HS-SPME-GC-MS 結(jié)合OAV 分析不同產(chǎn)地青花椒浸提前、后的關(guān)鍵香氣成分

周志帥，李 嬌，林德賢，何 利*

（1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 四川雅安625014 2 江西百草園實業(yè)有限公司 南昌 330096）

花椒是一種小樹或大灌木，高達(dá)6 m，枝無毛，果實是一種小核果，卵形，成熟時分裂成兩半，含有單一圓形和閃亮的黑色種子，大小為2～3 mm，多被栽培于亞熱帶至溫帶喜馬拉雅山脈（克什米爾至不丹）、印度東北部、巴基斯坦、泰國、日本、朝鮮、韓國、越南北部等國家和地區(qū)，在中國主要分布在南方海拔800 m 以下的溫暖地區(qū)，如廣西、廣東、貴州、云南、福建、臺灣和四川等[1-2]。青花椒（Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.）為木蘭綱（Magnoliopsida）無患子 目（Sapindales）蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）崖椒亞屬（Zanthoxylum Subgen）植物的果實，是我國最常用的“八大調(diào)料”之一[3]?，F(xiàn)代研究表明，青花椒具有抗氧化和抗糖基化等特性[4]，也有抗炎、鎮(zhèn)痛、抑菌等藥理作用[5]。

青花椒作為調(diào)味料，除了以完整或粉末形式食用外，還被加工成花椒油，以保留花椒原有的香麻滋味，減少花椒在貯藏、銷售過程中有效成分的損失。目前，花椒油的加工方法以植物油熱浸提法為主，然而該方法會產(chǎn)生油脂總質(zhì)量5%～10%的加工副產(chǎn)物[6]。業(yè)界將這些副產(chǎn)物稱為花椒殘渣，除極少部分用作肥料或飼料外，絕大部分被直接廢棄，造成了極大的資源浪費[7]，而在國外，油脂工業(yè)總產(chǎn)值的三分之二來源于原料制油后的副產(chǎn)物[8]。王春霞等[8]研究表明藤椒冷榨油餅粕中總酚含量可達(dá)（6.83±0.09）mg/g，具有一定的抗氧化活性。姜歡笑[9]研究發(fā)現(xiàn)藤椒冷榨油餅粕中含量最高的是粗纖維，為54.87%，粗脂肪及粗蛋白的含量分別為11.73%和8.07%。Xu 等[10]研究顯示花椒殘渣中含有較多的單糖，如L-鼠李糖、D-葡萄糖酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-（-）-阿拉伯糖。蔣凌燕等[11]提取花椒殘渣中的花椒油樹脂，其麻度等級可達(dá)到6 級。這些研究均表明花椒殘渣具有較大的再利用價值。目前，對花椒殘渣中的揮發(fā)性香氣成分殘留的研究還鮮有報道，從殘渣中提取相應(yīng)成分的理論依據(jù)尚不充足，采用氣-質(zhì)譜聯(lián)用儀可對樣品中揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行檢測，通過定性、定量檢測分析能準(zhǔn)確的得出樣品之間的揮發(fā)性香氣成分的差異[12]。

基于此，本研究選擇西南片區(qū)5 個產(chǎn)地青花椒及利用菜籽油加熱浸提后分離得到的青花椒殘渣為試驗對象，采用GC-MS 對不同產(chǎn)地原青花椒及其殘渣中揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行檢測，并利用聚類熱圖、氣味活度值（Odor activity value，OAV）、韋恩圖、主成分分析（Principal component analysis，PCA），對原青花椒及其殘渣的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析，以期確定不同產(chǎn)地原青花椒及其殘渣中的關(guān)鍵香氣成分，并探索基于關(guān)鍵香氣成分對不同產(chǎn)地原青花椒及其殘渣進(jìn)行區(qū)分的可行性，為花椒油生產(chǎn)企業(yè)對原料的選擇及青花椒殘渣的綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試的四川漢源干品青花椒、四川洪雅干品青花椒、四川金陽干品青花椒、重慶江津干品青花椒、云南昭通干品青花椒，四川友嘉食品有限公司。分析中的原青花椒分別標(biāo)記為GSP-No.1、GSP-No.2、GSP-No.3、GSP-No.4、GSP-No.5，殘渣分別標(biāo)記為LR-No.1、LR-No.2、LR-No.3、LR-No.4、LR-No.5。

甲醇，成都市科隆試劑有限公司；1-2 二氯苯，上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RC20002 電子天平，四川聚優(yōu)格商貿(mào)有限公司；ESJ220-4B 分析天平，沈陽龍騰電子有限公司；7890B-5977B 型氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司；FW-100 高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 浸提前樣品制備：用粉碎機將青花椒粉碎至40～60 目；浸提后樣品制備：精確稱取青花椒50 g，一級菜籽油450 g。將青花椒∶冷水按質(zhì)量比1∶2 復(fù)水30 min，過濾，取濾渣于130 ℃（菜籽油）條件下，浸提10 min，過濾后將殘渣以3 000 r/min 離心5 min 后，將殘渣用粉碎機粉碎至40～60 目，待用。所得樣品于-18 ℃保存。

1.3.2 樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測

1）固相微萃取（SPME）處理 參考陸占國等[13]的方法并稍加修改，準(zhǔn)確稱取0.2 g 樣品（精確到0.0001 g），加入60 μL 質(zhì)量濃度為0.1306 mg/mL 的1，2-二氯苯內(nèi)標(biāo)溶液（溶于甲醇）于20 mL 頂空瓶中且用聚四氟乙烯/硅橡膠隔墊密封，置于60 ℃水浴中平衡30 min，插入50 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，60 ℃吸附30 min 后，插入氣質(zhì)聯(lián)用儀解析5 min。

2）氣相色譜-質(zhì)譜測定條件 色譜條件：色譜柱DB-WAX UI，進(jìn)樣口溫度：250 ℃；聯(lián)接線溫度：250 ℃；載氣：He；進(jìn)樣模式：不分流進(jìn)樣；載氣流速：1.0 mL/min，升溫程序：40 ℃保持2 min，以10 ℃/min 升到120 ℃，以2.5 ℃/min 升到150 ℃后保持5 min，以10 ℃/min 升到230 ℃后保持10 min。

質(zhì)譜條件：離子源類型：EI；發(fā)射能量：70 eV；離子源溫度：230°C；四極桿溫度：150 ℃。

3）揮發(fā)性香氣成分的定性與定量分析 通過計算機NIST11L 譜庫和人工檢索處理，參考相關(guān)文獻(xiàn)定性鑒定檢出成分，統(tǒng)計匹配度大于80（最大值100）的組分，以鄰二氯苯為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量分析，按式（1）計算含量。

式中，Ci——目標(biāo)物質(zhì)含量（mg/g），Ai——目標(biāo)化合物峰面積；As——內(nèi)標(biāo)物峰面積；Cs——內(nèi)標(biāo)物濃度（mg/mL）；Vs——內(nèi)標(biāo)物添加體積（μL）；m——樣品質(zhì)量（g）。

1.3.3 關(guān)鍵香氣成分分析 根據(jù)內(nèi)標(biāo)法對不同樣品中各揮發(fā)性成分進(jìn)行的定量分析結(jié)果和各揮發(fā)性成分在水中的嗅覺閾值，按照式（2）計算氣味活度值（OAV，OAV≥1.0 為關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)，0.1≤OAV〈1.0 為修飾性風(fēng)味物質(zhì)，OAV〈0.1 為潛在修飾風(fēng)味物質(zhì)）[14]。

式中，c——化合物的絕對含量（mg/kg）；OT——該化合物在水溶液中的嗅覺閾值（mg/kg）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 和Microsoft Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，用Origin 2021 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原青花椒及其殘渣揮發(fā)性風(fēng)味成分解析

5 種原青花椒及其殘渣共10 個樣品經(jīng)GCMS 分析，共檢出51 種（12 個共有組分）香氣成分，包括烯烴類（20 種）、醇 類（15 種）、酯 類（3種）、酮類（2 種）、烷烴類（5 種）、酸類（2 種）、酚類（1 種）、醛類（1 種）、其它類（2 種）。總體來看，在10 個樣品中，揮發(fā)性香氣成分的種類和含量最多的均為烯烴類和醇類化合物，其均值分別為59.38%和36.77%，這與趙靜珂等[15]的研究結(jié)果一致。原青花椒中烯烴類含量為65.53%，73.31%，62.33%，66.13%，63.33%，殘渣中烯烴類含量均低于平均值，其中LR-No.2 為58.99%，原青花椒中醇類為28.97%，24.64%，31.42%，30.38%，31.21%，殘渣中醇類含量均高于平均值，其中LR-No.3 為47.61%。不同產(chǎn)地原青花椒中的揮發(fā)性風(fēng)味成分存在差異，這可能是由于地理區(qū)域之間存在差異，在一定程度上導(dǎo)致青花椒的香氣特征不同[16]，因此經(jīng)過油脂浸提后的青花椒殘渣中的揮發(fā)性香氣成分也存在一定差異。

由圖1 可知，原青花椒及其殘渣中的揮發(fā)性風(fēng)味成分種類基本一致，其中烯烴類約占總數(shù)的1/4，醇類約占總數(shù)的1/7，這和Liu 等[17]及楊靜等[18]的研究結(jié)果類似。其中，四川金陽干品青花椒（GSP-No.3）中的揮發(fā)香氣成分的種類最為豐富，然而經(jīng)過油脂浸提后，云南昭通干品青花椒殘渣（LR-No.5）中揮發(fā)性香氣成分種類最為豐富。

圖1 原青花椒及其殘渣的揮發(fā)性風(fēng)味成分種類數(shù)Fig.1 Number of volatile compounds in green Sichuan pepper and their leaching residue

由圖2 可知，原青花椒中，烯烴類約為醇類含量的1 倍。GSP-No.2 烯烴類和醇類含量最高，為10.1258 mg/g 和3.4026 mg/g。GSP-No.1 和GSPNo.3 中分別檢出醇類物質(zhì)2.4977 mg/g 和2.4182 mg/g，LR-No.1 和LR-No.3 中分別檢出2.8252 mg/g 和3.1774 mg/g，殘渣中的醇類物質(zhì)上升了13.11%和31.39%；GSP-No.1 和GSP-No.3 中分別檢出酸類物質(zhì)0.0065，0.0097 mg/g，LR-No.1、LRNo.3 中分別檢出0.0108 mg/g 和0.0119 mg/g，殘渣中的酸類物質(zhì)上升了66.15%和22.58%。在5 個產(chǎn)地的青花椒殘渣中，醇類物質(zhì)的含量有所增加，主要原因可能是原青花椒在熱油浸提之前用水浸泡過，烯烴類物質(zhì)在水溶液中發(fā)生加成反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成了一部分醇類物質(zhì)[12]，而整體的風(fēng)味成分含量較原青花椒有所下降，這可能是由于浸提的溫度導(dǎo)致風(fēng)味成分損失，造成部分成分含量減少[19]。

圖2 原青花椒及其殘渣的揮發(fā)性風(fēng)味成分絕對含量Fig.2 The absolute content of volatile flavor compounds in green Sichuan pepper and their leaching residue

圖3 是不同產(chǎn)地原青花椒及其殘渣中的揮發(fā)性風(fēng)味成分的聚類熱圖，將揮發(fā)性風(fēng)味成分的檢測數(shù)據(jù)可視化，紅色代表同種物質(zhì)的含量低，藍(lán)色則代表該物質(zhì)的含量高。在10 個樣品中，檜烯、（+）-檸檬烯、芳樟醇、月桂烯是主要的化合物，而十四烷、（1S）-6，6-二甲基二環(huán)[3.1.1]庚-2-烯-2-基甲醇乙酸酯、2，6-二甲基癸烷、苯甲醇等是含量最低的化合物。通過聚類分析可以看出，不同產(chǎn)地原青花椒及其殘渣在揮發(fā)性風(fēng)味成分組成及含量方面具有差異性和相似性，其中GSP-No.1、GSPNo.3、GSP-No.4、GSP-No.5 原青花椒具有一定的相似性，GSP-No.2 的揮發(fā)性風(fēng)味成分與其它4 個產(chǎn)地原青花椒存在明顯差異；5 個產(chǎn)地的青花椒殘渣具有一定的相似性，而LR-No.2 和LR-No.3與原青花椒的相似程度更高，說明LR-No.2 和LR-No.3 青花椒殘渣揮發(fā)性香氣成分保留較好。

圖3 原青花椒及其殘渣GC-MS 測定結(jié)果熱圖Fig.3 Heat map display of green Sichuan pepper and their leaching residue

2.2 原青花椒及其殘渣關(guān)鍵香氣成分分析

揮發(fā)性風(fēng)味成分是否對整體的香氣有顯著的貢獻(xiàn)，取決于兩個因素，即揮發(fā)性風(fēng)味成分的濃度及其氣味閾值。OAV 是確定GC-MS 鑒定出的化合物對樣品香氣有貢獻(xiàn)的重要方法，一般來說，含有OAV≥1 的化合物被認(rèn)為是關(guān)鍵的芳香化合物[20]，而OAV〈1 的化合物被認(rèn)為對香氣的貢獻(xiàn)較小[21]。通過已明確的香氣成分閾值，確定了青花椒及其殘渣中OAV≥1 的22 種關(guān)鍵香氣成分，賦予了原青花椒及其殘渣典型的青花椒香氣，閾值及香氣描述[18，22-31]如表1 所示，成分主要為烯烴、醇類，另外還有酯類、烷烴類、酸類和酚類等，該結(jié)果與Jiang 等[32]的研究結(jié)果一致。由表2 可以看出，芳樟醇在原青花椒5 個樣品中均存在，其氣味活度值最大，對香氣貢獻(xiàn)程度最大，芳樟醇是由芳樟醇合成酶從香葉酰焦磷酸前體中釋放出來的[33]，具有甜香和果香，賦予青花椒清香的風(fēng)味，是原青花椒中主要的揮發(fā)性風(fēng)味成分[34]；其次是月桂烯，OAV〉1 000 的香氣物質(zhì)還有（+）-檸檬烯、反式石竹烯、羅勒烯和檜烯，1〈0AV〈1 000 的香氣物質(zhì)有松油烯、γ-松油烯、萜品油烯、乙酸芳樟酯和十四烷，對青花椒的香氣呈現(xiàn)有一定的貢獻(xiàn)。在青花椒殘渣的5 個樣品中均存在且對香氣貢獻(xiàn)程度最大的也是芳樟醇，其次是月桂烯，其中OAV〉1 000的香氣物質(zhì)還有（+）-檸檬烯、反式石竹烯、乙酸；1〈0AV〈1 000 的香氣物質(zhì)有檜烯、松油烯、羅勒烯、γ-松油烯、萜品油烯和乙酸芳樟酯?？梢钥闯?，青花椒經(jīng)熱油浸提后，其中的關(guān)鍵香氣成分種類出現(xiàn)一定的變化，造成表達(dá)出可識別的香氣發(fā)生改變，但在原青花椒及其殘渣10 個樣品中，OAV均大于1 000 的關(guān)鍵香氣成分均有芳樟醇、月桂烯、（+）-檸檬烯和反式石竹烯4 種，對青花椒香氣貢獻(xiàn)較大，該結(jié)果與Ji 等[35]的研究結(jié)果類似，這些香氣成分也是花椒殘渣中主要的呈香物質(zhì)，與陳海濤等[36]的研究結(jié)果類似。

表1 不同產(chǎn)地原青花椒及其殘渣特征香氣成分的閾值及其嗅覺描述Table 1 Thresholds and olfactory description of green Sichuan pepper and their leaching residue from origins

表2 不同產(chǎn)地原青花椒及其殘渣特征香氣成分OAVTable 2 OAV of green Sichuan pepper and their leaching residue from origins

由圖4a 可知，5 個產(chǎn)地原青花椒中，共確定的關(guān)鍵香氣成分分別為16，15，16，16，16 種，其中11 種共有關(guān)鍵香氣成分，GSP-No.1 特有關(guān)鍵香氣成分1 種，為茴香腦；GSP-No.3 特有關(guān)鍵香氣成分1 種，為橙花叔醇；GSP-No.5 特有關(guān)鍵香氣成分1 種，為蒎烯；由圖4b 可知，5 種青花椒殘渣中，共確定的關(guān)鍵香氣成分分別為15，13，13，14，16 種，其中11 種共有關(guān)鍵香氣成分，LR-No.1 特有關(guān)鍵香氣成分1 種，為4-乙烯基-2-甲氧基苯酚；LR-No.3 特有關(guān)鍵香氣成分1 種，為（-）-4-萜品醇；LR-No.5 特有關(guān)鍵香氣成分1 種，為十四烷。通過查詢關(guān)鍵香氣物質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)式可以看出，這些香氣物質(zhì)多數(shù)含有C=C 或C=O 雙鍵結(jié)構(gòu)，這種雙鍵結(jié)構(gòu)可能對原青花椒及其殘渣的呈香品質(zhì)具有重要作用[37]。

圖4 原青花椒（a）及其殘渣（b）關(guān)鍵香氣成分Venn 圖分析Fig.4 Venn diagram analysis of green Sichuan pepper and their leaching residue（b）

2.3 原青花椒及其殘渣中關(guān)鍵香氣物質(zhì)PCA分析

10 個樣品的關(guān)鍵香氣成分分別映射在4 個象限上，在第一象限中，PC1〉0、PC2〉0；第二象限中，PC1〈0，PC2〉0；第三象限中，PC1〈0，PC2〈0；第四象限中，PC1〉0，PC2〈0。

由圖5a 可知，原青花椒關(guān)鍵香氣主成分分析中，PC1 和PC2 的貢獻(xiàn)率分別為48.7%和31.4%，基本可以反映出大部分原始數(shù)據(jù)的變異信息[38]。5個產(chǎn)地原青花椒分布在3 個象限中，GSP-No.1、GSP-No.3 和GSP-No.4 在PCA 圖的第三象限內(nèi)，這一象限主要反映了O3（水芹烯）、O20（乙酸）、O13（4-萜烯醇）、O14（橙花叔醇）、O22（茴香腦），從OAV 值可以看出，這些關(guān)鍵香氣成分對青花椒的香氣貢獻(xiàn)較小，說明這3 個產(chǎn)地的青花椒特征風(fēng)味相對不強；GSP-No.2 在PCA 圖的第四象限內(nèi)，這一象限主要反映了O1（檜烯）、O2（月桂烯）、O5（（+）-檸檬烯）、O6（羅勒烯）、O9（反式石竹烯）、O11（芳樟醇）、O16（α-松油醇），從OAV 值可以看出，這些關(guān)鍵香氣物質(zhì)對青花椒的香氣貢獻(xiàn)較大，說明GSP-No.2 青花椒的特征風(fēng)味較強；GSP-No.5 在PCA 圖的第一象限內(nèi)，這一象限主要反映了O4（松油烯）、O7（γ-松油烯）、O8（萜品油烯）、O10（蒎烯）、O15（4-萜烯醇）、O18（水楊酸甲酯）、O19（十四烷），從OAV 值可以看出，這些關(guān)鍵香氣物質(zhì)對青花椒的香氣貢獻(xiàn)程度居中，說明GSP-No.5青花椒的特征香氣強度在GSP-No.2 與GSP-No.1、GSP-No.3、GSP-No.4 3 個產(chǎn)地之間。

圖5 原青花椒（a）及其殘渣（b）關(guān)鍵香氣成分PCA 分析Fig.5 Principal component analysis of green Sichuan pepper（a）and their leaching residue（b）

由圖5b 可知，原青花椒關(guān)鍵香氣主成分分析中，PC1 和PC2 的貢獻(xiàn)率分別為42.5%和31.5%，基本可以反映出大部分原始數(shù)據(jù)的變異信息。LR-No.1 在PCA 圖的第一象限內(nèi)，這一象限主要反映了O3（水芹烯）、O4（松油烯）、O8（萜品油烯）、O13（4-萜烯醇）、O18（水楊酸甲酯）、O21（4-乙烯基-2-甲氧基苯酚）、O22（茴香腦），從OAV值可以看出，這些關(guān)鍵香氣物質(zhì)對青花椒殘渣的香氣貢獻(xiàn)程度適中，說明LR-No.1 殘渣具有一定的青花椒特征香氣；LR-No.2 在PCA 圖的第二象限內(nèi)，這一象限主要反映了O1（檜烯）、O2（月桂烯）、O5（（+）-檸檬烯）、O6（羅勒烯）、O9（反式石竹烯），從OAV 值可以看出，這些關(guān)鍵香氣物質(zhì)對青花椒殘渣的香氣貢獻(xiàn)較大，說明LR-No.2 青花椒殘渣的特征風(fēng)味比LR-No.1 強；LR-No.3 在PCA圖的第三象限內(nèi)，這一象限主要反映了O11（芳樟醇）、O15（4-萜烯醇），從OAV 值可以看出，O11（芳樟醇）對青花椒殘渣的香氣貢獻(xiàn)較大，達(dá)到了497 450，而O15（4-萜烯醇）未在該樣品中檢出，說明LR-No.3 的青花椒香氣非常濃郁；LR-No.4 和LR-No.5 在PCA 圖的第四象限內(nèi)，這一象限主要反映了O16（α-松油醇）、O17（乙酸芳樟酯）、O20（乙酸），從OAV 值可以看出，這幾個關(guān)鍵香氣物質(zhì)對青花椒殘渣的香氣具有一定的作用，然而種類單一，且合計OAV 值較小，因此LR-No.4 和LR-No.5 兩個產(chǎn)地的青花椒殘渣的特征香氣可能與LR-No.1 較為接近，與LR-No.3 和LR-No.2 的香氣差異較大。PCA 結(jié)果與聚類熱圖分析互為補充，分析結(jié)果基本一致，表明關(guān)鍵的香氣成分能夠準(zhǔn)確地表征樣品的風(fēng)味屬性，是導(dǎo)致原青花椒及其殘渣特性和差異的關(guān)鍵芳香活性化合物[39-41]。

3 結(jié)論

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對5 個產(chǎn)地原青花椒及其殘渣的揮發(fā)性風(fēng)味成分進(jìn)行定性、定量分析，比較發(fā)現(xiàn)原青花椒及其殘渣的揮發(fā)性成分雖然在種類和含量上存在一定差異，但主要成分是相似的。通過OAV 分析，確定了對原青花椒及其殘渣香氣起重要作用的22 種關(guān)鍵香氣成分為芳樟醇、月桂烯、（+）-檸檬烯、反式石竹烯、羅勒烯、檜烯、松油烯、γ-松油烯、萜品油烯、乙酸芳樟酯等，這與花椒的特征揮發(fā)性風(fēng)味成分一致。經(jīng)過熱油浸提后青花椒殘渣依然保留了原青花椒的主要關(guān)鍵香氣成分，關(guān)鍵香氣成分的變化主要表現(xiàn)在烯烴類物質(zhì)含量減少，醇類物質(zhì)含量增加，進(jìn)一步分析表明：5 個產(chǎn)地原青花椒中，四川洪雅干品青花椒（GSP-No.2）的關(guān)鍵香氣成分更豐富，是較為理想的花椒油浸提用原料，四川洪雅青花椒殘渣（LR-No.2）和四川金陽青花椒殘渣（LR-No.3）的關(guān)鍵香氣成分較豐富，有一定的利用價值，為殘渣的綜合利用提供了參考。