抗氧化肽在真空冷凍干燥過程中對乳雙歧桿菌Probio-M8 的保護作用

王昊乾，張靜雯，楊雄洲，劉青軒，姚國強，孫天松

（內蒙古農業(yè)大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室 農業(yè)農村部奶制品加工重點實驗室 呼和浩特 010018）

雙歧桿菌已廣泛應用于乳制品、發(fā)酵和制藥等行業(yè)，其作為輔助培養(yǎng)物需在保質期內保持較高的生物活性[1]。干燥脫水能夠確保產品的貯藏穩(wěn)定性，其中真空冷凍干燥是保存雙歧桿菌最為常用的方法[2]。然而，由于雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，對氧極為敏感，在加工過程中，氧氣可以通過多種方式進入產品并發(fā)生氧化應激反應，是導致雙歧桿菌活力喪失的主要因素[3-4]。

目前，有關乳酸菌在真空冷凍干燥過程中的研究以優(yōu)化凍干參數(shù)以及開發(fā)新型的凍干保護劑為主要研究方向[5-7]，而氧化應激對乳酸菌在冷凍干燥過程中的影響鮮有報道。目前，有研究發(fā)現(xiàn)低溫冷凍伴隨著蛋白變性和脂質氧化的產生，并且氧化應激反應的發(fā)生不受樣品處于玻璃態(tài)時具有較低的分子遷移率的限制[8]。雙歧桿菌在真空冷凍干燥的預凍過程中，極易受到氧化應激導致的細胞膜脂質氧化[9-10]，生成丙二醛等氧化產物，并降低細胞膜流動性，導致細胞膜通透性增加，細胞內容物泄漏，最終致雙歧桿菌死亡[11-12]。本試驗以乳雙歧桿菌Probio-M8 為研究對象，以乳清蛋白水解物分離純化的前期試驗中獲得的水解多肽3-2（HP3-2）為天然抗氧化型保護劑，研究其在真空冷凍干燥過程中對菌體的保護作用，為乳酸菌冷凍干燥保藏技術提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳雙歧桿菌Probio-M8，由內蒙古自治區(qū)農業(yè)微生物種質資源庫提供；Syto9、碘化丙啶（PI）、丙酮（色譜純）、甲醇（色譜純）、正己烷（色譜純），賽默飛世爾公司；2，7-二氯熒光素二乙酸酯（DCFHDA）熒光染料、2'，7'-二-（2-羧乙基）-5（6）-羧基熒光素乙酰甲酯（BCECF-AM）、6-十二?；?N，N-二甲基-2-萘胺（Laurdan），大連美倫生物技術有限公司；丙二醛試劑盒，南京建成有限公司。

1.2 儀器與設備

M2 多功能酶標儀，美國美谷分子公司；DRC-1000 真空冷凍干燥機，日本東京理化公司；CytoFLEX 流式細胞儀，美國貝克曼庫爾特公司；pH 計（FE28），梅特勒-托利多儀器上海有限公司；7890B-5977A 氣相色譜-質譜聯(lián)用儀（GC-MS），美國安捷倫公司；平行生物反應器，上海顧信生物科技有限公司；M900 生化分析儀，深圳希爾曼科技有限公司；HWS28 型水浴鍋，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化與培養(yǎng) 將保存于凍存管（-80℃保藏）中的乳雙歧桿菌Probio-M8 于MRS（加入0.05%的L-半胱氨酸鹽酸鹽）培養(yǎng)基中活化，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，然后重復上述步驟再活化2 代后獲得種子液，以5%的接種量接種于3 L 平行生物反應器中，培養(yǎng)溫度通過自動控制系統(tǒng)保持在（37±0.2）℃，氮氣保壓（0.02 Pa），轉速200 r/min，通過自動流加25%的氨水使pH 值維持在5.9。

1.3.2 菌種的凍干前處理及抗氧化肽的制備 本試驗中使用的抗氧化肽HP3-2 為之前試驗所獲得的產物，其氨基酸序列為AGPPGPTGPAGP PGFPGAV、GETGPAGPPGAPGAPGAPGPVGPAG、GKDGLNGLPGPIGPPGPRG、GPSGPQGPSGPPGPK、TGAAGPPGPTGPAGPPGFPGAVGA，分子質量在1 500～2 000 u，具體分離純化方法如下：使用堿性蛋白酶于pH 10.0，50 ℃水解乳清蛋白（酶底比為5%），水解2 h 后，滅酶，于4 000×g，離心15 min，將所獲得的乳清蛋白水解物上清液進行超濾分離，獲得小于3 ku 的樣品，經陽離子交換層析以及高效液相色譜分離純化后，將獲得的水解多肽3-2 作為凍干保護劑，以乳清蛋白作為對照組。

將發(fā)酵后的乳雙歧桿菌Probio-M8 發(fā)酵液于4 000×g，4 ℃，離心10 min，收集菌體，重懸于滅菌后的PBS（pH 7.4）中，清洗2 次后，將菌體和保護劑按照1∶1.5 的質量比相混合，以保護劑中只加入10%海藻糖作為空白對照組，含有不同濃度的HP3-2 作為試驗組，含有5.0 mg/mL 乳清蛋白作為對照組（表1）。真空凍干過程：于-80 ℃預凍6 h后，進行真空冷凍干燥，真空冷凍干燥條件：真空度15 Pa，樣品溫度由-40 ℃升溫至30 ℃，冷阱溫度保持在-45 ℃，工作時間為36 h。

表1 不同組分的保護劑組成及含量Table 1 The composition of the different components of lyoprotectant

1.3.3 活菌數(shù)測定 真空冷凍干燥后樣品的細胞存活率測定按照王淑敏等[13]描述的方法并適當修改。取1 g 凍干樣品，與9 mL 的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）混勻，于搖床振蕩20 min 后進行梯度稀釋，傾注于MRS 固體培養(yǎng)基中（加入0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽），于37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。

1.3.4 細胞膜脂肪酸的提取與測定 根據(jù)Wei等[14]描述的方法并稍作修改；將凍干后的菌體復溶于PBS 緩沖液中，于4 000×g，15 min 離心，洗滌2 次后，稱取0.5 g 菌體，加入1.9 mL 氯仿-甲醇（1∶2，V/V）混合溶液，振蕩15 min，再加入0.625 mL的氯仿以及0.625 mL 去離子水，旋渦振蕩15 min，于4 000 r/min，15 min 離心，吸取下層有機相，用氮氣吹干；加入1 mL 甲醇鈉-甲醇溶液，放于冰中1 min，振蕩5 min，再加入600 μL 正己烷萃取脂肪酸，振蕩5 min，于4 000×g，5 min 離心，取上層相，置于GC-MS 上樣瓶中，通過GC-MS分析。

脂肪酸含量測定采用GC/MS 法。色譜柱：HP-5 毛細管填充柱（30 m×0.22 mm 柱內徑，0.25 μm膜厚，Restek）；載氣（He）流速29.6 mL/min；總流量1 mL/min；柱壓63.4 kPa；進樣口溫度260 ℃；檢測器溫度280 ℃；色譜柱溫升溫程序：起始溫度100℃，保持1 min，隨后以4 ℃/min 速率增至250 ℃，并在250 ℃保持5 min，進樣量：1 μL。

質譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度200 ℃；激活電壓1.5 V；質量掃描范圍35～500 m/z。計算脂肪酸各峰的峰面積、保留時間，結果與37 種脂肪酸標樣進行對比。

1.3.5 細胞內活性氧測定 使用DCFH-DA 分析檢測細胞內活性氧的產生和積累[15]。將菌體用PBS緩沖液清洗2 次，4 000×g，離心5 min，然后重新懸浮在PBS 緩沖液中，加入DCFH-DA 至終濃度為10 μmol/L，37 ℃避光孵 育50 min，以未用DCFH-DA 處理的細胞作為對照，通過流式細胞儀檢測細胞的熒光強度（488 nm 激發(fā)波長）。

1.3.6 胞內外pH 測定 將菌體復溶于無菌蒸餾水中，使用pH 計測定細胞外pH 值。

使用BECEF-DA 分析檢測細胞內pH 變化情況[16]。將菌體用PBS 緩沖液清洗2 次，4 000×g，離心5 min，然后重新懸浮在PBS 緩沖液中，加入BECEF-DA 至終濃度為1 μmol/L，37 ℃避光孵育30 min，以未用BECEF-DA 處理的細胞作為對照，通過流式細胞儀檢測細胞的熒光強度（488 nm 激發(fā)波長）。

將菌體 懸浮在pH 值 為6.2，6.5，6.8，7.2 的PBS 緩沖液中，加入終濃度為1 μmol/L 的尼日利亞菌素和BECEF-DA，37 ℃避光孵育30 min，構建胞內pH 標準曲線。

1.3.7 細胞膜流動性測定 使用Li 等[17]描述的方法對細胞膜流動性進行測定。將凍干菌粉復溶后，用PBS 緩沖液清洗菌體2 次，4 000×g 離心5 min，重懸在PBS 緩沖液中，加入Laurdan 至終濃度為10 μmol/L，30 ℃避光孵育30 min，以未用熒光染料處理的細胞作為對照，測定熒光強度，廣義熒光偏振（GP）測定樣品的細胞膜流動性。

式中，I440nm——在440 nm 波長處的熒光強度；I490nm——在490 nm 波長處的熒光強度。

1.3.8 細胞外Na+濃度測定 將凍干后的乳雙歧桿菌Probio-M8 復溶于PBS 緩沖液中，并與16 g/L 的氯化鈉溶液按等體積比混合，在4 000×g，4 ℃離心5 min，取上清液于1.5 mL 的EP 管中，使用生化分析儀進行測定，樣品溶液上機測試得到的結果×2 即為樣品中實際的Na+離子濃度。

1.3.9 細胞膜電位測定 使用流式細胞術對真空冷凍干燥后的乳雙歧桿菌Probio-M8 的細胞膜電位進行測定，將真空冷凍干燥后的菌粉復溶于PBS 緩沖液中，旋渦振蕩混勻后，4 000×g，4 ℃離心5 min，使用PBS 清洗2 次后，重懸，再用PBS連續(xù)稀釋，使樣品的活菌數(shù)在1×106CFU/mL 左右，加入DiBAC4（3）熒光染料，樣品中的最終濃度為1 μmol/L，于37 ℃避光孵育30 min 后，使用流式細胞儀檢測樣品的熒光強度[18]。

膜電位標準曲線：將凍干后的樣品復溶于不同濃度的鉀離子溶液（140，70，35，14，7，3.5 mmol/L）中，并加入終濃度為1 μmol/L 的纈氨霉素和尼日利亞菌素，并加入2 μmol/L 的DiBAC4（3）熒光染料，于37 ℃避光孵育30 min，上機測定并繪制標準曲線；另外，2%預冷甲醛于4 ℃固定菌體60 min 后，作為去極化樣品，剩余的熒光染色步驟與樣品相同。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)每組3 個平行，使用GraphPad Prism 9.0 和Origin 2021 對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析，P〈0.05 為顯著，同時完成相關圖形的繪制。

2 結果與分析

2.1 凍干后活菌數(shù)

雙歧桿菌作為革蘭氏陽性厭氧菌，由于自身缺乏過氧化氫酶、過氧化物酶等氧化還原酶，在有氧條件下極容易受到ROS 的攻擊，導致核酸、蛋白質等生物大分子造成不可逆的損傷，對雙歧桿菌的生長代謝造成影響[19-20]。經過真空冷凍干燥后乳雙歧桿菌Probio-M8 的菌種存活率如圖1 所示，隨著HP3-2 質量濃度的升高，乳雙歧桿菌Probio-M8 的菌種存活率呈顯著上升趨勢（P〈0.05），含有5 mg/mL 的HP3-2 試驗組菌種存活率為（80.40±3.34）%，顯著高于WP 組（64.69±2.47）%和T 組（72.65±1.98）%（P〈0.05）。結果說明，高溫滅菌后的WP 會降低乳雙歧桿菌Probio-M8 的菌種存活率，含有抗氧化活性的HP3-2 試驗組（5 mg/mL）能夠在真空冷凍干燥過程中，對細胞起到更好的保護作用，并提高菌體的凍干存活率。已有研究表明，乳清蛋白水解物中含有較多疏水性氨基酸的多肽，能夠與細胞膜上的脂質相結合，通過清除氧自由基，抑制細胞膜的脂質氧化，達到對細胞的保護作用[21-23]。

圖1 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干存活率變化Fig.1 Change in the survival rate of Probio-M8 after freeze-drying

2.2 細胞內外pH 變化

pH 變化是評估應激反應的重要參數(shù)[24]。乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后細胞外pH 如圖2a 所示，含有5.0 mg/mL 的HP3-2 試驗組 的pH 值（4.99±0.00）最低，顯著低于WP 組（5.14±0.00）和T 組（5.24±0.00），P〈0.05；使用流式細胞術對乳雙歧桿菌Probio-M8 的胞內pH 值進行測定（圖2b），含有2.5 mg/mL 和5.0 mg/mL 的HP3-2 試驗組胞內pH 值（5.82±0.06 和5.89±0.03）顯著高于WP 組（5.74±0.01）和T 組（5.50±0.01），P〈0.05；含有不同質量濃度HP3-2 的細胞內、外pH 差值顯著高于WP 組和T 組（表2）。為了維持胞內蛋白酶的活力，細胞內pH 一般呈中性，而細胞在真空冷凍干燥過程中不斷脫水，并伴隨胞內溶質的濃縮，使胞內pH 值下降，同時，氧化應激導致細胞膜發(fā)生脂質氧化，導致細胞受損；當細胞復水后，不含有抗氧化活性的WP 組和T 組中，由于氧化應激導致細胞膜受損，使細胞內溶質流出，從而使細胞膜質子梯度遭到破壞，使細胞內pH 與環(huán)境pH 更為接近，而含有抗氧化肽HP3-2 的試驗組能夠通過降低氧化應激對細胞膜的損傷，防止細胞內容物的泄漏并維持細胞膜質子梯度，達到對乳雙歧桿菌Probio-M8 的保護作用。已有研究表明，具有完整的細胞膜能結構是維持細胞質子梯度的關鍵因素[25]，另外，氧化應激的產生與pH 的變化密切相關[26]。

圖2 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后細胞外pH（a）和細胞內pH（b）變化Fig.2 Extracellular（a）and intracellular（b）pH changes of Probio-M8 after freeze-drying

表2 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后細胞內、外pH 差值Table 2 Change in pH difference between inside and outside cells after freeze-drying of Probio-M8

2.3 脂肪酸含量及細胞膜流動性變化

細菌的脂肪酸一般由含有12～22 個碳的飽和脂肪酸（SFA）及不飽和脂肪酸（UFA）組成，其中以含有16～18 個碳的脂肪酸占總脂肪酸的60%以上[27]。真空冷凍干燥后，乳雙歧桿菌Probio-M8 的細胞膜脂肪酸主要由肉豆蔻酸（C14∶0）、十五烷酸（C15∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚烯酸（C16∶1）、十七烷酸（C17∶0）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1n9c）、亞麻酸（C18 ∶2n6t）、花生酸（C20 ∶0）和γ-亞麻酸（C18∶3n6）10 個脂肪酸組成（表3），其中油酸、棕櫚烯酸和亞麻酸為不飽和脂肪酸（UFA）。含有5.0 mg/mL HP3-2 試驗組的相對UFA 含量（51.49±1.26）顯著高于WP 組（39.96±1.57）和T 組（33.33±0.62），P〈0.05。結果表明，抗氧化肽HP3-2 能夠降低氧化應激造成的細胞膜損傷，使細胞膜維持較高的不飽和脂肪酸含量，并且HP3-2 對細胞膜具有更好的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)，Niranjan 等[28]發(fā)現(xiàn)肽的N 端為疏水性氨基酸時，能夠與生物膜中脂肪酸相互作用，通過捕捉自由基減少鏈式反應的發(fā)生；另外，乳酸菌細胞膜中含有較高不飽和脂肪酸比例，能夠在冷凍干燥過程中維持較高細胞膜完整性，減少細胞損傷[29]；Zhang 等[30]研究發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽能夠在真空冷凍干燥過程中保護舊金山乳桿菌中不飽和脂肪酸，并提高菌體的凍干存活率。

表3 真空冷凍干燥后乳雙歧桿菌Probio-M8 細胞膜脂肪酸組成（%）Table 3 Fatty acid composition of the cell membrane for Probio-M8 after freeze-drying（%）

流動性是細胞膜的重要特性之一，主要取決于溫度和細胞膜脂肪酸組成[31]；細胞膜流動性有助于細胞感知外界環(huán)境的變化（溫度、pH 和滲透壓等），使細胞通過基因的表達，適應外界環(huán)境的改變[32]。真空冷凍干燥后，乳雙歧桿菌Probio-M8的細胞膜流動性如圖3 所示，圖中縱坐標廣義熒光偏振所測得的結果（GP 值）與細胞膜流動性成反比。隨著HP3-2 濃度的升高，含有HP3-2 樣品的GP 值呈下降趨勢，并且含有5.0 mg/mL HP3-2試驗組的GP 值（0.086±0.002）顯著低于WP 組（0.092±0.002）和T 組（0.092±0.001），P〈0.05。結果表明，抗氧化肽HP3-2 能夠在真空冷凍干燥過程中降低氧化應激對細胞造成的損傷，使細胞膜中具有較高的不飽和脂肪酸含量，并維持較高的細胞膜流動性，從而達到對乳雙歧桿菌Probio-M8的保護作用。Marielle 等[33]發(fā)現(xiàn)增加細胞膜脂肪酸中UFA/SFA 的比例，能夠提高細胞膜的流動性；另外，在干燥和貯藏過程中，氧化反應會損傷細胞膜的物理結構并改變脂質組成，導致細胞膜流動性降低并影響細胞功能[34]。Li 等[17]發(fā)現(xiàn)提高細胞膜流動性和細胞膜完整性，能夠提高乳酸菌在真空冷凍干燥過程中的菌種存活率。

圖3 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后細胞膜流動性Fig.3 Cell membrane fluidity of Probio-M8 after freeze-drying

2.4 細胞內活性氧及丙二醛含量

活性氧在細胞代謝以及應激反應過程中具有重要意義[35]。氧敏感的乳酸菌在干燥及貯藏過程中發(fā)生氧化應激反應，造成蛋白質、DNA 和脂質發(fā)生不可逆的損傷，是導致細胞死亡的主要原因[36]。氧化應激與褐變反應在冷凍干燥與貯藏期間使細胞發(fā)生蛋白羰基化和脂質氧化[37]，其中，脂質過氧化物和氫過氧化物加速分解生成醇、醛等多種氧化產物，其中，丙二醛是最為常見的氧化產物[38]。使用流式細胞術對細胞內活性氧含量進測定（圖4），試驗組和對照組中胞內活性氧的熒光強度分別為T 組/WP 組〉2.5 mg/mL 的HP3-2 組〉5 mg/mL 的HP3-2 組，并且HP3-2 試驗組中胞內活性氧的熒光強度隨著HP3-2 濃度的升高而降低；使用丙二醛檢測試劑盒對真空冷凍干燥過程中乳雙歧桿菌Probio-M8 受到氧化應激所產生的氧化產物丙二醛含量進行測定（圖5）2.5 mg/mL 和5 mg/mL 的HP3-2 試驗組丙二醛含量分別為（2.23±0.06）nmol/mL 和（2.14±0.06）nmol/mL，丙二醛濃度隨著HP3-2 濃度的升高而降低，另外，5 mg/mL 的HP3-2 試驗組的丙二醛含量顯著低于WP 組（2.30±0.05）nmol/mL 和T 組（2.33±0.05）nmol/mL，P〈0.05。結果表明，抗氧化肽HP3-2 在真空冷凍干燥過程中，能夠降低細胞內活性氧的含量，防止氧自由基對細胞膜中不飽和脂肪酸的氧化，降低氧化產物丙二醛的含量。已有研究表明，脂質氧化是細胞脫水過程中氧化應激導致細胞損傷的重要因素[39]；抗氧化肽能夠提供還原氫或給自由基一個配對的電子，使活性氧失去氧化活性[40]，因此，由于抗氧化肽HP3-2 含有甘氨酸和脯氨酸等疏水性氨基酸，能夠通過捕獲活性氧分子降低細胞膜脂肪酸氧化，并減少丙二醛含量，提高乳雙歧桿菌Probio-M8 的菌種存活率。

圖4 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后胞內活性氧含量變化Fig.4 Changes in intracellular reactive oxygen species content of Probio-M8 after freeze-drying

圖5 乳雙歧桿菌Probio-M8 凍干后丙二醛含量變化Fig.5 Changes in malondialdehyde content of Probio-M8 after freeze-drying

2.5 細胞膜電位及Na+濃度變化

細胞處于靜息狀態(tài)時，細胞膜具有100 mV 的跨膜電位，并且細胞膜內、外Na+離子濃度處于“外高內低”的狀態(tài)[41]；當細胞受到外界環(huán)境刺激后，通過控制離子通道改變細胞膜內、外的Na+濃度梯度，使細胞膜電位發(fā)生改變，從而影響細胞正常的生理代謝過程[42]。乳雙歧桿菌Probio-M8 經真空冷凍干燥復水后，細胞胞外Na+濃度變化如圖6a 所示，添加2.5 mg/mL 和5 mg/mL 的HP3-2 試驗組中，胞外Na+濃度為（5.67±0.64）mmol/L 和（62.45±0.49）mmol/L，顯著高于WP 組（52.01±0.54）mmol/L 和T 組（51.70±0.43）mmol/L，P〈0.05；使用流式細胞術檢測乳雙歧桿菌Probio-M8 的細胞膜電位變化（圖6b），含有2.5 mg/mL 和5 mg/mL的HP3-2 試驗組中細胞膜電位為（-10.95±0.75）mV 和（-13.10±0.86）mV，顯著低于WP 組（-9.93±0.50）mV 和T 組（-9.35±1.23）mV，P〈0.05。結果說明，真空冷凍干燥過程會造成乳雙歧桿菌Probio-M8 細胞損傷，使細胞外Na+濃度和細胞膜電位發(fā)生改變，抗氧化肽HP3-2 能夠保護細胞膜結構穩(wěn)定，降低氧化應激對Na+濃度和細胞膜電位的影響，維持細胞正常的生理代謝。

圖6 Na+濃度（a）和細胞膜電位（b）變化Fig.6 Changes in Na+ ion concentration（a）and cell embrane potential（b）

3 結論

真空冷凍干燥過程中產生的氧化應激會對雙歧桿菌細胞膜結構及生物活性產生影響，抗氧化肽HP3-2 中主要含有較多的疏水性氨基酸，能夠與細胞膜中的脂質相結合，通過清除氧自由基，降低氧化產物丙二醛的含量，使細胞膜具有較高的不飽和脂肪酸含量和細胞膜流動性，維持細胞膜完整，并使細胞膜內、外的質子梯度、細胞膜電位和Na+濃度保持平衡，在真空冷凍干燥過程中起到對乳雙歧桿菌Probio-M8 的保護作用；通過本研究結果，能夠為天然抗氧化型保護劑的開發(fā)提供理論基礎，為雙歧桿菌發(fā)酵劑的工業(yè)化生產提供技術支持。