肽抗氧化肽活性的比較

以DPPH 自由基清除率、·OH 自由基清除率、Fe2+螯合活性和還原力評(píng)價(jià)多肽的抗氧化活性。不同抗氧化試驗(yàn)的作用機(jī)制有所不同。DPPH 自由基遇到抗氧化劑時(shí)，會(huì)與含氫供體的抗氧化劑結(jié)合，結(jié)合強(qiáng)度可反映抗氧化活性的強(qiáng)弱[10]；·OH 的化學(xué)性質(zhì)極其活躍，易與氨基酸、蛋白質(zhì)、DNA 等生物分子發(fā)生反應(yīng)，一旦與物質(zhì)接觸，可在瞬間發(fā)生反應(yīng)[5]；過(guò)渡金屬離子引發(fā)活性氧的產(chǎn)生，加速脂質(zhì)過(guò)氧化連鎖反應(yīng)，抗氧化劑對(duì)其螯合作用會(huì)延緩氧化反應(yīng)[20]；還原力可表征抗氧化劑提供電子的能力，是評(píng)價(jià)抗氧化活性的重要指標(biāo)[23]。

不同質(zhì)量濃度（1.0～8.0 mg/mL）魚(yú)皮肽的抗氧化活性如圖3 所示?？寡趸囼?yàn)結(jié)果表明，魚(yú)皮肽的DPPH、·OH 自由基清除率、Fe2+螯合活性和還原力均呈濃度依賴性，這一結(jié)果與之前的報(bào)道一致[7，23]。雖然3 種魚(yú)皮肽均具有一定的抗氧化活性，但對(duì)比3 種魚(yú)皮肽發(fā)現(xiàn)，不同質(zhì)量濃度下鱘魚(yú)皮肽的抗氧化活性顯著高于三文魚(yú)皮肽和鳙魚(yú)皮肽（P〈0.05）。胡曉等[5]研究表明，一定范圍內(nèi)羅非魚(yú)酶解肽的抗氧化活性隨水解程度的增加而增加，對(duì)其活性組分氨基酸含量進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，Trp、Gly 和His 為其含量較高的氨基酸，抗氧化活性可能與水解過(guò)程中多肽鏈的長(zhǎng)度和氨基酸排列有關(guān)，本試驗(yàn)也證明了這一觀點(diǎn)。水解之后，魚(yú)皮蛋白表面暴露了更多的非特異性蛋白組分，這些組分在二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊中，可將Fe3+還原成Fe2+。魚(yú)皮肽還原力的不同與氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)中暴露的電子密度有關(guān)，電子密度起著極性或電荷部分的作用[6]。一般來(lái)說(shuō)，多肽的抗氧化活性不僅與原料和蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，也與芳香族或疏水性氨基酸殘基的含量相關(guān)[24]。

圖3 不同質(zhì)量濃度下不同魚(yú)皮肽的抗氧化活性比較Fig.3 Comparison of antioxidant activity of different fish skin peptides at different concentrations

2.5 不同魚(yú)皮肽結(jié)構(gòu)特性的對(duì)比

2.5.1 疏水性分析 疏水性可表示蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)含量，是反映蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)之一[25]。Wani 等[26]研究表明，多肽疏水性的差異主要取決于疏水性氨基酸的含量，這在抗氧化活性中起重要作用。不同魚(yú)皮肽的表面疏水性如圖4 所示。結(jié)果表明，鱘魚(yú)皮肽（431）和鳙魚(yú)皮肽（427）的表面疏水性顯著高于三文魚(yú)皮肽（387）（P 〈0.05），鱘魚(yú)皮肽和鳙魚(yú)皮肽中有較多的疏水性氨基酸，這與之前氨基酸分析結(jié)果一致。Noman 等[25]表明，疏水性與蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和暴露的氨基酸殘基有關(guān)。在水解過(guò)程中，蛋白酶對(duì)埋藏的疏水區(qū)進(jìn)行了高特異性的切割，使蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)釋放出來(lái)[27]。

圖4 不同魚(yú)皮肽的疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of different fish skin peptides

2.5.2 熒光發(fā)射光譜分析 在蛋白質(zhì)氨基酸中，Trp 具有熒光特性，且Trp 殘基對(duì)微環(huán)境的變化很敏感，其熒光強(qiáng)度可表征蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)[28]。Trp殘基的特征峰為λ＝360 nm，熒光光譜峰位、峰強(qiáng)的改變都反映了色氨酸所處環(huán)境的變化。不同魚(yú)皮肽的熒光光譜如圖5 所示。三文魚(yú)皮肽、鱘魚(yú)皮肽和鳙 魚(yú)皮肽 的λmax分別為354.5，355.4，355.6 nm，3 種魚(yú)皮肽的熒光光譜峰位無(wú)顯著差異（P〉0.05）。3 種魚(yú)皮肽的λmax均在360 nm 附近，說(shuō)明Trp 殘基位于蛋白質(zhì)分子外部的極性環(huán)境中[29]。此外，在λ 最大值時(shí)，鱘魚(yú)皮肽熒光強(qiáng)度（357.2）〉鳙魚(yú)皮肽熒光強(qiáng)度（307.1）〉三文魚(yú)皮熒光強(qiáng)度（214.5）。結(jié)果表明，魚(yú)皮肽的熒光強(qiáng)度與水解度呈正相關(guān)。水解程度越大，魚(yú)皮蛋白會(huì)暴露出越多的Trp 殘基，這與氨基酸分析結(jié)果相一致，這對(duì)多肽的抗氧化活性有著積極作用。不同熒光基團(tuán)的活性部位、肽類和暴露氨基酸的變化不同，導(dǎo)致熒光峰強(qiáng)度和λmax值不同[29]。

圖5 不同魚(yú)皮肽的熒光光譜、λmax 和熒光強(qiáng)度Fig.5 Fluorescence spectroscopic，λmax and fluorescence intensity of different fish skin peptides

2.5.3 FTIR 分析 FTIR 可表征大分子中官能團(tuán)的振動(dòng)和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，波數(shù)的變化顯示了分子結(jié)構(gòu)的變化，信號(hào)強(qiáng)度可代表相關(guān)官能團(tuán)的濃度[30]。由圖6 可看出，魚(yú)皮肽的光譜相當(dāng)復(fù)雜，包含許多不同官能團(tuán)貢獻(xiàn)的譜帶，3 種魚(yú)皮肽在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)具有相似的吸收模式。3 種魚(yú)皮肽在3 500～3 000 cm-1之間存在較強(qiáng)吸收峰，表明多肽分子內(nèi)形成了C=O-N-H 的氫鍵[31]，且氫鍵含量為鳙魚(yú)皮肽〉鱘魚(yú)皮肽〉三文魚(yú)皮肽。3 000～2 800 cm-1的吸收峰與CH3和CH2的伸縮振動(dòng)相關(guān)，這種伸縮振動(dòng)通常發(fā)生在蛋白質(zhì)的脂肪族側(cè)鏈中[18]，其中峰值位于2 924 cm-1和2 850 cm-1的振動(dòng)吸收分別屬于CH2的對(duì)稱和非對(duì)稱拉伸振動(dòng)[19]。同時(shí)，圖中SBPHs 的酰胺I 帶（1 700～1 600 cm-1）信號(hào)較強(qiáng)，這與C=O 鍵和肽鍵的C-N 伸縮振動(dòng)有關(guān)，其峰型受蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響[32]。這些結(jié)果表明，不同魚(yú)皮肽的內(nèi)部微環(huán)境和疏水區(qū)有一定差異。

圖6 不同魚(yú)皮肽的FTIR 譜圖Fig.6 FTIR spectra of different fish skin peptides

在FTIR 譜圖中，酰胺Ⅰ帶（1 700～1 600 cm-1）與C=O 鍵和肽鍵的C-N 伸縮振動(dòng)有關(guān)，可反映蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[11]。圖6 中魚(yú)皮抗氧化肽的酰胺Ⅰ帶信號(hào)較強(qiáng)，其峰形受蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。利用Omnic 8.2 軟件和Peakfit 4.21 軟件得到高斯曲線擬合圖，根據(jù)各子峰峰面積計(jì)算魚(yú)皮肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量（表3）。各子峰與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)歸屬關(guān)系為：1 664～1 646 cm-1為α-螺旋特征峰；1 700～1 682 cm-1和1 637～1 615 cm-1為β-折疊特征峰；1 681～1 664 cm-1為β-轉(zhuǎn)角特征峰；1 645～1 637 cm-1為無(wú)規(guī)卷曲特征峰[18]。α-螺旋結(jié)構(gòu)是有序結(jié)構(gòu)，易發(fā)生構(gòu)象變化；β-折疊和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)屬于相對(duì)伸展的有序結(jié)構(gòu)，而無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)是無(wú)序結(jié)構(gòu)[9]。對(duì)比各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)現(xiàn)魚(yú)皮肽中β-折疊結(jié)構(gòu)的含量最高（34.14%～41.04%），無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量最低（10.61%～11.80%），與已有報(bào)道一致[9]。前期研究表明，水解會(huì)使魚(yú)皮蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋和β-折疊轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角，魚(yú)皮的有序結(jié)構(gòu)被破壞，蛋白分子變得柔韌疏松[23]。鳙魚(yú)皮肽中α-螺旋結(jié)構(gòu)含量較高，三文魚(yú)皮和鳙魚(yú)皮肽的α-螺旋含量分別為24.41%和22.89%。α-螺旋是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中最穩(wěn)定的。鱘魚(yú)皮和鳙魚(yú)皮肽中β-折疊較低，表明蛋白質(zhì)疏水相關(guān)位點(diǎn)暴露，暴露的疏水性氨基酸可促進(jìn)多肽清除自由基的相關(guān)位點(diǎn)，進(jìn)而提升抗多肽的抗氧化活性[11]。

表3 不同魚(yú)皮肽二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量Table 3 Estimated secondary structures of different fish skin peptides

2.5.4 Zeta-電位 蛋白質(zhì)的Zeta-電位可表示溶液中蛋白分子的靜電相互作用，反映溶液的穩(wěn)定性[30]，其大小與帶電基團(tuán)和氨基酸殘基的分布有關(guān)[33]。由圖7 可知，3 種魚(yú)皮肽的Zeta-電位均為負(fù)值，說(shuō)明蛋白分子表面帶有大量負(fù)電荷，靜電斥力使顆粒散落分布而不易發(fā)生聚集[34]。鱘魚(yú)皮肽的Zeta-電位絕對(duì)值顯著高于鳙魚(yú)皮肽和三文魚(yú)皮肽（P〈0.05），可能是因?yàn)樗膺^(guò)程釋放的帶負(fù)電荷氨基酸多于帶正電荷的氨基酸所致。

圖7 不同魚(yú)皮肽的Zeta-電位Fig.7 Zeta-potential of different fish skin peptides

3 結(jié)論

研究表明，不同魚(yú)皮肽的氨基酸組成、蛋白質(zhì)構(gòu)象和微環(huán)境體系有一定的差異，造成其抗氧化活性有所差異。水解程度較高的鱘魚(yú)皮肽具有最高的抗氧化活性，同時(shí)鱘魚(yú)皮肽具有較高的熒光強(qiáng)度、疏水性和較低的Zeta-電位，表明其疏水性氨基酸含量較高。通過(guò)酶解技術(shù)挖掘了魚(yú)皮抗氧化肽，提升了魚(yú)皮副產(chǎn)物的應(yīng)用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可為水產(chǎn)源蛋白質(zhì)加工深層次利用提供理論依據(jù)。隨著魚(yú)皮肽抗氧化活性研究的深入，下一步應(yīng)對(duì)多肽-食物相互作用對(duì)其抗氧化活性和生物利用率展開(kāi)研究。