香糟大黃魚的紅酒糟中優(yōu)勢菌生長動力學研究

張秀潔，郭全友，楊 絮，鄭 堯，鄭昇陽，李 丹

（1 寧德師范學院生命科學學院 福建寧德352100 2 中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所 上海200090 3 上海海洋大學食品學院 上海 201306）

大黃魚（Pseudoshian crocea）俗稱黃花魚、黃瓜魚等，2022 年全國養(yǎng)殖產(chǎn)量約25.8 萬t，其中福建省產(chǎn)量約為21.5 萬t，為我國東南沿海重要經(jīng)濟魚類[1-2]。發(fā)酵是使魚類產(chǎn)生特殊風味的一種重要的加工方式[3-4]。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，發(fā)酵的技術與方法不斷得到改進[5-6]。世界各地發(fā)酵魚類豐富多樣[7]，其中香糟大黃魚為福建省特色。以新鮮大黃魚和提前發(fā)酵完畢的紅酒糟為原料，經(jīng)密閉發(fā)酵后形成的一種醇香濃郁，風味獨特的發(fā)酵制品。

發(fā)酵過程中輔料的加入、原料本身攜帶和加工時進入的微生物等均可對發(fā)酵制品的菌系組成造成影響[8-9]。紅酒糟大黃魚傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝中以紅酒糟為原料，其中含有的微生物是發(fā)酵體系中微生物的主要來源。在不同發(fā)酵條件（NaCl、pH、Aw、溫度等）下，菌種經(jīng)短暫的停滯期后，以適當?shù)乃俣劝l(fā)揮良好的發(fā)酵性能[10]。劉璐等[11]從貴州黔東南地區(qū)具有飲食文化特色的魚醬酸中分離出多株具有產(chǎn)γ-氨基丁酸能力的乳酸菌，其中植物乳桿菌Y279 和Y64 具有較高的產(chǎn)GABA 能力，同時也顯現(xiàn)出良好的耐酸、耐膽鹽、生長速率及產(chǎn)酸速率快等發(fā)酵性能。Zeng 等[12]在傳統(tǒng)低鹽發(fā)酵酸魚中共分離并篩選得到5 株表現(xiàn)出較強的益生菌性狀和理化性質的酵母菌，通過評估對pH、溫度、鹽濃度的耐受性以及測定其蛋白水解、脂解活性，以此篩選性能較好的釀酒酵母菌株來制作發(fā)酵劑，提高傳統(tǒng)發(fā)酵酸魚質量。Khusro 等[13]在印度傳統(tǒng)發(fā)酵魚Ngari 中分離得到對病原體具有較強拮抗活性的腐生葡萄球菌，除具有高酸性耐受性外，該菌株表現(xiàn)出明顯的疏水性。梁慧等[14]從湖北傳統(tǒng)臘魚中分離篩選得到季也蒙畢赤酵母和近平滑假絲酵母，對它們進行耐鹽性、亞硝酸鹽耐受性、耐酸性等發(fā)酵適應性試驗，有望將其開發(fā)成為新型肉品發(fā)酵劑。

在實驗室前期研究的基礎上[15]，本研究以短乳桿菌和釀酒酵母為對象，研究其生長動力學等，以期為香糟大黃魚產(chǎn)業(yè)工業(yè)化生產(chǎn)及產(chǎn)品質量提高提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

在實驗室前期研究中，經(jīng)分離純化和BIOLOG 鑒定后，采用16S rDNA 測序確認釀酒酵母和短乳桿菌為紅酒糟中的優(yōu)勢菌，其比例分別為41.74%和55.28%[15]。新鮮大黃魚購自福建省寧德市某公司，層冰層魚方式放入泡沫箱，冷鏈運至上海，備用。

MRS 培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，北京陸橋技術股份有限公司；MRS Borth，北京索萊寶科技有限公司；YPD Borth，青島海博生物技術有限公司；微孔板，芬蘭Bioscreen 公司；氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；乳酸（食品級），鄭州高研生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Bioscreen C 全自動生長曲線分析儀，芬蘭Bioscreen 公司；ZHWY-200H 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NaCl 和pH 對乳酸菌生長的影響 根據(jù)發(fā)酵食品中菌株所需的耐受性，NaCl 質量分數(shù)梯度設置為2%，4%，6%，8%，用HCl 調節(jié)pH 值，pH值梯度設置為3，4，5，6，7，根據(jù)上述條件配制相應MRS 接種液，121 ℃滅菌15 min，即為無菌接種液。Bioscreen 微孔板中每孔加入180 μL 無菌接種液體，同時取約104CFU/mL 濃度的新鮮培養(yǎng)菌懸液20 μL 接種至微孔板中，每個梯度5 組平行，無菌MRS Borth 作為對照。將微孔板放入Bioscreen微生物生長測定儀中中速振蕩，每1 h 測定其OD600nm值，30 ℃共培養(yǎng)5 d。

1.3.2 NaCl、pH 和乳酸對酵母菌生長的影響 根據(jù)發(fā)酵食品中菌株所需的耐受性，NaCl 質量分數(shù)梯度設置為2%，4%，6%，8%，10%，用HCl 調節(jié)pH 值至3，4，5，6，7，乳酸質量分數(shù)梯度設置為1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%；根據(jù)上述條件配制相應YPD 接種液，121 ℃滅菌15 min，即為無菌接種液。取配制好的無菌接種液，Bioscreen 微孔板中每孔加入180 μL 無菌接種液體，同時取約104CFU/mL 濃度的新鮮培養(yǎng)菌懸液20 μL 接種至微孔板中，每個梯度5 組平行，無菌PDA Borth 作為對照。將微孔板放入Bioscreen 微生物生長測定儀中中速振蕩，每1 h 測定其OD600nm值，30 ℃共培養(yǎng)5 d。

1.3.3 菌株生長動力學建模與評價 模型構建：采用修正的Gompertz 模型進行數(shù)據(jù)擬合[16]，見式（1）。

式中，t——時 間（h）；Nt——t 時間對應的OD600nm值；Nmax——最大的OD600nm值；N0——初 始OD600nm值；μmax——最大比生長速率（h-1）；Lag——延滯期（h）。

模型評價：采用判定系數(shù)R2，均方誤差（RMSE），偏差因子（Bf）和準確因子（Af）[17]計算模型的擬合優(yōu)度，其中R2、Af和Bf值越接近于1，RMSE 越接近于0，表明預測效果越好，評價方程如下。

式中，yobs——實測值；ycal——預測值；n——實測值個數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 進行數(shù)據(jù)處理及計算，并采用Origin 9.0（美國OriginLab 公司）進行Gompertz模型擬合。

2 結果與分析

2.1 短乳桿菌生長動力學

短乳桿菌可產(chǎn)生具有拮抗或殺死致病菌的細菌素等物質[18]，并具有益生特性，常從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到并被用作發(fā)酵食品的發(fā)酵菌株或輔助發(fā)酵劑[19-20]。圖1 和圖2 分別為NaCl 和pH 對短乳桿菌生長的影響，表1、表2 分別為NaCl 和pH 對短乳桿菌生長動力學參數(shù)的影響?？梢姸倘闂U菌生長曲線呈“S”型持續(xù)增長趨勢，模型評價中R2均〉0.99，Af在1.000～1.100 之間，Bf在0.990～1.040 之間，RSME 在0.000～0.100 之間，生長模型擬合優(yōu)度良好。

表1 不同NaCl 條件下短乳桿菌生長動力學參數(shù)Table 1 Growth kinetic parameters of lactic acid bacteria under different NaCl conditions

表2 不同pH 值下短乳桿菌生長動力學參數(shù)Table 2 Growth kinetic parameters of lactic acid bacteria under different pH values

圖1 NaCl 對短乳桿菌生長的影響Fig.1 Effects of NaCl on the growth of Lactobacillus brevis

圖2 pH 對短乳桿菌生長的影響Fig.2 Effect of pH on the growth of Lactobacillus brevis

由圖1 及表1 可知，當NaCl 質量分數(shù)在2%～6%范圍內(nèi)時，短乳桿菌能夠生長；當增加至8%時，短乳桿菌在120 h 內(nèi)OD 值無顯著差異（OD值≤0.05），判定為不生長。30 ℃條件下，μmax隨NaCl 質量分數(shù)增大而減小，未添加NaCl 時，μmax為0.022 h-1，Lag 為12.3 h，當NaCl 質量分數(shù)增加至6%時，μmax降至0.008 h-1，Lag 增加至27.9 h，此時短乳桿菌雖然生長受到抑制，但其仍能生長。食鹽是加工過程中是必不可少的一種輔料，不僅對腐敗微生物具有抑制作用，并可促進發(fā)酵制品良好質構和滋味的形成[21]。根據(jù)該菌的耐鹽特性，在提倡減鹽理念的當下，可作為強化低鹽發(fā)酵魚制品的優(yōu)良菌種[22]。

由圖2 及表2 可知，當pH 值為3 時，此時μmax為0.003 h-1，Lag 為48.1 h；當pH 值增加至6時，此時μmax最大，Lag 最短，分別為0.019 h-1，11.7 h；當pH 值增加至7 時，μmax下降，Lag 增加，其Nmax達到最大值。以上表示pH 值在3～7 范圍內(nèi)，短乳桿菌均能生長，表現(xiàn)出良好的耐酸能力，當pH 值為6 時短乳桿菌生長速率最大，能更好的啟動發(fā)酵。

2.2 釀酒酵母生長動力學

釀酒酵母在發(fā)酵制品中對風味的形成具有重要作用[23]，也通常是發(fā)酵制品體系中的優(yōu)勢菌株[24]。圖3、圖4 和圖5 分別為NaCl、pH 和乳酸對釀酒酵母生長的影響，表3、表4、表5 分別為NaCl、pH 和乳酸對釀酒酵母生長動力學參數(shù)的影響。模型評價中R2均〉0.98，Af在1.000～1.100 之間，Bf在0.980～1.000 之間，RSME 在0.000～0.005 之間，表明生長模型擬合優(yōu)度良好。

表3 不同NaCl 條件下對釀酒酵母生長動力學的影響Table 3 Growth kinetic parameters of Saccharomyces cerevisiae under different NaCl conditions

表4 不同pH 值對釀酒酵母生長動力學的影響Table 4 Growth kinetic parameters of Saccharomyces cerevisiae under different pH values

表5 不同乳酸條件下對釀酒酵母生長動力學的影響Table 5 Growth kinetic parameters of Saccharomyces cerevisiae under different lactic acid conditions

圖3 NaCl 對釀酒酵母生長的影響Fig.3 Effects of NaCl on the growth of Saccharomyces cerevisiae

圖4 pH 對釀酒酵母生長的影響Fig.4 Effects of pH on the growth of Saccharomyces cerevisiae

圖5 乳酸對釀酒酵母生長的影響Fig.5 Effect of lactic acid on the growth of Saccharomyces cerevisiae

由圖3 可知，在NaCl 質量分數(shù)2%～10%范圍內(nèi)，釀酒酵母均能生長，隨著NaCl 質量分數(shù)的增大，生長逐漸受到抑制。當NaCl 質量分數(shù)為6%時，μmax為0.024 h-1，Lag 為27.5 h，在10%NaCl 質量分數(shù)下經(jīng)過延滯期之后仍能生長，即釀酒酵母表現(xiàn)出良好的食鹽耐受性。酵母菌通常與乳酸菌協(xié)同發(fā)酵，故酵母菌需能夠適應酸性環(huán)境并有較好的狀態(tài)使發(fā)酵持續(xù)進行[8]。由圖4 可知，釀酒酵母對酸堿度不敏感，pH 值在3～7 范圍內(nèi)，釀酒酵母生長狀況良好；除pH 值為3 時，其μmax和Lag均無顯著差異（P〈0.05）；當pH 值為6 時，其μmax值與pH 值為7 時相近，然而其Lag 值略小于pH值為7 時的Lag 值；pH 值為7 時，其有最大Nmax值，表明釀酒酵母生長速率優(yōu)于中性條件，在酸性條件下遲滯期小于中性條件，此釀酒酵母具有嗜酸的特點。由圖5 可知，在乳酸質量分數(shù)在1%～6%范圍內(nèi)，隨著乳酸添加量的增加，釀酒酵母的生長逐漸受到抑制。當乳酸質量分數(shù)為1%時，此時μmax為0.088 h-1，Lag 為6.8 h，相比未添加乳酸條件下的釀酒酵母的生長，μmax增大，Lag 降低；在乳酸質量分數(shù)由1%～4%范圍內(nèi)時，釀酒酵母生長受到明顯抑制。乳酸質量分數(shù)為7%時，120 h 內(nèi)OD 值無顯著差異（OD 值≤0.05），判定為不生長。Zeng 等[12]對釀酒酵母的耐受性測試中，設定乳酸質量分數(shù)為0.6%～1.2%。在本研究中當乳酸質量分數(shù)增大至4%時，對釀酒酵母才有明顯的抑制作用，在經(jīng)過延滯期后釀酒酵母仍能正常生長。在乳酸質量分數(shù)為1%條件下，表現(xiàn)出對釀酒酵母生長的促進作用，此時有最大的生長速率和最短的延滯期，已有學者研究表明乳酸菌和酵母菌之間存在互作關系，上清液能促進或者抑制彼此生長[25-27]，關于在本研究中分離自紅酒糟的釀酒酵母與短乳桿菌混合培養(yǎng)體系中兩者的相互作用還需進一步研究。

3 結論

本文以源自福建特產(chǎn)糟制大黃魚發(fā)酵原料紅酒糟中的優(yōu)勢菌短乳桿菌和釀酒酵母為研究對象，測定不同環(huán)境因子下優(yōu)勢菌株生長曲線，分析對兩株菌動力學參數(shù)的影響，并使用Gompertz 模型評估優(yōu)勢菌株耐受性。結果表明：在模型評價中，生長模型擬合優(yōu)度良好。短乳桿菌具有6%（質量分數(shù)）NaCl 的耐受性，在減鹽的趨勢下，短乳桿菌滿足對食鹽耐受性的要求；此外短乳桿菌具有良好的耐酸能力，在pH 值為6 時，生長速率最高，能更好的啟動發(fā)酵。在對釀酒酵母生長特性分析中發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母對各環(huán)境因子均具有較強的耐受性，具體表現(xiàn)為在10%（質量分數(shù)）NaCl 條件下，雖經(jīng)過了較長的延滯期，但其仍能夠生長，在1%～6%（質量分數(shù)）NaCl 條件下生長良好；釀酒酵母在pH 3～7 條件下，各梯度生長無明顯差別，具有較短的延滯期，故在發(fā)酵中能夠不受體系pH值的影響，更好的啟動發(fā)酵；在不同質量分數(shù)乳酸條件下，低濃度乳酸條件下生長無較大差異，在質量分數(shù)6%條件下才有較明顯的抑制作用，對不同環(huán)境因子下的短乳桿菌和釀酒酵母生長動力學的影響，可為實際生產(chǎn)提供參考。