改性SiOx/WPU 涂膜對腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制作用

楊峻乙，張家濤，2，劉亮軍，李秀霞，王莉麗，楊 旭，孫 彤*，勵建榮

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心 遼寧錦州121013 2 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018 3 民澤龍羊峽生態(tài)水殖有限公司 青海海南藏族自治州 811800）

細菌生物被膜（Biofilm，BF）是一種復(fù)雜的細菌聚集膜，由細菌分泌的胞外多糖、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)組成，是地球上分布最廣、最成功的生命模式，被定義為“微生物的聚集體”，是細菌生長過程中形成的一種天然保護狀態(tài)[1-2]。物體表面99.9%的細菌以生物被膜形式存在[3]。生物被膜使菌體成為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的高度組織化群體，其形成包括黏附期、生長期、成熟期、分散期4 個階段的動態(tài)過程[1，4]，對細菌菌體具有強烈的保護作用。

1997 年，Neinhuis 等[5]和Barthlott 等[6]發(fā)現(xiàn)，植物表面的微觀結(jié)構(gòu)粗糙度及表皮蠟的疏水特性的結(jié)合使植物具有自清潔和超疏水性能，稱之為“蓮花效應(yīng)”?；谏锝绲倪@種發(fā)現(xiàn)，人們制備出水接觸角大于150°，滾動角小于10°的超疏水表面，具有低表面能和特殊的浸潤性，能夠有效減少細菌細胞與材料表面之間的黏附[7-8]。由于超疏水表面具有獨特的浸潤性能，使其在自清潔、抗細菌黏附、防冰、油水分離等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[9]。然而，有研究表明，超疏水表面長期暴露于潮濕環(huán)境后仍有被浸潤的風(fēng)險，隨著時間的推移，細菌會在材料表面附著，使其失去抗菌性能，這種現(xiàn)象在超疏水材料表面較為常見[7，10]?；诖?，人們通過對超疏水表面制備原理的認識與研究，制備出超雙疏表面，然而其在實際應(yīng)用中的范圍較窄，這是由于其表面性能不太穩(wěn)定[11-12]。

納米SiOx 是一種無毒、無味的無機非金屬材料，易制備、易改性、粒徑可控，可作為抗拮劑加入脫水蛋制品、飲料、乳制品等食品中[13-15]。聚氨酯（Polyurethane，PU）是一種新興高分子聚合物，其鏈段結(jié)構(gòu)由軟段和硬段交替構(gòu)成，且主鏈中含有氨基甲酸酯（-NHCOO-）結(jié)構(gòu)單元[16]。水性聚氨酯（Waterborne polyurethane，WPU）是以水代替有機溶劑為分散相的二元膠態(tài)體系，無毒、無污染，在紡織、皮革、涂層、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[17-18]。水性聚氨酯涂料化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，無毒、無味，是一種環(huán)保型高分子聚合物彈性防水材料[19]。

腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）為耐冷革蘭氏陰性菌，能夠還原氧化三甲胺（TMAO）產(chǎn)生硫化氫、三甲胺（TMA）及氨基酸代謝產(chǎn)物等，易黏附于材料表面，從而形成生物被膜，有很強的致腐能力，是一種典型的水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌[20-22]。

本文采用St?ber 法在同一溶劑體系中制備和改性SiOx 微納米粒子，然后以水性聚氨酯為成膜材料，制備改性SiOx/WPU 涂膜。研究該涂膜對水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制機制，以拓寬超雙疏涂膜在食品保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用，并提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

疏水氣相納米SiOx 顆粒、微米級SiOx 顆粒，上海凜恩科技發(fā)展有限公司；腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens，ATCC 8071）為渤海大學(xué)食品安全實驗室保存；超微量Na+/K+-ATP 酶測定試劑盒、堿性磷酸酶（AKPase）測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；考馬斯亮藍試劑盒，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；去離子水為實驗室自制，電導(dǎo)率〈15 μS/cm；其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設(shè)備

電子分析天平（型號：FA2204C），上海天美天平儀器有限公司；磁力攪拌器（型號：SN-MS-3D），上海尚普儀器設(shè)備有限公司；真空干燥箱（型號：DZF-1B），鄄城威瑞科教儀器有限公司；場發(fā)射掃描電鏡（型號：S-4800），日本日立公司；原子力顯微鏡（型號：XE-70），韓國Park Systems 公司；差示掃描量熱儀（型號：Q2000），上海蔡?？茖W(xué)儀器有限公司；傅里葉變換紅外光譜儀（型號：Scimitar 2000 Near FT-IR Spectrometer），美國安捷倫公司；X 射線粉末衍射儀（型號：Rigaku Ultima IV），日本理學(xué)株式會社；視頻光學(xué)接觸角測量儀（型號：OCA 25），德國數(shù)據(jù)物理儀器有限公司；X 射線光電子能譜儀（XPS）（型號：Thermo Scientific K-Alpha），賽默飛世爾科技公司；鼓風(fēng)干燥箱（型號：DHA-9423A），上海精宏實驗設(shè)備有限公司；立式高壓滅菌鍋（型號：MLS-3030CH），日本三洋有限公司；生化培養(yǎng)箱（型號：LRH-150），上海一恒科技有限公司；臺式恒溫振蕩箱（型號：THZD），太倉市實驗設(shè)備廠；酶標(biāo)儀（型號：Victor X3），上海珀金埃爾默儀器有限公司。

1.3 改性SiOx/WPU 涂膜的制備及表征

1.3.1 改性SiOx/WPU 涂膜的制備 將0.2400 g CTAB、24.00 mL 無水乙醇和3.00 mL 氨水（28%）依次加入24.00 mL 去離子水中，攪拌溶解后逐滴加入3.00 mL 正硅酸乙酯（TEOS），常溫繼續(xù)攪拌3 h，得SiOx 混懸液。過濾混懸液并用去離子水和無水乙醇分別洗滌濾渣3 次，濾渣在60 ℃，0.6 MPa 條件下真空干燥2 h，得C-SiOx 顆粒。

分別取0.3000 g 的氣相納米SiOx 顆粒、微米級SiOx 顆粒和C-SiOx 顆粒與30.00 mL 無水乙醇超聲后的懸濁液，逐滴加入3.00 mL 的TEOS 后依次加入6.00 mL 氨水（28%）和300 μL1H，1H，2H，2H-全弗辛基三氯硅烷（PFOTS），室溫條件下攪拌6 h，再次加入150 μL PFOTS，室溫條件下繼續(xù)攪拌2 h，反應(yīng)結(jié)束后過濾，并用10.00 mL 無水乙醇洗滌濾渣，重復(fù)3 次，隨后在55 ℃，0.6 MPa的條件下真空干燥2 h，分別得改性氣相納米SiOx顆粒、改性微米級SiOx 顆粒和C-SiOx 顆粒。

將4.0%（m/V）的改性SiOx 顆粒與0.1800 g WPU、2.30 mL 無水乙醇和2.70 mL 乙酸乙酯超聲混合溶液在室溫條件下攪拌1 h，得改性SiOx/WPU 涂膜液。采用滴涂法在5 cm×5 cm 的聚氯乙烯（PVC）薄片上滴涂1.20 mL 的涂膜液，室溫晾干后，于55 ℃烘箱烘干6 h，得改性SiOx/WPU 涂膜。

1.3.2 SiOx 顆粒及涂膜的表征分析 采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）觀察改性SiOx 顆粒及改性SiOx/WPU 涂膜的微觀結(jié)構(gòu)。噴金條件為：20 kV，3 min；測定電壓為：1.5 kV 或1.0 kV。

在40 kV，50 mA，CuKα 輻射，步寬0.02°，掃描范圍5°～40°條件下，采用X 射線粉末衍射儀（XRD）對改性SiOx 微納米粒子及改性SiOx/WPU涂膜樣品進行晶型分析。

采用傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR）對改性后的SiOx 顆粒進行FT-IR 光譜掃描，波長范圍為4 000～500 cm-1，步寬為2 cm-1。

將滴涂有改性SiOx/WPU 涂膜的PVC 薄片裁成5 mm×5 mm 大小，在15 kV 和150 W 的條件下，以與樣品表面呈90°的起飛角收集光電子，采用X 射線光電子能譜（XPS）對樣品進行元素分析。

SiOx/WPU 涂膜表面的3D 輪廓形貌及其平均粗糙度采用原子力顯微鏡（AFM）進行表征。

稱取3～8 mg 樣品，采用差示掃描量熱儀（DSC）測定涂膜的熱穩(wěn)定性，測定條件：升溫速率為10.00 ℃/min，升溫范圍為20～250 ℃，氮氣環(huán)境。

稱取5～10 mg 樣品，采用熱重分析儀（TGA）在20.0 mL/min 的氮氣流量，10.00 ℃/min 的加熱速率下測定涂膜的熱穩(wěn)定性，測定溫度范圍為30～650 ℃。

1.3.3 浸潤性能和表面能測定 參考《納米材料超雙疏性能檢測方法》（GB/T 26490-2011）[23]，測定改性SiOx/WPU 涂膜的水接觸角和正十六烷接觸角。用Owens-Wendt-Rabel-Kaelble（OWRK）法計算表面自由能[24]。

1.4 腐敗希瓦氏菌生物被膜相關(guān)指標(biāo)測定

1.4.1 涂膜表面腐敗希瓦氏菌生長曲線的測定 取在28 ℃、OD595nm值約為0.5 的腐敗希瓦氏菌菌懸液中培養(yǎng)一定時間的涂膜，用1 mL 無菌PBS 溶液（0.1 mol/L，pH=7.4）洗3 次，以除去其表面的浮游菌，隨后將涂膜置于裝有10 mL 無菌PBS 的離心管中，224 W 53 kHz 超聲處理10 min，以剝離涂膜表面的生物被膜。取1 mL 超聲后的菌懸液加入到9 mL 無菌PBS（0.1 mol/L，pH=7.4）中進行10倍梯度稀釋，按照GB 4789.2-2016 的方法進行平板計數(shù)[25]。

1.4.2 涂膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜的微觀結(jié)構(gòu)觀察 取培養(yǎng)4，12，24 h 后的涂膜，超聲剝離生物被膜，在4 ℃，3 000×g 條件下離心10 min，棄去上清液，立即加入1 mL 2.5%（體積分?jǐn)?shù)）戊二醛溶液固定2 h。1 mL 無菌水離心洗滌2 次后，依次用1 mL 50%，70%，80%，90%（體積分?jǐn)?shù)）的乙醇溶液脫水處理30 min，最后用1 mL 無水乙醇脫水處理1 h。將已固定的被膜菌無水乙醇溶液少量多次的滴到細胞爬片上，室溫晾干后，于37 ℃干燥12 h。用SEM 觀察被膜菌的微觀形貌和黏附團聚狀況。

1.4.3 涂膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜相關(guān)指標(biāo)的測定

1）胞外多糖（EPS）的測定 取在菌懸液中培養(yǎng)一定時間的涂膜，用1 mL 的無菌PBS（0.1 mol/L，pH=7.4）洗3 次，隨后加入2 mL 無菌PBS 超聲剝離生物被膜（224 W 53 kHz，10 min），取1 mL超聲后的菌懸液在4°C，20 000×g 條件下離心20 min，用0.22 μm 膜過濾器過濾，根據(jù)EPS 酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作步驟測定上清液中胞外多糖含量。用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長下的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的EPS 濃度。

2）代謝活性的測定 取在菌懸液中培養(yǎng)一定時間的涂膜，用1 mL 無菌PBS（pH=7.4，0.1 mol/L）洗3 次后，用100 μL LB 肉湯和50 μL XTT 試劑進行培養(yǎng)，用酶標(biāo)儀測定28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h 后的OD490nm值。

3）總蛋白的測定 參照張家濤[26]和王多寧等[27]的方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取在菌懸液中培養(yǎng)24 h 的涂膜，超聲處理以剝離生物被膜。取1 mL超聲后的菌懸液，加入200 μL RIPA 裂解液，混勻后于4 ℃下靜置20 min，53 kHz 224 W 冰浴超聲處理40 min。4 ℃，10 000×g 條件下離心15 min，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL 上清液與200 μL 考馬斯亮藍染色液混勻，用酶標(biāo)儀測定靜置5 min后溶液的OD595nm值。生物被膜中的總蛋白濃度根據(jù)所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

4）Na+/K+-ATP 酶活力和AKP 酶活力的測定

將超聲剝離生物被膜的菌懸液轉(zhuǎn)移至10 mL 無菌離心管中，在冰浴條件下用超聲波細胞破碎儀進行超聲處理，細胞破碎液于-20 ℃保存。參照試劑盒試驗步驟分別測定Na+/K+-ATP 的酶活力和AKP 的酶活力。

1.5 數(shù)據(jù)分析

接觸角分析測定樣品的6 個不同位置，其余試驗重復(fù)3 次。使用Origin 9.1 軟件繪圖，采用SPSS 20.0 軟件中單因素方差分析的Duncan 多重比較法進行顯著性分析。結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，P〈0.05 時有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 改性SiOx/WPU 涂膜的表征分析

2.1.1 改性SiOx/WPU 涂膜的微觀結(jié)構(gòu)表征 未改性的SiOx 顆粒及改性SiOx/WPU 涂膜表面的微觀形貌如圖1 所示。由圖1（a1）可見，氣相納米SiOx 顆粒呈球形，粒徑約為10 nm；而改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面SiOx 顆粒粒徑增加至30～50 nm，出現(xiàn)明顯的團聚現(xiàn)象（圖1（a2-a3））。由圖1（b1）可見，微米級SiOx 顆粒由微納米兩種級別的顆粒構(gòu)成，以直徑約1～3 μm 的顆粒為主；改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面微納米粒子交互存在，形成了微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)（圖1（b2-b3））。圖1（c1）表明，由于制備過程中高濃度的表面活性劑起到了模板導(dǎo)向劑的作用，使C-SiOx 顆粒發(fā)生交聯(lián)，從而形成了六方相膠束[28]；而改性C-SiOx/WPU 涂膜表面均勻分布粒徑約為400 nm 的SiOx顆粒（圖1（c2-c3））。

圖1 未改性SiOx 顆粒（a1～c1）及其改性SiOx/WPU 涂膜（a2～c2，a3～c3）表面的SEM 圖Fig.1 SEM images of unmodified SiOx particles（a1-c1）and their modified SiOx/WPU coatings（a2-c2，a3-c3）

2.1.2 改性SiOx 和SiOx/WPU 涂膜XRD 和FIIR 分析 改性SiOx 顆粒及對應(yīng)的改性SiOx/WPU涂膜的XRD 譜圖如圖2A～2B 所示。改性SiOx 顆粒均在21.1°處出現(xiàn)SiOx 的非晶衍射峰[29]，表明SiOx 顆粒的微觀形貌不會影響其結(jié)晶性能。由圖2B 可見，改性SiOx/WPU 涂膜的非晶衍射峰移至20.8°處，然而并未出現(xiàn)WPU 的特征峰，這可能是由于WPU 為大分子有機物，分子鏈較長，其非晶態(tài)衍射峰與SiOx 顆粒的非晶衍射峰重合。

圖2 改性SiOx 顆粒、改性SiOx/WPU 涂膜的XRD 譜圖（A～B）及改性SiOx 顆粒的FI-IR 譜圖（C）Fig.2 XRD spectra of modified SiOx particels（A）and modified SiOx/WPU coatings（B），and FI-IR spectra of modified SiOx particels（C）

圖3C 為3 種改性SiOx 顆粒的FT-IR 譜圖。3 700～3 300 cm-1處的吸收峰為-OH 的伸縮振動峰，1 635 cm-1附近的吸收峰為-OH 的彎曲振動峰，-CH2的反對稱和對稱伸縮振動峰出現(xiàn)在2 922 cm-1和2 852 cm-1處[30]；2 365 cm-1和2 345 cm-1處的峰為空氣中CO2的吸收峰；1 085 cm-1處和808 cm-1處分別屬于Si-O-Si 的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動，947 cm-1處的峰歸因于Si-O 的伸縮振動，在467 cm-1處為O-Si-O 的彎曲振動峰[31]。由圖2C（a）可見，改性氣相納米SiOx 顆粒在3 655 cm-1處出現(xiàn)氣相納米SiOx 顆粒中游離-OH 的特征峰，在1 635 cm-1附近出現(xiàn)-OH 和-NH2的彎曲振動峰；氣相納米SiOx 顆粒中-CH2的反對稱和對稱伸縮振動峰出現(xiàn)在2 922 cm-1和2 852 cm-1處。由圖2C（b）可見，改性微米級SiOx 顆粒在3 700～3 300 cm-1處有較強的寬吸收峰，且吸收峰的中心位置向低波數(shù)移動，在1 635 cm-1處有強度較弱的窄吸收峰，說明樣品中存在大量的締合-OH，即改性微米級SiOx 顆粒中有結(jié)合水的存在。由圖2C（c）可見，改性C-SiOx 顆粒在3 700～3 300 cm-1處出現(xiàn)的肩峰和寬峰分別為-OH 和CTAB 中-NH3的伸縮振動峰；2 929 cm-1和2 855 cm-1處出現(xiàn)的峰與CTAB 中-CH2的反對稱和對稱伸縮振動有關(guān)。此外，對于各改性SiOx 顆粒PFOTS 中的-CF2和-CF3伸縮振動峰出現(xiàn)在747 cm-1和707 cm-1處，表明3 種SiOx 顆粒均已被氟化劑成功改性。

圖3 改性SiOx/WPU 涂膜的XPS 測量光譜（A）及高分辨率XPS 譜圖（B～F）Fig.3 XPS survey spectra（A）and high resolution XPS spectra（B-F）of modified SiOx/WPU coatings

2.1.3 改性SiOx/WPU 涂膜的XPS 分析 改性SiOx/WPU 涂膜的XPS 譜圖如圖3A 所示，由圖可見，各涂膜表面均含有F、O、C、Si 4 種元素，且由O 和Si 的相對含量可知，各涂膜表面單位面積上改性SiOx 顆粒的含量相近。而改性C-SiOx/WPU涂膜表面F 的相對含量最高，達到28.2%，改性氣相納米涂膜次之，為26.4%，改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面F 的相對含量最低，為24.9%。

圖3B～3E 為改性SiOx/WPU 涂膜的高分辨率XSP 譜圖。由圖3B 和3C 可見，各改性SiOx/WPU涂膜的F1s 峰分別出現(xiàn)在688.5，688.9，688.6 eV處，無顯著性差異。O1s 峰在532.5，532.8，532.6 eV處，屬于O-C（533.2 eV）、O-Si（532.4 eV）和O=C（531.7 eV）。由圖3D 可見，3 種涂分別在102.9，103.1，102.9 eV 處出現(xiàn)的Si2p 峰，可能屬于Si-C（102.0 eV）、Si-O-Si（103.4 eV）和Si-OH（104.5 eV）[32]。由圖3E 可見，3 種改性SiOx/WPU 涂膜的C1s 峰出現(xiàn)分峰現(xiàn)象。圖3F 為對改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面C1s 峰進行分峰處理的XPS圖譜，294.1，291.8，285.3，284.3 eV 處的峰分別歸因于-CF3、-CF2、C-O 和C-C/C-H。涂膜表面的F1s、Si2p 和C1s 的檢測 結(jié)果表 明，涂膜已 被PFOTS 成功改性[33]。

2.1.4 改性SiOx/WPU 涂膜AFM 表征 圖4 為SiOx/WPU 涂膜的AFM 圖像。由圖4a 可知，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面的微米級凸起完全由幾十納米的SiOx 顆粒聚集而成，其平均粗糙度Ra 值為273.1 nm，表面高度差約為2 μm。由圖4b可知，改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面高度差約為1.6 μm，Ra 值為212.3 nm，其表面凸起主要是由納米級的SiOx 顆粒相互聚集和微納米級的SiOx 顆粒相互堆疊而成。由圖4c 可知，改性CSiOx/WPU 涂膜與改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜相似，表面的凸起僅由粒徑約為400 nm 左右的SiOx 顆粒組成。此結(jié)果與SEM 檢測結(jié)果一致。

圖4 改性SiOx/WPU 涂膜高分辨率AFM 圖Fig.4 AFM images of modified SiOx/WPU coatings

2.1.5 改性SiOx/WPU 涂膜的熱穩(wěn)定性評價 圖5a 為各改性SiOx/WPU 涂膜在20～250 ℃的DSC曲線圖。改性SiOx/WPU 涂膜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）和熔化溫度（Tm）主要與WPU 中的軟段鏈和硬段鏈有關(guān)。WPU 中軟段鏈與硬段鏈的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度相差很大，其中軟段鏈的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tgs）遠低于0 ℃，而硬段鏈的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tgh）則在80～100 ℃，遠高于室溫[34]。由圖可見，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜在81.96 ℃處出現(xiàn)第1個吸熱峰，而改性微米級SiOx/WPU 涂膜和改性C-SiOx/WPU 涂膜分別在64.02 ℃和25.94 ℃處出現(xiàn)第1 個吸熱峰，在79.03 ℃和79.86 ℃處出現(xiàn)第2 個吸熱峰，表明3 種改性SiOx 顆粒均可與涂膜中WPU 的軟段鏈發(fā)生相互作用。而3 種改性SiOx/WPU 涂膜分別在146.08，140.36，153.27 ℃出現(xiàn)的吸熱峰對應(yīng)于涂膜中WPU 硬段鏈的熔化溫度（Tmh），與其硬段鏈的短程有序轉(zhuǎn)變有關(guān)[33]。3種涂膜中WPU 的硬段鏈短程有序化的焓變（ΔH）分別為14.49，15.82，19.48 J/g，表明C-SiOx 顆粒與WPU 的硬段鏈相互作用弱于改性氣相納米SiOx 顆粒和改性微米級SiOx 顆粒。此外，CTAB的熔化吸熱使改性C-SiOx/WPU 涂膜在210.75 ℃出現(xiàn)一個弱吸熱峰。

圖5 不同粒徑低表面能改性SiOx/WPU 涂膜的DSC 圖（a）、TGA 圖（b）和DTG 圖（c）Fig.5 DSC（a），TGA（b）and DTG（c）spectra of low surface energy modified SiOx/WPU coatings with different particle sizes

圖5b 和5c 為改性SiOx/WPU 涂膜的TGA 和DTG 曲線。由圖可見，改性SiOx/WPU 涂膜的初始質(zhì)量損失均發(fā)生在44～100 ℃左右，這是由涂膜中的水分損失造成的。第2 階段的質(zhì)量損失發(fā)生在150～200 ℃之間，主要與涂膜中WPU 硬段鏈中脲基甲酸酯的分解有關(guān)。在200～320 ℃改性氣相SiOx/WPU 涂膜、改性微米級SiOx/WPU 涂膜和改性C-SiOx/WPU 涂膜的質(zhì)量損失主要與涂膜中WPU 硬段鏈的脲基甲酸酯和氨基甲酸酯分解有關(guān)，其質(zhì)量損失依次約為11.49%，12.38%，17.35%。由此可見，改性氣相SiOx 顆粒和改性微米級SiOx顆粒對WPU 中硬段的相互作用更強，這與DSC分析結(jié)果一致。在320～430 ℃之間，3 種改性SiOx/WPU 涂膜的質(zhì)量損失分別約為12.33%，13.81%，14.40%，此階段的質(zhì)量損失主要與涂膜中WPU 軟段鏈中聚醚多元醇的分解有關(guān)。在430～640 ℃之間，3 種改性SiOx/WPU 涂膜的質(zhì)量損失主要與改性劑和WPU 中殘留物的碳化有關(guān)，分別約為13.04%，14.74%，11.93%。

2.1.6 改性SiOx/WPU 涂膜表面的接觸角和表面能 由圖6 可見，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜的水接觸角為155.9°±5.9°，正十六烷的接觸角為0°，表面能為（23.4±2.4）J/m2，為超疏水超親油表面。這是因為改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面完全由幾十納米的SiOx 顆粒構(gòu)成，其表面的的微米級凸起形成的氣層無法抵御正十六烷的完全浸潤。改性微米級SiOx/WPU 涂膜的水接觸角為154.5°±2.1°，正十六烷的接觸角為132.8°±0.7°，表面能最低，僅有（0.3±0.1）J/m2，為超雙疏表面。結(jié)合SEM 結(jié)果分析認為，這是因為改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面SiOx 微納米粒子交互存在，形成了微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)，這種不規(guī)則的拓撲結(jié)構(gòu)使涂膜與液滴間可以形成固-氣-液三相交互的復(fù)合界面，液滴無法浸潤涂膜表面，使其具有超雙疏性能。改性C-SiOx/WPU 涂膜的水和正十六烷接觸角分別為139.9°±3.5°和0°，表面能最高，達到（229.6±4.2）J/m2，為疏水超親油表面。這是因為改性C-SiOx/WPU 涂膜表面與改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面相似，僅由粒徑均一的SiOx 顆粒構(gòu)成，無法形成微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)，因此同樣會被正十六烷完全浸潤。結(jié)合涂膜的XPS 譜圖分析可得，表面F 相對含量最低的改性微米級SiOx/WPU涂膜的表面疏水疏油效果最好，表明高氟含量并不是形成涂膜超雙疏性能唯一特性，表面微觀形貌同樣顯著影響涂膜的疏水疏油性能和表面能。

圖6 改性SiOx/WPU 涂膜的表面濕潤性和表面能Fig.6 Surface wettability and surfaceenergy of the modified SiOx/WPU coatings

2.2 改性SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜菌微觀形貌分析

圖7 為培養(yǎng)不同時間后各涂膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜微觀形貌的SEM 圖。由圖7（a1～c1）可見，培養(yǎng)4 h 后，各涂膜表面黏附的被膜菌數(shù)量均較少。由圖7（a2～c2）可見，培養(yǎng)12 h 后，多個細菌的不可逆黏附出現(xiàn)在超疏水超親油性的改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜和疏水超親油性的改性CSiOx/WPU 涂膜表面，且改性C-SiOx/WPU 涂膜表面黏附的細菌開始形成微菌落，而改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面仍為單個細菌的不可逆黏附。如圖7（a3-c3）所示，培養(yǎng)24 h 后，改性氣相SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌主要以微菌落的形式存在；改性C-SiOx/WPU 涂膜表面的細菌數(shù)量大量增加，微菌落相互聚集，形成成熟的生物被膜；而改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面的被膜菌則剛開始形成微菌落。

可見，改性C-SiOx/WPU 涂膜表面黏附的被膜菌數(shù)量最多，在24 h 時涂膜表面的生物被膜已到成熟期，這是由于改性C-SiOx/WPU 涂膜僅具有疏水性能，不能有效抑制被膜菌的黏附及其生物被膜的形成。改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面黏附的細菌數(shù)量次之，在24 h 時未形成成熟的生物被膜，這可能是由于改性氣相納米SiOx/WPU涂膜表面的疏水性能更強，使其與菌懸液之間形成了一個較小空氣層，可以在一定程度上阻礙被膜菌與涂膜表面的接觸，從而延緩了涂膜表面生物被膜的形成。由微納米級SiOx 顆粒形成不規(guī)則的拓撲結(jié)構(gòu)，構(gòu)成改性微米級SiOx/WPU 涂膜具有超雙疏性能，該薄膜在菌懸液中可較長時間地維持Cassie 狀態(tài)，且空氣層占比最多，因此表面黏附的細菌數(shù)量最少，抑制生物被膜形成的能力最優(yōu)，在24 h 時才開始出現(xiàn)微菌落。

2.3 改性SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜菌相關(guān)指標(biāo)分析

圖8 為改性SiOx/WPU 涂膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜相關(guān)指標(biāo)的測定結(jié)果。由圖8a 和8b可見，0～2 h，涂膜表面細菌數(shù)量開始增加，培養(yǎng)基中游離的腐敗希瓦氏菌開始黏附在涂膜表面進行可逆黏附。相較而言，雖然3 種涂膜表面黏附的細菌數(shù)量無顯著差異，但是改性微米級SiOx/WPU涂膜表面黏附的細菌數(shù)量少于改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜和改性C-SiOx/WPU 涂膜，表明超雙疏性的改性微米級SiOx/WPU 涂膜可抑制細菌的初期黏附。在此階段，各樣品表面被膜菌代謝活性均緩慢增加無顯著差異。2～12 h，涂膜表面的被膜菌數(shù)量增加趨勢減緩，細菌開始進行不可逆黏附。在此階段，改性C-SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌數(shù)量和代謝活性最高，說明疏水超親油性的改性C-SiOx/WPU 涂膜有利于細菌的不可逆黏附；改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面黏附的細菌數(shù)量及其代謝活性次之，表明超疏水超親油性的改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜對細菌的不可逆黏附有一定程度的抑制作用；而超雙疏性的改性SiOx/WPU涂膜對細菌不可逆黏附的抑制效果最好，因此其表面的被膜菌數(shù)量和代謝活性處于最低水平，表明。12～24 h，被膜菌形成微菌落，從而促進生物被膜的形成。在此階段，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌數(shù)量仍以較快的速度增加，并在24 h 時與改性C-SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌數(shù)量相近，而改性C-SiOx/WPU 涂膜表面細菌增長逐漸變緩，表明改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜在一定程度上可以抑制細菌的黏附及生物被膜的形成，然而其表面利于被膜菌的定植，因此其表面被膜菌代謝活性繼續(xù)增加。而改性C-SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜已接近成熟期，且由于此階段涂膜表面被膜菌數(shù)量過多，胞外多聚物逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楸荒ぞ臓I養(yǎng)提供體，使菌體自身的代謝活性降低。此時，改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面的黏附被膜菌數(shù)量仍保持最低水平，表明該涂膜可有效抑制被膜菌形成微菌落，進而形成生物被膜。可見，超雙疏的改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面可顯著抑制被膜菌的黏附及其表面生物被膜的形成。

圖8 改性SiOx/WPU 涂膜表面腐敗希瓦氏菌生物被膜相關(guān)指標(biāo)的變化Fig.8 Changes of related indexes of Shwanella putrefaciens biofilm on the modified SiOx/WPU coatings

抑制細菌EPS 的分泌可以控制細菌與材料表面的初始黏附以及形成生物被膜的膜性結(jié)構(gòu)[35]。由圖8c 可見，各涂膜表面EPS 均隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加。在0～12 h 細菌的可逆與不可逆黏附階段，改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面EPS增加最慢，表明超雙疏的改性微米級SiOx/WPU涂膜可抑制細菌EPS 的分泌及微菌落的形成。此時，改性C-SiOx/WPU 涂膜表面EPS 的增加速度最快，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜次之。在12～24 h，改性C-SiOx/WPU 涂膜的表面EPS 的增加變得緩慢，而改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面EPS 繼續(xù)增加，在24 h 時涂膜表面被膜菌EPS 含量超過了改性C-SiOx/WPU 涂膜，而改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌的EPS 含量雖然繼續(xù)增加，但仍保持較低水平。該結(jié)果表明，具有單一粗糙結(jié)構(gòu)的改性C-SiOx/WPU 涂膜表面的生物被膜已成熟，EPS 分泌逐漸減少；改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜在此階段更有利于細菌分泌EPS形成微菌落；而由于改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面的特殊微納米拓撲結(jié)構(gòu)，其仍可抑制細菌形成微菌落，故EPS 分泌最少。

如圖8d 所示，在生物被膜形成過程中各涂膜的表面生物被膜總蛋白逐漸增加。其中，改性CSiOx/WPU 涂膜表面的生物被膜總蛋白含量增加速度最快，高于同期其它樣品，可能是因為該涂膜表面由粒徑為400 nm 的SiOx 顆粒組成，無微米級凸起，盡管表面含有最多的氟碳化合物，但僅具有疏水性能，無疏油性能，無法阻止被膜菌的黏附，并抑制其生物被膜的形成。培養(yǎng)至12 h 之前，改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜的總蛋白含量較低，培養(yǎng)至24 h 時，涂膜表面總蛋白量與改性C-SiOx/WPU 涂膜表面的總蛋白含量相當(dāng)，這是由于其雖具有超疏水性能，但其疏油能力仍較差，培養(yǎng)至12 h 后，細菌在涂膜表面大量黏附，該結(jié)果與被膜菌的生長曲線試驗結(jié)果一致。在生物被膜培養(yǎng)過程中，改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面生物被膜總蛋白的含量最低，這是由于其與菌懸液間維持較長時間的Cassie 狀態(tài)，“捕獲”足夠的空氣，從而抑制細菌的不可逆黏附和已黏附細菌分泌EPS，并阻止其形成微菌落。

ATP 酶存在于細胞內(nèi)外膜上，主要參與ATP的分解，胞外ATP 酶的活性揭示了被膜菌細胞膜的完整性[36-38]。AKP 酶主要存在于細胞膜與細胞壁之間，胞外AKP 酶的水平同樣也可以反應(yīng)被膜菌細胞壁受損傷的程度[39]。如圖8e～8f 所示，在培養(yǎng)24 h 后，超雙疏性的改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面被膜菌ATP 酶和AKP 酶活性最低，表明生物被膜內(nèi)ATP 酶和AKP 酶活性最低，這是由于其表面特殊的微納米拓撲結(jié)構(gòu)使涂膜可有效抑制細菌的黏附，阻止細菌胞外多糖的分泌，進而抑制被膜菌形成微菌落。

3 結(jié)論

采用不同SiOx 顆粒改性獲得的改性SiOx/WPU 涂膜的理化性能差異顯著，對水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能不同。其中由兩種不同粒徑的SiOx 顆粒形成微納米拓撲結(jié)構(gòu)的改性微米級SiOx/WPU 涂膜表面表現(xiàn)為超雙疏性，表面能最低，涂膜熱穩(wěn)定性較高?？娠@著抑制細菌的黏附和已黏附細菌的代謝活性、EPS 分泌、ATP 酶和AKP 酶活性，進而抑制微菌落的形成。改性氣相納米SiOx/WPU 涂膜表現(xiàn)為超疏水超親油性，表面能較低，涂膜的熱穩(wěn)定性最高，可以抑制細菌的初期黏附，然而隨著培養(yǎng)時間的延長，表面黏附細菌量快速增加。改性C-SiOx/WPU 涂膜表現(xiàn)為疏水超親油性，表面能最高，熱穩(wěn)定性最差，抗細菌黏附的性能最差。采用微米級SiOx 顆粒改性制備的改性SiOx/WPU 涂膜對水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌生物被膜的抑制性能最優(yōu)，本研究可為制備具有抗生物被膜性能的食品包裝材料提供技術(shù)支撐。