戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)馬瑟蘭干紅葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)的影響

賈世寬，劉亞瓊，陳佳威，楊學(xué)威，傅曉方，王 頡*

（1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定071000 2 中國(guó)長(zhǎng)城葡萄酒有限公司 河北張家口 075400）

馬瑟蘭（Marselan）是一種原產(chǎn)于法國(guó)，由“赤霞珠”和“歌海娜”雜交獲得的紅色釀酒葡萄品種，兼具歌海娜的耐熱性和赤霞珠的細(xì)致感，2001 年首次由懷來(lái)中法莊園引入，目前我國(guó)已成為世界上馬瑟蘭最大的產(chǎn)區(qū)之一[1-2]。河北懷來(lái)晝夜溫差大，光照充足，無(wú)霜期可達(dá)到180～270 d，是我國(guó)最大的縣級(jí)釀酒葡萄種植加工基地，特殊的地理氣候條件造就了優(yōu)質(zhì)的馬瑟蘭釀酒葡萄，用其釀造的單品種和混釀葡萄酒風(fēng)味獨(dú)特，具有廣闊的市場(chǎng)前景[3-4]。

葡萄酒釀造是釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、非釀酒酵母（Non-Saccharomyces cerevisiae）和多種微生物共同作用的結(jié)果[5]。目前，商業(yè)釀酒酵母的廣泛使用導(dǎo)致葡萄酒同質(zhì)化現(xiàn)象日益嚴(yán)重[6]。在自然發(fā)酵過(guò)程中豐富的非釀酒酵母有助于提高葡萄酒的復(fù)雜度和芳香性[7]。近年來(lái)，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵受到葡萄酒行業(yè)的廣泛關(guān)注[8]。非釀酒酵母如戴爾有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）、發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）、有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）等被報(bào)道用于葡萄酒釀造[9-11]。其中，戴爾有孢圓酵母（T.delbrueckii）在釀酒條件下具有高代謝活性以及對(duì)乙醇和SO2的抗性，是葡萄酒釀造中最常使用的商業(yè)非釀酒酵母之一[12-13]。有研究表明，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母順序發(fā)酵可促進(jìn)脂肪酸乙酯的合成，尤其是己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，對(duì)葡萄酒的香氣具有積極影響[14]。然而，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵對(duì)馬瑟蘭葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)的影響鮮有報(bào)道。

本文以河北懷來(lái)產(chǎn)區(qū)馬瑟蘭釀酒葡萄為原料，研究戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母同時(shí)接種和順序接種發(fā)酵對(duì)馬瑟蘭葡萄酒基本理化指標(biāo)、有機(jī)酸和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，并進(jìn)行感官品評(píng)，以期為戴爾有孢圓酵母改善馬瑟蘭干紅葡萄酒風(fēng)味品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬瑟蘭葡萄：2021 年10 月從河北張家口中糧長(zhǎng)城葡萄酒（懷來(lái)）有限公司葡萄園采摘，葡萄果實(shí)含糖量（以葡萄糖計(jì)）為251.73 g/L，含酸量（以酒石酸計(jì)）為5.33 g/L，pH 值為3.49。

釀酒酵母（S.cerevisiae）XR，LAMOTHE ABIET 公司；非釀酒酵母（T.delbrueckii）NS-D，安琪酵母股份有限公司。

3-辛醇（標(biāo)準(zhǔn)品），美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；果膠酶（食品級(jí)），法國(guó)LAFFORT 公司；氯化鈉（分析純）、偏亞硫酸鉀（食品級(jí)），國(guó)藥集團(tuán)有限公司；檸檬酸（分析純）、磷酸（分析純），天津市北辰方正試劑廠；磷酸氫二鈉（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（蘋(píng)果酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、富馬酸），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇（色譜純），北京迪科馬科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977A 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司；57328-u 頂空固相微萃取纖維頭，Supelco 公 司；HP-INNOWAX 毛細(xì)管 色譜柱（60 m×250 μm，0.25 μm），美國(guó)Agilent 公司；Autosampler2707 高效液 相色譜 儀，Waters 公 司；Wine Scan FT 120 FOSS 儀，丹麥FOSS 公司；T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

發(fā)酵工藝流程：馬瑟蘭葡萄→穗選與粒選→除梗破碎→葡萄漿（果膠酶50 mg/L）→焦亞硫酸鉀處理（100 mg/L）→冷浸漬24 h→接種戴爾有孢圓酵母（200 mg/L）和釀酒酵母（100 mg/L）→25 ℃發(fā)酵→發(fā)酵結(jié)束→皮渣分離、調(diào)硫→穩(wěn)定澄清→馬瑟蘭干紅葡萄酒。

酵母的活化：將商業(yè)非釀酒酵母NS-D 活性干粉按200 mg/L 置于無(wú)菌蒸餾水中，于30 ℃水浴鍋活化15 min。將商業(yè)釀酒酵母XR 活性干粉按100 mg/L 置于無(wú)菌蒸餾水中，于30 ℃水浴鍋活化15 min。

本試驗(yàn)設(shè)3 個(gè)處理組，1）SE：先接種戴爾有孢圓酵母，24 h 后接種XR；2）CO：同時(shí)接種XR 和戴爾有孢圓酵母；3）XR：只接種釀酒酵母XR。將除梗破碎后的葡萄果漿分別置于9 個(gè)5 L 發(fā)酵罐內(nèi)（每處理3 個(gè)罐，每罐4 L 葡萄漿）。發(fā)酵過(guò)程中，每天記錄發(fā)酵液的比重，直到比重小于0.996，殘?zhí)切∮? g/L 后，進(jìn)行皮渣分離。將發(fā)酵前、后的樣品放入100 mL 塑料瓶中，密封后置于-80 ℃冰箱貯存，用于理化指標(biāo)、有機(jī)酸含量、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定及感官評(píng)價(jià)。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 理化指標(biāo)的測(cè)定 利用FOSS 儀從波數(shù)926 cm-1到5 012 cm-1進(jìn)行透射掃描，測(cè)定葡萄酒的pH 值、殘?zhí)?、總酸和酒精度等基本理化指?biāo)。

色度、色調(diào)值：參照梁冬梅等[15]方法測(cè)定，酒樣經(jīng)0.45 μm 水系膜過(guò)濾，用與酒樣pH 值一致的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液，0.1 mol/L 檸檬酸溶液）將酒樣稀釋10 倍，用1 cm 比色皿用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)420，520，620 nm 處測(cè)定其吸光值，其中：色度=A420nm+A520nm+A620nm，色調(diào)=A420nm/A520nm。

1.4.2 揮發(fā)性化合物的測(cè)定 參照夏亞男等[16]方法并稍加改進(jìn)。頂空固相微萃?。簶悠方鈨龊?，吸取7.5 mL 葡萄酒，加入20 mL 頂空瓶中，同時(shí)加入10 μL 3-辛醇（300 mg/L）和1 g NaCl，40 ℃水浴預(yù)平衡15 min 后，插入萃取頭吸附40 min，于GC 進(jìn)樣口解析6 min。

色譜分析條件：柱溫箱的升溫程序?yàn)椋?0 ℃保持2 min，然后以3 ℃/min 的速率升至80 ℃，再以5 ℃/min 速率升至230 ℃，持續(xù)6 min。采用不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度240 ℃，載氣He，流量1 mL/min。質(zhì)譜條件：EI 電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃。溶劑延遲時(shí)間8 min，總離子流掃描范圍m/z 35～550。

定性分析：利用質(zhì)譜掃描圖譜與NIST14.L 譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)定性，對(duì)匹配度80%以上的組分進(jìn)行分析。

定量分析：各成分的含量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量，計(jì)算樣品中各香氣組分含量。

1.4.3 有機(jī)酸測(cè)含量的測(cè)定 參照GB/T 5009.157-2003《食品中有機(jī)酸的測(cè)定》[17]，并稍作修改。色譜柱：C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A為純甲醇，B 為0.1%磷酸溶液；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器（Agilent DAD）波長(zhǎng)：220 nm；柱溫：40 ℃；梯度洗脫程序：0～4 min，90%B；4～5 min，90%～40%B；5～7 min，40%～10%B；7～9 min，10%B；9～10 min，10%～90%B。

1.4.4 感官評(píng)價(jià) 專家組成員為葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)中具有品酒師資質(zhì)的人員和研發(fā)人員共11 人組成（女性7 人，男性4 人，年齡29～65 歲，平均40歲）。分別從酒樣的外觀（顏色、澄清度）、口感（酸度、甜度）、香氣（濃郁度、典型性、氧化味）和總體評(píng)分4 個(gè)方面對(duì)各葡萄酒樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，評(píng)分范圍從0（弱）到10（最大強(qiáng)度），結(jié)果為所有評(píng)估小組成員得分的平均值。

1.5 試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析方法

采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用單因素方差分析Dun-can 檢驗(yàn)兩兩比較，顯著性水平P〈0.05。使用Origin 2021 軟件進(jìn)行圖形繪制和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

酒精發(fā)酵前、后的主要理化指標(biāo)見(jiàn)表1。酒精發(fā)酵后各處理組殘?zhí)呛糠秶鸀?.77～3.23 g/L，均低于4 g/L。CO 殘?zhí)呛匡@著低于其它處理組（P〈0.05），酒精度顯著高于XR 和SE（P〈0.05），發(fā)酵最為徹底，這與尹雪林等[9]研究的戴爾有孢圓酵母混菌發(fā)酵獼猴桃酒的結(jié)果一致。與XR 相比，SE和CO 總酸含量顯著降低，pH 顯著增加（P〈0.05），總酸和pH 值的變化一般是由發(fā)酵過(guò)程有機(jī)酸的產(chǎn)生和降解介導(dǎo)[18]。XR 色度顯著高于SE 和CO（P〈0.05），CO 色調(diào)顯著高于XR 和SE（P〈0.05），后者之間無(wú)顯著差異。色調(diào)值越高，表明葡萄酒黃色比例越高，紅色比例越低，這可能與戴爾有孢圓酵母與葡萄酒中兒茶素直接縮合生成錦葵苷二聚體有關(guān)[19-20]。

2.2 混合發(fā)酵對(duì)馬瑟蘭干紅葡萄酒有機(jī)酸含量的影響

混合發(fā)酵對(duì)馬瑟蘭干紅葡萄酒有機(jī)酸含量的影響如圖1 所示。葡萄汁中主要有機(jī)酸含量依次為蘋(píng)果酸、酒石酸、琥珀酸和檸檬酸?；旌习l(fā)酵樣品中蘋(píng)果酸和酒石酸含量顯著低于XR（P〈0.05），表明戴爾有孢圓酵母具有較強(qiáng)的降解蘋(píng)果酸和酒石酸能力，這與Belda 等[21]的研究結(jié)果一致。混合發(fā)酵酒樣中琥珀酸和檸檬酸含量顯著高于XR（P〈0.05），與Martín-García 等[22]關(guān)于戴爾有孢圓酵母琥珀酸和檸檬酸的報(bào)道相異，可能與使用的菌株和發(fā)酵條件有關(guān)。有機(jī)酸可賦予葡萄酒清新爽快的口感、平衡飽滿的酒體，并與醇類化合物作用生成酯，發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸消長(zhǎng)對(duì)葡萄酒的香氣、顏色、風(fēng)味和口感會(huì)產(chǎn)生重要影響[23-24]。

圖1 混合發(fā)酵對(duì)馬瑟蘭干紅葡萄酒有機(jī)酸含量的影響Fig.1 Effect of mixed fermentation on organic acid content of Marselan dry red wine

2.3 混合發(fā)酵對(duì)馬瑟蘭干紅葡萄酒揮發(fā)性成分的影響

混合發(fā)酵對(duì)馬瑟蘭干紅葡萄酒揮發(fā)性成分的影響見(jiàn)表2。從馬瑟蘭干紅葡萄酒中共檢出38 種揮發(fā)性香氣化合物，包括16 種酯、14 種醇、4 種脂肪酸和4 種其它化合物。方差分析結(jié)果表明，不同處理對(duì)馬瑟蘭干紅葡萄酒揮發(fā)性成分的影響差異顯著（P〈0.05），SE 揮發(fā)性成分含量顯著高于CO和XR（P〈0.05）。

2.3.1 混合發(fā)酵對(duì)酯類物質(zhì)含量的影響 順序接種和同時(shí)接種的酯類含量分別比對(duì)照組高出145.06 μg/L 和84.64 μg/L，表明混合發(fā)酵有助于提高葡萄酒中酯類含量，這與宋茹茹等[14]的研究結(jié)果一致。酯類化合物包括乙酸酯和脂肪酸乙酯兩種重要的香氣化合物，對(duì)葡萄酒中水果香氣特征具有積極貢獻(xiàn)[25]。本試驗(yàn)共檢出4 種乙酸酯，其中SE 乙酸異戊酯含量顯著高于其它處理組（P〈0.05），且超過(guò)其閾值，賦予葡萄酒愉悅的水果味。耿仕瑾等[26]研究發(fā)現(xiàn)戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母順序接種，可顯著提高小芒森葡萄酒乙酸異戊酯的含量（P〈0.05）。本試驗(yàn)中檢出的9 種脂肪酸乙酯中辛酸乙酯（白蘭地、果香）、癸酸乙酯（果香、脂香）、己酸乙酯（香蕉、青蘋(píng)果）OAV〉1，十二酸乙酯（花香）OAV〉0.2，對(duì)葡萄酒香氣有積極的貢獻(xiàn)[27]。同時(shí)接種的馬瑟蘭葡萄酒具有較強(qiáng)的產(chǎn)脂肪酸乙酯能力，辛酸乙酯、癸酸乙酯、庚酸乙酯、己酸乙酯和9-癸烯酸乙酯含量較高。其中辛酸乙酯是所有脂肪酸酯中含量最高的化合物，會(huì)產(chǎn)生令人愉悅的水果風(fēng)味[28]。有研究表明，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母順序發(fā)酵可增加龍眼葡萄酒丁酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量[29]。原苗苗等[30]研究表明，戴爾有孢圓酵母明顯提高了赤霞珠脂肪酸乙酯的含量，提高了乙酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量。綜上所述，辛酸乙酯和癸酸乙酯有可能是戴爾有孢圓酵母的特征香氣。

2.3.2 混合發(fā)酵對(duì)醇類物質(zhì)含量的影響 醇類也是構(gòu)成葡萄酒香氣的基本化合物。在氨基酸或糖的作用下，通過(guò)Ehrlich 途徑由酵母代謝產(chǎn)生高級(jí)醇[31]。高級(jí)醇與有機(jī)酸反應(yīng)生成芳香的酯類，而過(guò)量可能會(huì)導(dǎo)致難聞的酒精味[32]。不同處理對(duì)馬瑟蘭干紅葡萄酒醇類物質(zhì)含量的影響差異顯著（P〈0.05），混合發(fā)酵的葡萄酒醇類含量高于對(duì)照組（P〈0.05）。祝霞等[33]研究發(fā)現(xiàn)，戴爾有孢圓酵母順序接種發(fā)酵可顯著增加醇類化合物含量，提高酒體的層次感。本試驗(yàn)結(jié)果表明SE 醇類化合物的含量最高，主要有正己醇、異戊醇、苯乙醇和異丁醇等物質(zhì)，其中異戊醇是高級(jí)醇中含量占比最高，達(dá)到2 969.75 μg/L，比含量最低的對(duì)照組高出989.25 μg，給葡萄酒帶來(lái)酒精味、溶劑味和指甲油的氣味[34]。苯乙醇賦予葡萄酒令人愉悅的果香，順序接種的苯乙醇含量顯著高于其它處理組（P〈0.05），苯乙醇含量的增加可能與戴爾有孢圓酵母中β-葡萄糖苷酶的活性有關(guān)，也有可能是酵母中β-葡萄糖苷酶與L-苯丙氨酸共同作用的結(jié)果[30]。C6 醇為葡萄酒提供了青草和植物味道，正己醇含量占C6 醇90%以上。正己醇在不同處理組差異顯著，順序接種的含量最高（603.71 μg/L），同時(shí)接種的含量最低（532.28 μg/L）。

2.3.3 混合發(fā)酵對(duì)脂肪酸類物質(zhì)含量的影響 脂肪酸是葡萄酒復(fù)雜性和水果香氣平衡的重要揮發(fā)性物質(zhì)，也是發(fā)酵過(guò)程中酵母和乳酸菌代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物。本試驗(yàn)中檢測(cè)到4 種酸類：乙酸、辛酸、癸酸和己酸，順序接種與對(duì)照組脂肪酸含量差異不大，同時(shí)接種含量最少，這與Azzolini 等[35]的報(bào)道一致，即戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵后，脂肪酸含量顯著降低。乙酸是發(fā)酵食品中特有的風(fēng)味化合物，具有刺鼻的醋酸味，其中同時(shí)接種的含量最高達(dá)到16.5 μg/L。各處理組中酸類含量均低于閾值，降低了不良風(fēng)味的影響。

2.4 主成分分析

不同接種方式香氣物質(zhì)的主成分分析如圖2所示。其中PC1 和PC2 分別占57.1%和29.3%，累計(jì)貢獻(xiàn)達(dá)到86.4%。根據(jù)不同接種方式，可以將其分為3 類。

圖2 香氣化合物主成分分析的因子載荷圖Fig.2 Factor load diagram of principal component analysis of aroma compounds

葡萄汁分布在PC1 負(fù)極和PC2 正極，棕櫚酸乙酯（Y13）、反式-2-己烯-1-醇（Y20）、1-辛烯-3-醇（Y30）和正己醛（Y37）在汁中含量較高。SE 分布在PC1 正極和PC2 的負(fù)極，與乙酸苯乙酯（Y3）、辛酸乙酯（Y5）、丁酸乙酯（Y8）、辛酸3-甲基丁酯（Y14）、正己醇（Y17）、苯乙醇（Y24）、異戊醇（Y25）、異丁醇（Y26）、D-香茅醇（Y27）、2，3-丁二醇（Y28）和己酸（Y34）等物質(zhì)的相關(guān)性強(qiáng)，主要是為葡萄酒貢獻(xiàn)比較濃郁的果香和花香。XR 和CO 分布在PC1 和PC2 的正極，同時(shí)接種葡萄酒中一些重要酯類如己酸乙酯（Y9）、十二酸乙酯（Y10）、丁酸香茅酯（Y15）和乙酸（Y31）的含量較高；而XR 中乙酸己酯（Y1）、乙酸庚酯（Y4）、（E）-3-己烯-1-醇（Y18）、3-己烯-1-醇（Y19）、1-壬醇（Y22）、1-癸醇（Y23）、1-辛醇（Y29）、癸酸（Y33）含量較高。以上表明不同接種方式發(fā)酵可以改變葡萄酒的香氣輪廓，提升葡萄酒香氣的復(fù)雜性。

2.5 混合發(fā)酵對(duì)馬瑟蘭干紅葡萄酒感官品質(zhì)的影響

馬瑟蘭干紅葡萄酒感官評(píng)價(jià)如圖3 所示。各處理澄清度、色澤和甜度無(wú)明顯差異，顏色主要呈帶紫色調(diào)的深寶石紅色。在口感方面，處理組酸度略低于對(duì)照組，CO 的得分略低于SE，說(shuō)明同時(shí)接種的降酸效果明顯。在香氣方面，SE 的香氣典型性略高于CO 和XR，表明順序接種方式能夠增加葡萄酒的典型性。XR 具有較強(qiáng)烈的氧化味，明顯高于SE 和CO。揮發(fā)性成分和理化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果與感官品評(píng)結(jié)果基本相符。在總體評(píng)價(jià)方面，SE風(fēng)味接受度略高于其它處理組，具有良好的口感和較為濃郁的果香。

圖3 馬瑟蘭干紅葡萄酒感官雷達(dá)圖Fig.3 Sensory radar of Marselan dry red wine

3 結(jié)論

本文主要研究戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母順序和同時(shí)接種對(duì)馬瑟蘭葡萄酒品質(zhì)的影響。3 個(gè)試驗(yàn)組的葡萄酒均能完成酒精發(fā)酵，殘?zhí)?、總酸、酒精度均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。戴爾有孢圓酵母混合發(fā)酵較對(duì)照組顯著降低了蘋(píng)果酸和酒石酸含量，增加了琥珀酸和檸檬酸含量。在香氣方面，戴爾有孢圓酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵顯著提高了馬瑟蘭葡萄酒中酯類和醇類含量。同時(shí)接種處理組的脂肪酸乙酯類含量最高，順序接種乙酸酯和醇類含量明顯高于其它處理組，尤其是乙酸異戊酯、正己醇、苯乙醇、異戊醇和異丁醇等物質(zhì)，賦予馬瑟蘭葡萄酒花果香味。感官評(píng)價(jià)表明順序發(fā)酵能夠增加葡萄酒香氣，改善葡萄酒口感。綜上所述，戴爾有孢圓酵母和釀酒酵母順序接種發(fā)酵能夠有效改善馬瑟蘭葡萄酒的風(fēng)味品質(zhì)，為其在馬瑟蘭葡萄酒生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)[1]。