禁牧對內(nèi)蒙古克氏針茅草原表層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

張曉馥, 白 雪, 張起迪, 李淑芬, 韓 冰,2,3, 趙鴻彬,2,3*

(1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010; 2. 麥類種質(zhì)創(chuàng)新利用自治區(qū)高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010; 3. 內(nèi)蒙古自治區(qū)生物制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

中國草原面積占國土面積的40.9%,其中,內(nèi)蒙古草原是歐亞草原和中國天然草原的重要組成部分[1]。草原土壤中存在著種類豐富的微生物群落,是草原生態(tài)系統(tǒng)不可或缺的部分,通過其自身代謝活動參與調(diào)節(jié)土壤碳、氮和磷等元素的地球化學(xué)循環(huán)和有機(jī)物降解過程[2]。微生物作為單細(xì)胞生物,對環(huán)境的細(xì)微變化高度敏感,其中氣象條件、土壤理化性質(zhì)和植被特征均可影響土壤微生物的活性、群落構(gòu)成和代謝活動[3]。土壤微生物中細(xì)菌數(shù)量最多、分布最廣[4],直接參與有機(jī)物的分解等過程,促進(jìn)土壤養(yǎng)分的循環(huán)和轉(zhuǎn)化,進(jìn)而維持草原生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和健康。因此,細(xì)菌多樣性可以作為評價(jià)土壤質(zhì)量和生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)價(jià)值的重要指標(biāo)[5-6]。

在草原生態(tài)系統(tǒng)中,氣候變化和過度放牧可導(dǎo)致土壤微生物豐度和多樣性變化,影響土壤養(yǎng)分的循環(huán)和轉(zhuǎn)化[7-8]。圍封禁牧可促進(jìn)草原植被恢復(fù)和生物多樣性的提高,從而增加草原生產(chǎn)能力和穩(wěn)定性[9-10],是草地生態(tài)管理調(diào)控的重要手段之一[11]。長期禁牧可改變土壤細(xì)菌的組成,顯著增加植被地上生物量、凋落物量、土壤養(yǎng)分,降低植被多樣性[12];而短期禁牧能夠改變細(xì)菌共生模式、改善草原土壤肥力、植物豐度和多樣性[13-14],對土壤細(xì)菌多樣性表現(xiàn)出一定的負(fù)面影響[15]。此外,在草原生態(tài)系統(tǒng)中,表層土壤是土壤中營養(yǎng)最豐富的一層,植物根系、凋落物及分泌物較多,有著很密集的微生物共存網(wǎng)絡(luò),而且微生物多樣性、土壤酶活性和養(yǎng)分水平高于深層土壤[16-18]。長期禁牧對表層土壤細(xì)菌豐度、多樣性、土壤微生物量有著積極的影響。細(xì)菌群落的演替率在表層土壤最高[19],但短期禁牧對表層土壤微生物的影響研究較少,研究禁牧對微生物的影響,可以為草地資源的合理利用提供有用信息。

目前,現(xiàn)有研究主要集中在長期禁牧條件下微生物群落結(jié)構(gòu)變化,而短期禁牧對微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響的研究較少。但是,研究短期禁牧對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響有助于了解禁牧對草原生態(tài)系統(tǒng)的影響,為管理和保護(hù)草原提供理論依據(jù)。本研究以內(nèi)蒙古克氏針茅草原為研究對象,旨在研究草原自然放牧草地轉(zhuǎn)變?yōu)榻敛莸爻跗诒韺蛹?xì)菌群落的變化,為繼續(xù)深入研究禁牧后表層土壤細(xì)菌群落變化提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)域概況及樣品采集

試驗(yàn)樣地位于錫林郭勒正鑲白旗的克氏針茅草原,屬典型草原,地理位置42°9′14″N,115°14′39″E,海拔高度1 343 m,年均氣溫1.9℃,多年平均降水量310 mm,屬中溫帶半干旱大陸性氣候。土壤類型偏淡栗鈣土,優(yōu)勢物種主要為克氏針茅(StipakryloviiRosh)、羊草(Leymuschinensis(Trin.)Tzvel.)、冷蒿(ArtemisiafrigidaWilld.)等[20]。

本試驗(yàn)于2018年在自然放牧草地上分別設(shè)置放牧和禁牧2個30 m × 30 m試驗(yàn)樣地,在放牧樣地內(nèi)按照每年2.72 羊單位·公頃-1的放牧強(qiáng)度進(jìn)行放牧,時長5個月(6—10月),禁牧樣地利用圍欄禁牧,兩個樣地內(nèi)部分別設(shè)置了3個大小為6 m×6 m的樣區(qū),樣區(qū)之間間隔12 m。試驗(yàn)期間(2018—2020年),每年采集5次土壤樣品(6—10月的月初)。采樣時,使用直徑為8 cm的土鉆在每個樣區(qū)采集3個("S"字形)深度為0～10 cm的土壤樣品。采集的土壤樣品去除石塊、動植物殘?bào)w等雜質(zhì),使用2 mm篩子進(jìn)行過濾處理。每份土樣分為2份,一份置于5 ml無菌凍存管中,放入液氮中進(jìn)行速凍,并于-80℃保存,用于后續(xù)微生物群落總DNA的抽提;另份土壤樣本保存于-20℃,用于后續(xù)土壤的理化性質(zhì)的測定。本文僅針對禁牧區(qū)分析放牧向禁牧轉(zhuǎn)變初期細(xì)菌的變化。

1.2 土壤理化性質(zhì)的測定

測試前將儲存于-20℃的土壤樣品取出,并置于通風(fēng)處風(fēng)干,再過直徑1 mm的篩子。使用ST300 型pH計(jì)(美國OHAUS)按土水比1∶2.5測定土壤pH值;使用重鉻酸鉀外加熱滴定法測定有機(jī)質(zhì)含量(Soil organic matter,SOM/g·kg-1)。土壤溫度(Soil temperature,ST/℃)、土壤體積含水量(Volumetric water content,VWC)由試驗(yàn)區(qū)內(nèi)設(shè)立的CR1000X數(shù)據(jù)采集器和CS655(Campbell Scientific Inc.,Logo,UT,USA)傳感器每日零點(diǎn)監(jiān)測和記錄數(shù)據(jù)。

1.3 DNA提取、擴(kuò)增與測序

每個土壤樣本中取0.5 g,用MagPure Soil DNA LQ Kit (Magan) 試劑盒進(jìn)行微生物群落總DNA抽提,后用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific,USA)和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度;使用343F(5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)、798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)對細(xì)菌V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增程序如下:95℃預(yù)變性 3 min,30 個循環(huán)(95℃-60 s,55℃-60 s,72℃-60 s),然后 72℃延伸 10 min,在4℃進(jìn)行保存。PCR反應(yīng)體系為:基因組DNA 40-60 ng,上下游引物(10 μM) 1.5 μL,PCR buffer 15 μL,dNTP(10 mmol·L-1) 1 μL,Q5高保真DNA聚合酶 0.2 μL,High GC Enhancer 10 μL,ddH2O補(bǔ)足至50 μL,每個樣本3個重復(fù)。

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物,進(jìn)行回收產(chǎn)物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用超微量核酸定量儀對回收產(chǎn)物進(jìn)行檢測定量。通過Illumina MiSeq 2500 平臺(Illumina Int.,San Diego,CA,USA)測序生成原始雙端序列,對序列進(jìn)行質(zhì)控、拼接、剔除嵌合體、根據(jù)97%的相似度進(jìn)行OTU(Operational taxonomic units),即操作分類單元聚類,并比對Silva數(shù)據(jù)庫,對每條序列進(jìn)行物種分類注釋。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在本試驗(yàn)中OTU數(shù)代表細(xì)菌豐度,Shannon指數(shù)代表細(xì)菌多樣性。試驗(yàn)測定的土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌α多樣性用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析,差異顯著性為95%的置信區(qū)間,探討放牧向禁牧轉(zhuǎn)變初期對土壤理化性質(zhì)及細(xì)菌群落影響及其顯著性,其中Chao1、Observed_species、Shannon、Simpson指數(shù)作為細(xì)菌α多樣性的指標(biāo);通過R包vegan分析繪制β多樣性的PCoA圖,觀察組間細(xì)菌群落組成的差異,采用adonis檢驗(yàn)分析不同組間β多樣性差異的顯著性,采用Galaxy軟件的LEfSe組件分析發(fā)現(xiàn)不同組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種;使用R包c(diǎn)orrplot進(jìn)行細(xì)菌群落屬性與土壤因子相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌α多樣性時間變化分析

隨著禁牧?xí)r間增長,土壤pH值下降,2020年pH值最低(P<0.05,圖1a)。SOM先增加后降低,2019年SOM最高,在2018—2020年間無顯著差異(圖1b)。VWC在2018—2020年先下降后上升,其中2019年VWC最小,且顯著低于2018和2020年(P<0.05),而2018年與2020年間VWC無顯著差異(圖1c)。ST先增加后降低,在2018—2020年間無顯著差異(圖1d)。

圖1 土壤理化和細(xì)菌α多樣性差異Fig.1 Differences in soil physicochemical and bacterial alpha diversity注:a,pH;b,SOM,土壤有機(jī)質(zhì),g·kg-1;c,VWC,土壤體積含水量;d,ST,土壤溫度,℃;e,分類單元;f,Chao1指數(shù);g,Observed_species指數(shù);h,香濃指數(shù);i,辛普森指數(shù);2018,自然放牧;2019,禁牧1年;2020,禁牧2年。數(shù)據(jù)間的差異顯著水平為P<0.05,下同Note:a,pH;b,SOM,Soil Organic Matter,g·kg-1;c,VWC,Volumetric Water Content;d,ST,Soil Temperature,℃;e,OTU;f,Chao1 index;g. Observed_species index;h,Shannon index;i,Simpson index;2018,Natural Grazing;2019,1 year of grazing prohibition;2020,2 year of grazing prohibition. The significant level of difference between the data is P<0.05,the same as below

細(xì)菌OTU數(shù)呈單峰趨勢,2019年數(shù)值最高,在2018—2020年間有顯著差異(P<0.05,圖1e)。多樣性指數(shù)(Chao1,Observed_species,Shannon,Simpson)均出現(xiàn)下降趨勢(圖1f,g,h,i),而且2020年多樣性指數(shù)與2018年和2019年的多樣性指數(shù)有顯著差異(P<0.05)。

2.2 土壤細(xì)菌群落變化及差異分析

2.2.1土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化 對放牧向禁牧轉(zhuǎn)變初期表層土壤細(xì)菌物種組成變化進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在門水平上,表層土壤細(xì)菌群落以放線菌門(Actinobacteria,31.56%～60.81%)、變形菌門(Proteobacteria,20.90%～35.81%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,2.43%～14.27%)、酸桿菌門(Acidobacteria,2.30%～11.98%)為主(74.90%～92.86%)。2019年,放線菌門的豐度最大,與2018年相比升高53.60%,在2020年,變形菌門豐度超過放線菌門豐度;變形菌門、擬桿菌門的豐度隨著禁牧?xí)r間的延長而增加,在2019年分別增加26.08%,38.27%,在2020年分別增加71.33%,487.24%;酸桿菌門在2018年相對豐度最高,2019年、2020年相對豐度分別減少80.55%,80.80%(圖2a)。

圖2 細(xì)菌群落組成Fig.2 Bacterial community composition注:a,門水平下細(xì)菌群落組成的變化;b,屬水平下細(xì)菌群落組成的變化。2018,自然放牧;2019,禁牧1年;2020,禁牧2年Note:a,Changes in bacterial community composition at the phylum level;b,Changes in bacterial community composition at the genus level. 2018:Natural grazing;2019,1 year of grazing prohibition;2020,2 year of grazing prohibition

在屬水平上,表層土壤細(xì)菌群落以鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas1.65%～6.48%)、Gaiella(2.23%～2.97%)、紅色桿菌屬(Rubrobacter1.80%～3.16%)、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter0.80%～3.13%)為優(yōu)勢菌屬,鞘脂單胞菌屬的豐度隨著禁牧?xí)r間的延長,在2019年和2020年,其豐度分別增加了55.15%和292.12%;相比于2018年,Gaiella和土壤紅桿菌屬的豐度在2019年呈增加趨勢,分別增加了22.73%和151.20%,在2020年出現(xiàn)了下降情況均小,Gaiella的豐度下降了7.85%,土壤紅桿菌屬的豐度下降了36.00%;紅色桿菌屬的豐度在2019年中增加了74.59%,在2020年出現(xiàn)了下降趨勢,其相對豐度較2018年有所增加,但增幅為0.56%(圖2b)。

2.2.2表層土壤細(xì)菌群落β多樣性 采用Bray-Curtis方法,進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA),第一坐標(biāo)軸(PC1)和第二坐標(biāo)軸(PC2)可以解釋細(xì)菌組成的53.75%的組間差異,其中,PC1和PC2分別解釋了34.56%和19.19%的差異,2018年和2019年之間的差異小于2018年和2020年之間的差異。采用adonis分析確定了自然放牧向禁牧轉(zhuǎn)變初期表層土壤細(xì)菌群落組成有顯著差異(R2=0.47,P=0.001)(圖3)。

2.2.3表層土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析 通過對表層土壤細(xì)菌豐度差異進(jìn)行LEfSe分析發(fā)現(xiàn),在LDA Score >4.0,P<0.05水平下,從2018年至2020年中相對豐度存在顯著差異的細(xì)菌共有46種。2018年酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)等15種細(xì)菌與2019年和2020年存在顯著差異;禁牧后,在2019年,與2018年和2020年相比,放線菌門(Actinobacteria)等13種細(xì)菌的相對豐度存在顯著差異;在2020年,與2018年和2019年相比,變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)等18種細(xì)菌的相對豐度存在顯著差異(圖4)。

圖4 細(xì)菌群落組成差異Fig.4 Differences in bacterial community composition注:2018,自然放牧;2019,禁牧1年;2020,禁牧2年Note:2018,Natural grazing;2019,1 year of grazing prohibition;2020,2 year of grazing prohibition

2.3 表層土壤細(xì)菌群落屬性-土壤理化關(guān)系分析

采用Pearson相關(guān)分析方法,探究土壤理化性質(zhì)與土壤細(xì)菌群落之間的相關(guān)關(guān)系,發(fā)現(xiàn)在2018年自然放牧環(huán)境下,BO分別與VWC和ST存在顯著的負(fù)相關(guān)和正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),BS與VWC顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖5a);禁牧后(2019—2020年)影響B(tài)O的主要因素發(fā)生了顯著變化,BS的相關(guān)因素也發(fā)生了一定的變化,BO與pH、SOM、ST顯著正相關(guān)(P<0.05),與VWC顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05),BO與pH的相關(guān)性顯著增強(qiáng);BS與SOM、VWC顯著相關(guān)(P<0.05),其中,BS與VWC的相關(guān)性增強(qiáng)(圖5b)。

圖5 放牧向禁牧轉(zhuǎn)變初期的細(xì)菌群落屬性-土壤理化相關(guān)性分析Fig.5 Analysis of bacterial community properties-soil physicochemical correlation in the early stage of grazing to grazing prohibition注:a,基于Pearson算法,自然放牧環(huán)境中(2018年)微生物與土壤因子的相關(guān)關(guān)系;b,基于Pearson算法,禁牧環(huán)境中(2019—2020年)微生物與土壤因子的相關(guān)關(guān)系。BO,細(xì)菌OTU,表示細(xì)菌豐度;BS,細(xì)菌Shannon指數(shù),表示細(xì)菌多樣性。圖中藍(lán)色表示顯著正相關(guān),紅色表示顯著負(fù)相關(guān),顏色越深相關(guān)性越大,數(shù)字為相關(guān)性系數(shù);空白表示P>0.05,無顯著相關(guān)關(guān)系;“*”,P<0.05;“**”,P<0.01;“***”,P<0.001Note:a,The correlation between microorganisms and soil factors in a natural grazing environment(2018) based on the Pearson algorithm. b,The correlation between microorganisms and soil factors in a restricted grazing environment(2019-2020) based on the Pearson algorithm. BO,Bacterial OTU,indicating bacterial abundance;BS,Bacterial Shannon index,indicating bacterial diversity. Blue color in the graph indicates significant positive correlation,red color indicates significant negative correlation,the darker the color the greater the correlation,the number is the correlation coefficient;blank indicates P>0.05,no significant correlation. “*”,P<0.05;“**”,P<0.01;“***”,P<0.001

3 討論

禁牧對過度放牧草地土壤微生物群落的恢復(fù)可產(chǎn)生積極的影響[21],本研究結(jié)果顯示放牧向禁牧轉(zhuǎn)變初期,表層土壤細(xì)菌中優(yōu)勢菌組成沒有顯著改變,仍以放線菌門和變形菌門為主,但細(xì)菌的相對豐度產(chǎn)生變化,放線菌門相對豐度先增加后減少,而變形菌門相對豐度逐年增加。這可能是因?yàn)樵诜拍料蚪恋霓D(zhuǎn)變過程中,土壤中微生物可利用的營養(yǎng)逐漸增加,導(dǎo)致微生物群落從寡養(yǎng)類群轉(zhuǎn)變?yōu)楣拆B(yǎng)類群。放線菌門屬于寡養(yǎng)類群,通常更適應(yīng)養(yǎng)分低的環(huán)境,并能耐受干旱[19],而變形菌門屬于共養(yǎng)類群,其豐度與碳水化合物和氨基酸代謝之間存在正相關(guān)關(guān)系,通常更適應(yīng)于養(yǎng)分高的環(huán)境[22]。因?yàn)榻習(xí)鼓承┨囟ǖ奈⑸锷呈艿较拗?進(jìn)而導(dǎo)致某些微生物物種數(shù)量減少,并降低了細(xì)菌的α多樣性[14],這與本研究中禁牧后細(xì)菌α多樣性下降結(jié)果一致。但在朱怡等[23]的研究中,禁牧條件下細(xì)菌α多樣性高于放牧條件,由于其研究區(qū)域在江蘇大豐麋鹿保護(hù)區(qū),地區(qū)、天氣等因素對細(xì)菌α多樣性也會產(chǎn)生一定的影響,因此,其中的機(jī)制需進(jìn)一步探究。

土壤pH是影響細(xì)菌群落組成變化的一個重要因素[24]。在自然放牧條件下,牛羊排泄物可能會使土壤pH升高成堿性[25]。在本研究結(jié)果中,禁牧初期由于缺乏牛羊排泄物(糞便和尿液)的輸入,土壤pH呈下降趨勢。同時,在本樣地的其他研究數(shù)據(jù)表明,2018年降雨量為309 mm,2019年降雨量198.3 mm,2020年降雨量164.6 mm[26]。禁牧1年沒有牲畜啃食,植被有所恢復(fù),并且這一年度降雨量減少,地下、地上生物量的增加同時消耗大量水分,所以導(dǎo)致VWC在2019年呈下降趨勢。禁牧2年植物根系更旺盛、完整,吸水能力增強(qiáng),所以在禁牧2年,土壤水分有所回升[27]。由于土壤水分的變化,BO與VWC的顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系減弱,BS與VWC的顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系增強(qiáng),對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了直接的影響,并且不同的細(xì)菌對水分的響應(yīng)不同,一般來說革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌耐旱性更強(qiáng);其中,綠彎菌門、疣微菌門對水分變化敏感,短暫的干旱脅迫會導(dǎo)致其豐度降低,即便再復(fù)水也無法恢復(fù)到先前水平[28]。在本研究中,BS、BO與SOM均存在顯著正相關(guān)關(guān)系,BO與ST存在顯著正相關(guān)關(guān)系,這可能是因?yàn)榻翖l件下植物多樣性、豐富度和總蓋度增高,從一定程度上增加了土壤覆蓋率、抵御了太陽輻射,使土壤溫度降低[29]。溫度可通過影響土壤酶活性、土壤養(yǎng)分分解,進(jìn)一步影響微生物群落尤其是細(xì)菌群落[30]。溫度對細(xì)菌豐度有顯著的影響,如厚壁菌門相對豐度隨著土壤溫度的升高而降低[31]。土壤有機(jī)質(zhì)積累的主要驅(qū)動因素包括微生物殘?bào)w,微生物群落的組成和豐度也會受到有機(jī)物分解程度的影響,土壤碳與微生物群落多樣性有顯著相關(guān)關(guān)系,對草原生態(tài)系統(tǒng)的健康有重要的意義[32-33]。

4 結(jié)論

在放牧向禁牧轉(zhuǎn)變的初期,內(nèi)蒙古克氏針茅草原的土壤pH呈下降趨勢,有機(jī)質(zhì)、溫度先增加后降低,體積含水量先降低后增加。細(xì)菌群落優(yōu)勢菌種未發(fā)生改變,為放線菌門和變形菌門,優(yōu)勢菌種的相對豐度發(fā)生變化,放線菌門相對豐度先升高后降低,變形菌門相對豐度呈上升趨勢,細(xì)菌α多樣性下降。放牧向禁牧轉(zhuǎn)變初期,細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成存在顯著的差異,細(xì)菌豐度易受外部環(huán)境的影響。本研究的結(jié)果為草地管理模式改變初期對表層土壤細(xì)菌的影響提供了有用的數(shù)據(jù)信息和新的見解。