鋅離子絡(luò)合法快速分離純化蕎麥殼黃酮及其抗AGEs 活性

王玥，劉子琦，聶萌滋，姜 鑫，李鵬程，閆夢(mèng)華，樸春紅*，肖盛元

（1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 長(zhǎng)春130118 2 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 長(zhǎng)春130118 3 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部食藥用菌工程研究中心 長(zhǎng)春 130118）

蕎麥（Fagopyrum esculentum）含有抗糖尿病、降血脂、降血糖和抗氧化等多種生物活性，被普遍加工成食藥用產(chǎn)品[1-5]。蕎麥殼是蕎麥生產(chǎn)中最多的副產(chǎn)物，占據(jù)蕎麥質(zhì)量的三分之一[6]，然而，其利用途徑較少，大多作為廢棄物被丟棄，沒(méi)有得到充分的利用。研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥殼富含多種生物活性成分，如黃酮類(lèi)化合物、蕎麥糖醇、功能性蛋白、膳食纖維等[7-9]，是天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)的重要資源。

黃酮類(lèi)化合物被廣泛認(rèn)為是蕎麥殼中的主要活性成分，能夠顯著減輕糖尿病小鼠的胰島素抵抗，改善脂質(zhì)代謝紊亂[10]，并抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced glycation end products，AGEs）形成，可通過(guò)調(diào)節(jié)AGE-RAGE 信號(hào)通路保護(hù)糖尿病小鼠腎臟[11]。生物活性物質(zhì)的分離純化在功能性食品和醫(yī)藥行業(yè)至關(guān)重要，直接影響產(chǎn)品的品質(zhì)和價(jià)格。目前黃酮類(lèi)化合物的分離純化方法包括萃取、大孔樹(shù)脂、膜分離、高效液相色譜等[12-13]，存在純化周期長(zhǎng)、消耗大、成本高等缺點(diǎn)。金屬離子絡(luò)合法操作簡(jiǎn)單、快捷、成本低、周期短，在黃酮類(lèi)化合物的分離純化中具有良好的應(yīng)用前景[14]。

金屬離子絡(luò)合法分離純化黃酮類(lèi)化合物的原理是：在堿性條件下，黃酮類(lèi)化合物上的羥基易質(zhì)子化，配合強(qiáng)配位的氧原子以及合適的空間構(gòu)型，與部分金屬鹽絡(luò)合形成穩(wěn)定的沉淀，從而與其它可溶性雜質(zhì)分離，利用更強(qiáng)的金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-2Na），將絡(luò)合態(tài)黃酮類(lèi)化合物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)黃酮類(lèi)化合物，達(dá)到黃酮類(lèi)化合物分離純化的目的[15]。含5-羥基或鄰羥基的黃酮類(lèi)化合物可與鉛、鐵、銅、鋅等多種金屬陽(yáng)離子形成絡(luò)合物，然而，鉛污染環(huán)境，鐵、銅等氧化能力過(guò)強(qiáng)，會(huì)破壞黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)[16]。鋅離子是人體必需的微量元素之一，微量存在不會(huì)危害人體健康。殘留的鋅離子一般以絡(luò)合態(tài)存在，研究發(fā)現(xiàn)，絡(luò)合態(tài)的鋅離子同樣具有抗氧化、抗癌、抗糖尿病等生物活性[17-18]。

亞硝酸鈉-三氯化鋁（NaNO2-AlCl3）比色法和三氯化鋁-乙酸鹽（AlCl3-NaAC）比色法是用于總黃酮測(cè)定的主要化學(xué)方法，反應(yīng)原理如圖1 所示。前者是酚羥基位點(diǎn)，后者是3-羥基或5-羥基位點(diǎn)與鋁離子發(fā)生顯色反應(yīng)[19]。由于植物提取物組成復(fù)雜，總黃酮的測(cè)定結(jié)果易受非黃酮類(lèi)化合物的干擾，不同來(lái)源提取物的總黃酮測(cè)定方法亦有差別[20-21]。研究表明，與NaNO2-AlCl3法相比，AlCl3-NaAC 法更適合表征蕎麥殼黃酮[22]。課題組前期研究表明，NaNO2-AlCl3法測(cè)定蕎麥殼總黃酮含量的結(jié)果與高效液相色譜法的結(jié)果差異較大[23]。本研究選用AlCl3-NaAC 法，采用鋅離子絡(luò)合法分離純化蕎麥殼黃酮，優(yōu)化其工藝參數(shù)。旨在提供一種快速分離純化蕎麥殼黃酮的方法，為其高效利用以及食藥用產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定參考。

圖1 化學(xué)比色法測(cè)定黃酮的反應(yīng)原理Fig.1 Reaction principle of determination of flavonoids by chemical colorimetry

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕎麥殼購(gòu)于內(nèi)蒙古赤峰市。蕎麥殼黃酮的提取參照趙梓瀛等[23]的方法，其蕎麥殼黃酮提取物（Buckwheat hull flavonoids，BHF）的總黃酮含量為8.60 g RE/100 g（AlCl3-NaAC 法）和96.61 g RE/100g（NaNO2-AlCl3法），RE 表示蘆丁當(dāng)量。

Super 200 反相聚合物填料，南京亙閃生物科技有限公司；RP-C18 薄層硅膠色譜板，默克化工技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純），德國(guó)Meker 公司；牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）、丙酮醛（Methylglyoxal，MGO），美國(guó)Sigma 公司；其余所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini BIS Pro 熒光凝膠成像系統(tǒng)，以色列DNR 公司；Agilent 1100 高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；FLUOstar Omega 熒光酶標(biāo)儀，德國(guó)BMG LABTECH 公司。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥殼黃酮的分離純化

1.3.1.1 分離純化流程

1.3.1.2 操作要點(diǎn)

1）一次鋅離子絡(luò)合 將BHF 溶解于乙醇，與乙酸鋅溶液充分混勻，加入適量氨水調(diào)節(jié)pH，絡(luò)合反應(yīng)后，7 000 r/min 離心10 min，以上清液中剩余黃酮量計(jì)算黃酮絡(luò)合轉(zhuǎn)化率。沉淀經(jīng)3%EDTA-2Na 溶液溶解（含10%乙醇），Super 200 柱層析富集、70%乙醇洗脫后，真空濃縮，冷凍干燥，獲得蕎麥殼黃酮中間提取物（Intermediates of buckwheat hull flavonoids，IBHF）。

2）二次鋅離子絡(luò)合 將IBHF 溶解于乙醇，與乙酸鋅溶液按質(zhì)量比2∶1，充分混勻，加入氨水調(diào)節(jié)pH，絡(luò)合反應(yīng)后，7 000 r/min 離心10 min，以硅膠薄層色譜檢測(cè)上清液中的黃酮純度。上清液經(jīng)Super 200 柱層析富集、70%乙醇洗脫后，真空濃縮，冷凍干燥，獲得蕎麥殼高黃酮組分（High purity buckwheat hull flavonoids，HBHF）。

黃酮絡(luò)合轉(zhuǎn)化率以鋅離子絡(luò)合前、后溶液中的總黃酮含量計(jì)算，公式如下：

式中，C0——反應(yīng)前溶液中的黃酮含量（mg/mL）；V0——反應(yīng)前溶液的體積（mL）；C1——反應(yīng)后上清液中的黃酮含量（mg/mL）；V1——反應(yīng)后上清液的體積（mL）。

1.3.2 IBHF 組分的分離純化工藝參數(shù)優(yōu)化

1.3.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 參照Wang 等[24]的方法，略作修改。分別配制4 mg/mL BHF 溶液與10 mg/mL乙酸鋅溶液，絡(luò)合反應(yīng)一定時(shí)間，以絡(luò)合轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，分別考察乙酸鋅與樣品質(zhì)量比、氨水體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)蕎麥殼黃酮絡(luò)合轉(zhuǎn)化率的影響。試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 單因素實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor level of single factor test

1.3.2.2 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取乙酸鋅與樣品質(zhì)量比、氨水體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，黃酮絡(luò)合轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，做Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平如表2 所示。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factor level of Box-Behnken

1.3.3 蕎麥殼黃酮檢測(cè)方法

1.3.3.1 總黃酮含量測(cè)定 采用AlCl3-NaAC 法測(cè)定樣品中的總黃酮含量，方法參照Sarker 等[25]的方法并略作修改。將500 μL 樣品、1 mL 三氯化鋁溶液（1 mmol/L）、1.5 mL 醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH 5.5）置于試管中，混勻后室溫靜置30 min，于417 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸方程分析，回歸方程y=2.882x+0.0411（R2=0.9993），蕎麥殼總黃酮含量結(jié)果以g RE/（100g）表示。

1.3.3.2 硅膠薄層色譜 硅膠薄層色譜法是常用于黃酮類(lèi)化合物鑒定的技術(shù)手段之一，分離后的樣本經(jīng)過(guò)不同的方法顯色，可直觀的判斷樣本中是否存在黃酮類(lèi)化合物。

將樣品用25%乙醇配成1 mg/mL 的溶液，取5 μL 依次點(diǎn)至同一塊110 ℃活化30 min 的硅膠板上，展開(kāi)劑為40%乙醇溶液，顯色方式分別為10%的硫酸-甲醇溶液和254 nm 的紫外光，待樣品在層析缸中展開(kāi)完全后，風(fēng)干，噴以顯色劑烘干或直接置于紫外光下觀察拍照。

1.3.3.3 紫外光譜 將樣品配成0.02 mg/mL 的溶液，以25%乙醇為空白溶劑對(duì)照，用酶標(biāo)儀進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，波長(zhǎng)范圍250～500 nm，掃描間距1 nm，掃描次數(shù)3。以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制紫外光譜。

1.3.3.4 HPLC 色譜柱：XTerra MS C18（3.9 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：0.5%甲酸銨和0.5%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸（pH 4.4～4.5），現(xiàn)用現(xiàn)配；流動(dòng)相B：純甲醇；流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，進(jìn)樣量20 μL。梯度洗脫程序：0～3 min，30%B；3～20 min，30%～85%B；20～23 min，85%～95%B，然后2 min 內(nèi)恢復(fù)到初始狀態(tài)，持續(xù)5 min。

1.3.4 AGEs 生成抑制能力 參照趙梓瀛等[23]的方法。制備Glu-BSA 體系與MGO-BSA 體系的AGEs，在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm 和發(fā)射波長(zhǎng)460 nm 處檢測(cè)熒光強(qiáng)度，考察蕎麥殼黃酮樣品對(duì)不同體系A(chǔ)GEs 的生成抑制能力。抑制率的計(jì)算公式：

式中，F(xiàn)0——空白組熒光值；F1——試驗(yàn)組熒光值；F2——對(duì)照組熒光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果用“xˉ±SD”表示，所有數(shù)據(jù)均做3 個(gè)平行試驗(yàn)。用Excel 軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，用GraphPad Prism 7.0 制圖與方差分析，P〈0.05 差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 IBHF 組分的分離純化工藝參數(shù)優(yōu)化

以黃酮絡(luò)合轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，選取乙酸鋅與樣品質(zhì)量比、氨水體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間做單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2 所示。不同的乙酸鋅與樣品質(zhì)量比、氨水體積分?jǐn)?shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)在測(cè)定范圍內(nèi)，絡(luò)合轉(zhuǎn)化率均呈先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)（圖2a～2c）。溫度40 ℃以下時(shí)，絡(luò)合轉(zhuǎn)化率均可以維持在95.6%，而高于40 ℃時(shí)絡(luò)合轉(zhuǎn)化率反而下降（圖2d）。絡(luò)合反應(yīng)5 min 內(nèi)基本反應(yīng)完全（圖2e）。綜合考慮，選擇室溫下反應(yīng)10 min，以乙酸鋅與樣品質(zhì)量比（A）、氨水體積分?jǐn)?shù)（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）為自變量，絡(luò)合轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，做Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。各因素交互作用響應(yīng)面結(jié)果如圖3 所示。使用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，二次多項(xiàng)式回歸方程為Y=0.97+0.13A+0.48B-0.31C-0.058AB+0.19AC+0.55BC-0.76A2-0.57B2-0.41C2，R2=0.9875。從表3 可看出，模型的F 值為61.64，P〈0.0001，達(dá)到極顯著的水平。失擬向P=0.4307〉0.05，不顯著，表明方程擬合良好，可用于蕎麥殼黃酮絡(luò)合過(guò)程參數(shù)的模型分析。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

圖2 不同質(zhì)量比（a）、氨水體積分?jǐn)?shù)（b）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（c）、反應(yīng)溫度（d）、反應(yīng)時(shí)間（e）對(duì)蕎麥殼黃酮絡(luò)合轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of mass ratio（a），ammonia volume fraction（b），ethanol volume fraction（c），reaction temperature（d），reaction time（e）on complex conversion rate of buckwheat hull flavonoids

圖3 兩因素交互作用對(duì)蕎麥殼黃酮絡(luò)合轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of interaction between two factors on complex conversion rate of buckwheat hull flavonoids

由上述模型可知，蕎麥殼黃酮中間提取物IBHF 的最佳絡(luò)合條件為乙酸鋅與樣品質(zhì)量比2 ∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，氨水體積分?jǐn)?shù)0.05%，室溫反應(yīng)10 min。此條件下黃酮絡(luò)合轉(zhuǎn)化率為97.44%，驗(yàn)證試驗(yàn)得到黃酮絡(luò)合平均轉(zhuǎn)化率為97.51%，表明試驗(yàn)結(jié)果與模型吻合良好，Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化的工藝參數(shù)可行。在該條件下黃酮類(lèi)化合物基本與鋅離子絡(luò)合并產(chǎn)生沉淀。林華婷等[26]報(bào)道乙酸鋅絡(luò)合鼠曲草黃酮的絡(luò)合轉(zhuǎn)化率為89.09%。雷永平等[27]報(bào)道刺玫果黃酮的絡(luò)合轉(zhuǎn)化率為96.94%。本研究黃酮絡(luò)合轉(zhuǎn)化率在97%以上，高于目前的報(bào)道。

2.2 IBHF 組分的二次鋅離子絡(luò)合

硅膠薄層色譜是鑒定黃酮類(lèi)化合物較為簡(jiǎn)單的方法。在化學(xué)顯色劑作用下，黃酮類(lèi)化合物會(huì)出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)。IBHF 組分的硅膠薄層色譜（圖4a）結(jié)果顯示，IBHF 組分中除黃酮類(lèi)化合物外，還存在一類(lèi)具有金屬絡(luò)合活性的非黃酮類(lèi)化合物，嚴(yán)重干擾了蕎麥殼黃酮類(lèi)化合物的純化。通過(guò)控制乙酸鋅與樣品質(zhì)量比對(duì)IBHF 組分進(jìn)行二次絡(luò)合，從而使黃酮類(lèi)化合物的分離。圖4b 結(jié)果顯示蕎麥殼非黃酮類(lèi)化合物與鋅離子的絡(luò)合強(qiáng)度大于黃酮類(lèi)化合物，在鋅離子量不足的情況下，非黃酮類(lèi)化合物首先出現(xiàn)于沉淀中，而黃酮類(lèi)化合物大部分留在上清液中。隨著乙酸鋅與樣品質(zhì)量比的增大，越來(lái)越多的黃酮類(lèi)化合物出現(xiàn)于沉淀中。乙酸鋅與樣品質(zhì)量比1∶2 是二者分離的關(guān)鍵點(diǎn)，此條件下只有少量黃酮類(lèi)化合物與鋅離子生成沉淀，黃酮類(lèi)化合物與非黃酮類(lèi)化合物可基本分離。

圖4 IBHF 組分（a）及不同乙酸鋅與樣品質(zhì)量比條件下二次鋅離子絡(luò)合IBHF 組分（b）的硅膠薄層色譜圖Fig.4 Silica gel TLC of IBHF（a）and IBHF separated through secondary zinc ion complexation at different zinc acetate to sample mass ratios（b）

圖5a 為HBHF 組分的鋅離子絡(luò)合程序，可呈現(xiàn)鋅離子絡(luò)合法對(duì)蕎麥殼黃酮的純化效果。一次鋅離子絡(luò)合后，IBHF 組分顏色與BHF 組分相近，為蕎麥殼特有的棕褐色，而二次鋅離子絡(luò)合后，HBHF 組分顏色發(fā)生明顯變化，呈黃酮類(lèi)化合物特有的黃色。分離純化過(guò)程中各組分的得率如圖5b 所示，IBHF 組分得率為66.77%，去除了33.34%不具有金屬絡(luò)合活性的可溶性雜質(zhì)，而HBHF 組分得率為18.23%，說(shuō)明IBHF 組分中黃酮類(lèi)化合物占比較少，其主要成分為具有金屬絡(luò)合活性的非黃酮類(lèi)化合物。以上結(jié)果表明，通過(guò)二次鋅離子絡(luò)合，IBHF 組分中黃酮類(lèi)化合物與非黃酮類(lèi)化合物達(dá)到成功分離。

圖5 BHF 組分的鋅離子絡(luò)合程序（a）及得率（b）Fig.5 Zinc ion complexation procedure（a）and yield（b）of BHF

2.3 HBHF 組分的黃酮鑒定分析

紫外光譜與硅膠薄層色譜是常用于黃酮類(lèi)化合物鑒定的技術(shù)手段，不同結(jié)構(gòu)的黃酮類(lèi)化合物具有不同的紫外光譜，且在硅膠薄層色譜板上有不同的吸附位置。圖6a 為紫外光譜結(jié)果，HBHF組分主要有291 nm 和349 nm 兩個(gè)最大吸收波長(zhǎng)處，與蘆丁289 nm 和359 nm 處的兩個(gè)特征吸收峰相近，表明HBHF 組分為黃酮類(lèi)化合物。BHF組分與IBHF 組分的最大吸收波長(zhǎng)僅出現(xiàn)在287 nm 處，屬于非黃酮類(lèi)化合物。吸附在硅膠薄層板上的黃酮類(lèi)化合物在特定紫外光下會(huì)出現(xiàn)熒光點(diǎn)。圖6b 顯示BHF 組分中僅有一個(gè)微弱熒光點(diǎn)，而HBHF 組分中顯現(xiàn)3 個(gè)突出的熒光點(diǎn)，說(shuō)明BHF 組分中低豐度的黃酮類(lèi)化合物在HBHF 中得到顯著的富集。

圖6 HBHF 的黃酮鑒定分析Fig.6 Identification and analysis of flavonoids in HBHF

總黃酮含量（圖6c）數(shù)值再次證明鋅離子絡(luò)合法純化蕎麥殼黃酮的適用性。BHF 組分的總黃酮含量為8.60 g RE/100g，IBHF 組分為12.09 g RE/100 g，HBHF 組分為57.08 g RE/100 g。一次鋅離子絡(luò)合雖受到具有金屬絡(luò)合活性非黃酮類(lèi)化合物的干擾，但I(xiàn)BHF 組分的總黃酮含量仍提高了1.41 倍；二次鋅離子絡(luò)合分離獲得蕎麥殼高黃酮組分HBHF，總黃酮含量較BHF 組分提高了6.64倍。Wang 等[28]使用金屬離子絡(luò)合法純化甘草黃酮，黃酮含量由36.47%增到63.56%，提高了1.74倍；Zhang 等[14]采用乙酸鋅分離純化銀杏葉黃酮，黃酮含量由24%增到55%，提高了2.29 倍；Sun等[16]采用鋅離子可快速有效地分離黃芩與干血斑（DBS）中的黃酮類(lèi)化合物，成功去除背景物質(zhì)。然而，金屬離子絡(luò)合法在純化黃酮類(lèi)化合物的應(yīng)用中，未發(fā)現(xiàn)受到具有金屬絡(luò)合活性非黃酮類(lèi)化合物干擾的報(bào)道。蕎麥殼中除黃酮類(lèi)化合物外，還含有單寧、膳食纖維、植酸、多糖等多種非黃酮類(lèi)化合物[29-32]，因存在羥基、羧基等活性基團(tuán)，故與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。

2.4 HBHF 組分的黃酮組成及其含量分析

蕎麥殼高黃酮組分HBHF 的HPLC 分析結(jié)果見(jiàn)圖7 和表4。HPLC 圖譜結(jié)果（圖7）顯示HBHF組分中黃酮類(lèi)化合物分離效果良好，主要觀察到5 種黃酮化合物，分別為異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁和山奈酚-3-O-蕓香糖苷，這與文獻(xiàn)[33]提到的甜蕎麥殼中黃酮組成相似。黃酮含量如表4 所示，蘆丁是HBHF 中主要的成分，占比63.42%，其次是牡荊素、異牡荊素，異葒草素和山奈酚-3-O-蕓香糖苷的含量較少。

表4 HPLC 法分析HBHF 組分的黃酮組成及含量（g/100 g）Table 4 Determination of flavonoids in HBHF by HPLC（g/100 g）

圖7 對(duì)照品（a）與HBHF 組分（b）的HPLC 圖譜Fig.7 HPLC chromatogram of standard（a）and HBHF（b）

黃酮類(lèi)化合物與鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)主要以羥基和羰基為主，鋅離子絡(luò)合后黃酮的富集程度與其結(jié)構(gòu)中活性基團(tuán)的位置與數(shù)量有關(guān)[34]。HBHF 組分中主要包括黃酮化合物與黃酮醇化合物兩種，牡荊素、異牡荊素、異葒草素為黃酮化合物，蘆丁和山奈酚-3-O-蕓香糖苷為黃酮醇化合物，黃酮醇化合物的基本結(jié)構(gòu)較黃酮化合物多一個(gè)3-羥基取代位點(diǎn)，且取代基多為糖苷類(lèi)化合物，提供了大量的羥基[35]。蘆丁作為典型的黃酮醇化合物，較強(qiáng)的金屬絡(luò)合活性使其得到顯著的富集，而山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量低可能與其在蕎麥殼中含量較低有關(guān)[36]。

2.5 HBHF 組分的抗AGEs 活性

因AGEs 在內(nèi)源性蛋白質(zhì)糖基化和美拉德反應(yīng)期間不可逆轉(zhuǎn)地形成并與糖尿病密切相關(guān)，故抑制AGEs 生成對(duì)糖尿病的預(yù)防有重要意義[37]。Glu-BSA 與MGO-BSA 兩個(gè)體系的AGEs 生成抑制能力如圖8 所示，兩個(gè)體系中，所有組別的AGEs 生成抑制率均呈劑量依賴(lài)性增長(zhǎng)，蕎麥殼高黃酮組分HBHF 顯示較強(qiáng)的AGEs 生成抑制能力，且顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照氨基胍（Amino guanidine，AG）。當(dāng)質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時(shí)，在Glu-BSA 體系中HBHF 組分的抑制率為63.16%，AG為46.94%；MGO-BSA 體系中，HBHF 組分的抑制率為42.98%，AG 為26.87%。天然植物的黃酮類(lèi)化合物對(duì)AGEs 活性具有普遍的抑制作用，竹葉黃酮提取物能有效抑制體外AGEs 的形成，尤其是熒光AGEs，葒草素、異葒草素、牡荊素和異牡荊素等黃酮單體化合物在200 μg/mL 時(shí)，對(duì)Glu-BSA 體系A(chǔ)GEs 的抑制率均超過(guò)60%[38]。長(zhǎng)葉多花植物黃酮也可顯著抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成[39]。

圖8 HBHF 組分對(duì)Glu-BSA 體系（a）、MGO-BSA 體系（b）AGEs 的生成抑制能力Fig.8 Inhibition of HBHF on the formation of AGEs in Glu-BSA system（a）and MGO-BSA system（b）

有趣的是，總黃酮含量為8.60 g RE/100 g 的BHF 組分同樣顯示較強(qiáng)的AGEs 生成抑制能力，且顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照AG，當(dāng)質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時(shí)，Glu-BSA 體系的抑制率為58.49%，生成抑制能力略低于HBHF 組分，差異不顯著；MGOBSA 體系的抑制率為38.16%，生成抑制能力顯著低于HBHF 組分。以上結(jié)果表明，蕎麥殼黃酮類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的抗AGEs 活性，然而，黃酮類(lèi)化合物不是蕎麥殼中唯一的活性物質(zhì)，蕎麥殼非黃酮類(lèi)化合物同樣具有較強(qiáng)的AGEs 生成抑制能力。今后對(duì)非黃酮類(lèi)化合物的深入探究可為提高蕎麥殼的附加值提供新的思路。

3 結(jié)論

首次應(yīng)用二次鋅離子絡(luò)合法純化蕎麥殼黃酮，確定HBHF 組分的AGEs 生成抑制能力。采用Box-Behnken 響應(yīng)曲面分析法獲得蕎麥殼黃酮中間提取物IBHF 的最佳工藝參數(shù)條件下的絡(luò)合轉(zhuǎn)化率為97.44%。IBHF 組分經(jīng)二次鋅離子絡(luò)合分離獲得蕎麥殼高黃酮組分HBHF，其純度較分離純化前提高了6.64 倍，主要包含異葒草素、牡荊素、異牡荊素、蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷5 種黃酮，其中蘆丁占比62.34%。HBHF 組分對(duì)Glu-BSA 和MGO-BSA 兩個(gè)體系中AGEs 生成的抑制能力均顯著優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照氨基胍。本研究提供了一種快速分離純化蕎麥殼黃酮的方法，并對(duì)蕎麥殼黃酮組成及AGEs 生成抑制能力進(jìn)行分析，為蕎麥殼活性成分與功能的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。