青海草原毛蟲化學(xué)感受蛋白基因的鑒定與組織表達(dá)分析

南彥斌, 唐德靖, 楊永超, 孔一森, 周淵濤

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院, 青海 西寧 810016)

化學(xué)感受蛋白(Chemosensory proteins,CSPs)是類似六棱柱的小球狀蛋白質(zhì),以其在信息素感知方面復(fù)雜的功能而聞名[1]。它有四個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn),構(gòu)成C1-C2和C3-C4兩個(gè)二硫鍵,具有6個(gè)α螺旋[2]。在CSPs的研究進(jìn)程中,其命名發(fā)生數(shù)次變動(dòng),起初由于其在觸角中優(yōu)先表達(dá)因此為其命名為嗅覺特異-D蛋白質(zhì)(Olfactory-specific-D proteins,OS-D)或信息素結(jié)合蛋白A-10 (Pheromone-binding proteins A-10)[3],后又在一些昆蟲中的感覺器官中(如下唇須和足等)發(fā)現(xiàn)該家族基因也可以表達(dá),故又稱為感受器官蛋白(Sensory appendage protein,SAP)。事實(shí)上,它們屬于同一類基因,通常作為氣味分子和化學(xué)信號刺激物的載體蛋白,在感受器樹突膜上的受體位點(diǎn)與受體蛋白結(jié)合。當(dāng)前,這類蛋白被稱為化學(xué)感受蛋白(CSP)[4]。CSPs可感知宿主氣味和性信息素[5],且其功能也可能與肢體修復(fù)、晝夜節(jié)律周期調(diào)節(jié)、生長發(fā)育、免疫反應(yīng)、攝食行為和殺蟲劑抗性有關(guān)[6]。昆蟲觸角和下顎須等化學(xué)感受部位可以合成化學(xué)感受蛋白,合成的CSPs被分泌到淋巴液中,其攜帶的信息素或揮發(fā)物等疏水性物質(zhì)進(jìn)入化學(xué)感受器的神經(jīng)元中,引起下游行為反應(yīng)的發(fā)生,因此,化學(xué)感受蛋白在昆蟲感知外部環(huán)境的過程中CSPs起到重要作用[7]。CSPs在昆蟲中具有高度的保守性,它們的主要功能是與氣味分子結(jié)合,然后將這些分子運(yùn)輸?shù)绞荏w[8]。近年來,隨著轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展,各種昆蟲基因組序列被檢測,大量的昆蟲CSPs基因被鑒定出來。CSPs的數(shù)量因不同的昆蟲物種而異。例如,在家蠶Bombyxmori中發(fā)現(xiàn)20個(gè)CSP,在東亞飛蝗Locustamigratoria中發(fā)現(xiàn)70個(gè)CSP,在意大利蜜蜂Apismellifera中僅發(fā)現(xiàn)6個(gè)CSP[9]。目前大多數(shù)CSPs的功能是未知的。因此,CSPs的嗅覺和非嗅覺功能需要進(jìn)一步研究[10]。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)成為研究基因表達(dá)與定位的重要手段。

青海草原毛蟲(Gynaephoraqinghaiensis)俗稱紅頭黑毛蟲,屬于鱗翅目(Lepidoptera)毒蛾科(Lymantriidae)草原毛蟲屬(Gynaephora)[11]。迄今為止,全球共有15個(gè)物種被發(fā)現(xiàn),其中8個(gè)是青藏高原特有種[12,13]。青海草原毛蟲幼蟲具有7個(gè)齡期,雌雄成蟲具有顯著的不同,其雌成蟲翅、觸角、胸足皆退化[14]。在青海地區(qū)重點(diǎn)分布在門源、海晏、天俊、澤庫、瑪多、甘德、祁連、雜多和治多等地方[15]。此外,其幼蟲背部有毒腺,可導(dǎo)致家畜和野生動(dòng)物的口腔潰瘍和斷舌病,使它們無法進(jìn)食,最終導(dǎo)致死亡[16,17]。近年來,青海草原毛蟲在青藏高原爆發(fā)成災(zāi)的報(bào)道很多,反映出其已能夠很好的適應(yīng)青藏高原缺氧、嚴(yán)寒、強(qiáng)紫外輻射的極端惡劣的環(huán)境[18]。青海草原毛蟲適應(yīng)環(huán)境能力和繁殖能力強(qiáng),防治困難,當(dāng)前青海草原毛蟲主要采取化學(xué)防治,長期的化學(xué)防治必然導(dǎo)致抗藥性和農(nóng)藥殘留的問題[19]。昆蟲的CSPs具有作為害蟲防控新靶標(biāo)的潛力,為害蟲的綠色防治提供了方向[4]。當(dāng)前,已經(jīng)獲得多種鱗翅目昆蟲的CSPs基因[20],但是在青海草原毛蟲嗅覺方面的研究較少,且未見關(guān)于該蟲CSPs基因的研究報(bào)道。因此,本研究基于青海草原毛蟲幼蟲及雌雄成蟲轉(zhuǎn)錄組擬篩選鑒定青海草原毛蟲CSPs并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,通過RT-qPCR技術(shù)分析青海草原毛蟲CSPs基因在不同組織和發(fā)育階段中的表達(dá)量,以期為深入研究青海草原毛蟲化學(xué)感受機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試青海草原毛蟲幼蟲及成蟲來源于2020年5—8月采集自青海省海北州(36°59′06.6″ N,100°52′19.1″ E,海拔3 095.1 m)的野外種群。在人工氣候箱中將采集的部分青海草原毛蟲成蟲雌雄配對,置于塑料盒(d=10 cm)中進(jìn)行短期飼養(yǎng),用牧草提供營養(yǎng)且作為產(chǎn)卵場所收集卵期樣品。飼養(yǎng)條件:溫度(26±1)℃,光周期16L∶8D,相對濕度60%～80%。對采集的青海草原毛蟲幼蟲根據(jù)頭殼寬度挑選出7齡幼蟲,進(jìn)行短期飼養(yǎng)直至化蛹以收集蛹期樣品。收集青海草原毛蟲雄成蟲的觸角、頭(去除觸角)、胸、腹、翅和足,獲得雄成蟲共6種部位的樣品。青海草原毛蟲雌成蟲觸角、翅和足發(fā)生退化,收集到頭(去除觸角)、胸、腹共3種部位的樣品,另外收集了青海草原毛蟲卵、2至7齡的幼蟲和蛹,每種樣品取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)重復(fù)收集數(shù)量根據(jù)組織或個(gè)體大小從3～30不等,用液氮速凍分裝儲(chǔ)存在-80℃冰箱中備用[21]。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

通過Trizol法提取青海草原毛蟲各個(gè)樣品的總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染。同時(shí),利用超微量分光光度計(jì)檢測RNA純度,當(dāng)OD260nm/OD280nm的范圍為1.8～2.2,表明提取的RNA合格。之后對檢測純度合格的RNA樣品利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TRUEscript 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(艾德萊,北京)的說明進(jìn)行cDNA第一鏈的合成并置于—20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息確定并獲得青海草原毛蟲CSPs基因序列,利用Oligo7軟件設(shè)計(jì)引物,內(nèi)參基因(EF1-α-F)引物由蘭州大學(xué)昆蟲實(shí)驗(yàn)室篩選獲取[18],引物委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 青海草原毛蟲CSPs基因序列獲取

基于前期通過第二代高通量測序技術(shù)對青海草原毛蟲4齡幼蟲、雌雄成蟲進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果[15],以“CSP”和“chemosensory proteins”為關(guān)鍵詞在各個(gè)庫中進(jìn)行查找,為確定候選基因?qū)⑺谢瘜W(xué)感受蛋白基因序列在NCBI網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn比對。

利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測出ORF完整的核苷酸和氨基酸序列,之后在NCBI中對預(yù)測出的ORF氨基酸序列進(jìn)行BLASTp驗(yàn)證,設(shè)定e值小于10-5,相似性大于40%,得到推測的CSPs蛋白序列。

1.5 青海草原毛蟲CSPs基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)軟件對化學(xué)感受蛋白氨基酸序列組成、相對分子量、等電點(diǎn)、正負(fù)電荷殘基數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪系數(shù)和總平均疏水性進(jìn)行計(jì)算[22]。采用Signalp4.1Server(http://cbs.dtu.dk/services/Signalp/)預(yù)測其信號肽。

利用在線預(yù)測網(wǎng)站Clustal Omega (http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對篩選獲得的青海草原毛蟲CSPs進(jìn)行同源性比對[23]。

采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa%20_sopma.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測;SWISS MODEL(https://www. swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測[24]。

采用DNAMAN6.0軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對。使用MEGA7.0[25]軟件中的鄰位相鄰算法同其他昆蟲構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。設(shè)置參數(shù)為重復(fù)頻次1 000,替換方法Jones-Taylor-Thornton(JTT)model,空缺數(shù)據(jù)的處理95%部分刪除,其他參數(shù)默認(rèn)。

1.6 青海草原毛蟲CSPs基因的qPCR檢測

以1.2節(jié)合成的cDNA樣品為模板,每個(gè)樣品含3次生物學(xué)重復(fù),每次生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù),通過熔解曲線評估引物的特異性。擴(kuò)增體系為20 μL:SYBR Green Real-time PCR Master Mix 10 μL,正反向引物(10 μmol·μL-1)各0.8 μL,cDNA 1 μL(100 ng),ddH2O 7.4 μL。在ABI 7 500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),運(yùn)行條件:95℃ 1 min;95℃ 15 s,60℃ 15 s,循環(huán)40次;72℃ 45 s。在成蟲的各組織中以每個(gè)CSP在雌性頭部的表達(dá)量為基準(zhǔn),在幼蟲中以7齡幼蟲為陽性對照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

青海草原毛蟲CSPs基因在不同組織及不同齡期中的相對表達(dá)量利用2-ΔΔCt值法進(jìn)行計(jì)算,其中,ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因;ΔΔCt=ΔCt樣品-ΔCt對照[26]。通過SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,對CSPs基因在不同組織、不同發(fā)育階段的表達(dá)量差異進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),同時(shí)利用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較;最后使用Graphpad prism繪制基因的組織表達(dá)譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 青海草原毛蟲CSPs的生物信息學(xué)分析

在青海草原毛蟲的基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出11個(gè)CSPs(表2),經(jīng)過ORFfinder與NCBI BLASTp驗(yàn)證后,其核苷酸長度大小介于222～381 bp之間。GqinCSPs的氨基酸大小差異很大,最短的有74個(gè)氨基酸,最長的有127個(gè)氨基酸,平均長度為112個(gè)氨基酸。采用軟件TransDecoder預(yù)測出該11個(gè)GqinCSPs的編碼區(qū)序列都是完整的。采用在線網(wǎng)站SignaIP4.1預(yù)測其信號肽,結(jié)果表明GqinCSP5和GqinCSP8兩個(gè)基因沒有信號肽。將GqinCSPs與其他昆蟲序列相似性進(jìn)行比較,GqinCSP6基因與菊黃花粉蝶Zerenecesonia基因序列(Gen Bank登錄號為XP_038221853)相似度最高,達(dá)到84.11%。其次,GqinCSP2基因與苜蓿盲蝽Adelphocorislineolatus基因序列(Gen Bank登錄號為AXS78221)的相似度達(dá)到了83.33%。GqinCSPs基因與其他昆蟲物種相似性高于60%的有8個(gè),占總數(shù)的72.73%,表明GqinCSPs與這些鱗翅目昆蟲序列可能同源。

表2 青海草原毛蟲CSPs生物信息學(xué)分析Table 2 Bioinformatics analysis of CSPs in G. qinghaiensis

利用在線預(yù)測網(wǎng)站Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)對篩出的11條GqinCSPs進(jìn)行比對(表3),其中相似性最高的是GqinCSP4與GqinCSP9,為56.76%,相似性最低的是GqinCSP5與GqinCSP8,為8.05%,GqinCSPs序列之間的相似性反映出它們之間的同源性,由此可以得出GqinCSP1與GqinCSP2和GqinCSP4,GqinCSP2和GqinCSP9以及GqinCSP4和GqinCSP9之間的同源性都比較高。

表3 青海草原毛蟲化學(xué)感受蛋白CSPs氨基酸序列之間的相似性Table 3 The similarity of amino acid sequences of chemosensory proteins CSPs from G. qinghaiensis 單位:%

2.2 青海草原毛蟲CSPs理化性質(zhì)分析

利用ExPASy-ProtParam tool(http://web.expasy.org/protparam/)軟件對青海草原毛蟲化學(xué)感受蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(表4),青海草原毛蟲11個(gè)CSPs的氨基酸長度區(qū)間是74～127aa,相對分子量在8～15 kD之間。其理論等電點(diǎn)大多數(shù)位于6附近,如GqinCSP3-5、GqinCSP7、GqinCSP9-11,表明其屬于偏酸性蛋白。GqinCSP1,GqinCSP2,GqinCSP6,GqinCSP8蛋白理論等電點(diǎn)位于8附近,表明其屬于偏堿性蛋白。CSP帶正電荷和負(fù)電荷的殘基數(shù)目基本相同。GqinCSP1-3,GqinCSP6-11這7個(gè)化學(xué)感受蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)高于40,表明這些蛋白的性質(zhì)不穩(wěn)定。從脂肪系數(shù)可以看出11個(gè)CSPs均為熱穩(wěn)定性蛋白。除GqinCSP1,GqinCSP2,GqinCSP8,GqinCSP10四個(gè)蛋白外,其余青海草原毛蟲CSPs的總平均疏水性都介于-0.5～0.5之間。因此,判定剩余蛋白為兩性蛋白質(zhì)(+值為疏水性,-值為親水性,-0.5～0.5之間為兩性蛋白質(zhì))。

表4 青海草原毛蟲化學(xué)感受蛋白理化性質(zhì)Table 4 The physicochemical properties of chemosensory proteins CSPs from G. qinghaiensis

2.3 青海草原毛蟲CSPs的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa%20_sopma.html)在線網(wǎng)站預(yù)測GqinCSPs二級結(jié)構(gòu)(圖1),發(fā)現(xiàn)α螺旋是青海草原毛蟲化學(xué)感受蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要組成部分,除GqinCSP8和GqinCSP9外,其他GqinCSPs的α螺旋含量都比較高,其中GqinCSP3 α螺旋含量最高。其次是無規(guī)則卷曲。β折疊和延伸鏈的氨基酸殘基較少。由此, 我們推測青海草原毛蟲CSPs的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲形成并維持穩(wěn)定。

2.4 青海草原毛蟲CSPs的三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

采用SWISS MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)網(wǎng)站同源建模得到青海草原毛蟲CSPs蛋白的三級結(jié)構(gòu)模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),GqinCSP1-3,GqinCSP5-7,GqinCSP10和GqinCSP11,都由6個(gè)α螺旋組成,各個(gè)螺旋之間都由半胱氨酸形成二硫鍵相互締合,二硫鍵對三級結(jié)構(gòu)起到支撐作用,其三維結(jié)構(gòu)形成一個(gè)親水的表面和一個(gè)疏水的空腔,由此形成一個(gè)閉合的可以容納小分子的疏水性結(jié)合腔(圖2)。GqinCSP4,GqinCSP8和GqinCSP9建模后,與其他的蛋白三級結(jié)構(gòu)差異較大,α螺旋結(jié)構(gòu)較少。

2.5 青海草原毛蟲CSPs基因的多序列比對

利用DNAMAN6.0軟件對GqinCSPs進(jìn)行多序列比對,通過比對得到10個(gè)GqinCSPs的半胱氨酸模式識別序列為C1-X6-C2-X11-19-C3-X2-C4 (C為半胱氨酸,X為任意氨基酸)(圖3),這和已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的鱗翅目昆蟲CSPs家族無差異。但是,圖中反映出GqinCSP8序列不屬于保守半胱氨酸序列,原因可能是在青海草原毛蟲的進(jìn)化過程中某些基因片段自然消除。

圖3 青海草原毛蟲11個(gè)化學(xué)感受蛋白CSP1～CSP11的氨基酸序列比對Fig.3 Sequence alignment of amino acids of 11 chemosensory proteins CSP1-CSP11 in G. qinghaiensis注:圖中黑色C1-4代表保守半胱氨酸模式序列Note:The black C1-4 represents the conserved cysteine pattern sequence in the figure

2.6 青海草原毛蟲CSPs基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為明確青海草原毛蟲CSP與其他近緣種的進(jìn)化關(guān)系,采用NJ法構(gòu)建青海草原毛蟲化學(xué)感受蛋白與其他昆蟲的CSPs系統(tǒng)發(fā)育樹,參與建樹的包括青海草原毛蟲的11個(gè)CSP氨基酸序列和其他5種昆蟲的68個(gè)CSP氨基酸序列。結(jié)果顯示青海草原毛蟲11個(gè)CSP在整個(gè)進(jìn)化系統(tǒng)中分布比較分散,但所有的GqinCSPs與鱗翅目昆蟲CSPs聚到一起(圖4)。其中GqinCSP1和HarmCSP19、GqinCSP2和HarmCSP20、GqinCSP5和PxutCSP12、GqinCSP8和EhipCSP5、GqinCSP10和PxutCSP8及GqinCSP11和PxutCSP11b聚到同一個(gè)小分支中。因此,青海草原毛蟲CSPs與棉鈴蟲和柑橘鳳蝶親緣關(guān)系最近。

2.7 青海草原毛蟲CSP基因的組織表達(dá)譜

為明確青海草原毛蟲功能,以雄蟲頭部作為陽性對照,通過RT-qPCR技術(shù)測定11個(gè)CSP基因在青海草原毛蟲不同部位的相對表達(dá)量差異情況,結(jié)果表明,11個(gè)GqinCSPs基因在雌雄成蟲頭部和雄蟲觸角中均有表達(dá),且體現(xiàn)不同的表達(dá)水平,其中:GqinCSP2在雄蟲頭部的表達(dá)量顯著高于雌蟲頭部(P<0.05),其余CSP基因在雌雄成蟲頭部的表達(dá)無顯著差異,而GqinCSP1,GqinCSP2,GqinCSP4,GqinCSP5,GqinCSP10在雌性成蟲頭部的相對表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05);GqinCSP3,GqinCSP7,GqinCSP10,GqinCSP11在雄成蟲觸角的相對表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)。此外,GqinCSP1,GqinCSP3,GqinCSP4,GqinCSP5,GqinCSP9,GqinCSP10在雌雄成蟲胸部不表達(dá)或微量表達(dá);GqinCSP1,GqinCSP2,GqinCSP8,GqinCSP10在雌雄成蟲腹部的表達(dá)存在顯著差異,且呈現(xiàn)雄性偏好表達(dá)模式,而GqinCSP3則呈現(xiàn)雌性偏好表達(dá)模式(P<0.05);GqinCSP2,GqinCSP10在雌雄成蟲胸翅部不表達(dá)或微量表達(dá);GqinCSP4,GqinCSP5,GqinCSP6,GqinCSP8,GqinCSP9在雄性成蟲足中的相對表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05)(圖5)。

圖5 青海草原毛蟲雌雄成蟲化學(xué)感受蛋白基因組織表達(dá)譜分析Fig.5 The tissue expression profile of chemoreceptor protein genes in male and female adults of G. qinghaiensis注:雌蟲;雄蟲;頭(去除觸角);胸;腹;觸角;翅;足。EF-1-α作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正各組織的表達(dá)量,目的基因在雄性頭部中表達(dá)量作為陽性對照。誤差線表示3次獨(dú)立試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)誤,不同的大小寫字母表示不同的雌雄組織之間的顯著性差異(Duncan:P<0.05)。單星號和雙星號表示目的基因在同一組織的相對表達(dá)量雌雄間差異顯著(t檢驗(yàn),*P<0.05;**P<0.01)Note:Head (with antennae removed) (Hd),Thorax (Th),Abdomen (Ab),Antennae (An),Wings (Wg),Legs (Lg). EF-1- α was used as a reference gene to correct the expression level in each tissue,and the expression level of the target gene in the male head served as a positive control. Error lines represent the standard error of 3 independent trials. Different uppercase letters indicate a significant difference between different tissues of male and female (Duncan:P<0.05). A single asterisk or double asterisk indicate a significant or very significant difference of the relative expression of the target gene in the same tissue (t-test,*P<0.05;**P<0.01)

2.8 青海草原毛蟲CSP基因不同發(fā)育階段表達(dá)譜

不同發(fā)育階段,青海草原毛蟲CSP基因表達(dá)水平顯著不同。以7齡幼蟲作為陽性對照,測定11個(gè)CSP基因在青海草原毛蟲不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量差異情況。結(jié)果表明,11個(gè)青海草原毛蟲CSP基因在2齡與7齡階段均有表達(dá),且體現(xiàn)不同的表達(dá)水平,GqinCSP1,GqinCSP3,GqinCSP5,GqinCSP8,GqinCSP9在2齡階段的相對表達(dá)量顯著高于其他階段(P<0.05)。此外,GqinCSP11在卵中的相對表達(dá)量明顯高于其他發(fā)育階段(P<0.05);GqinCSP7在3齡階段的表達(dá)量極高,是4齡幼蟲表達(dá)量的140倍;GqinCSP9和GqinCSP4分別在三齡和四齡幼蟲中不表達(dá)(圖6)。

3 討論

本研究從青海草原毛蟲的基因組數(shù)組庫中,共鑒定得到11個(gè)青海草原毛蟲CSPs基因,其數(shù)目少于菜粉蝶Pierisrapae(38個(gè)CSPs)[27],懸鈴木方翅網(wǎng)蝽Corythuchaciliata(26個(gè)CSP)[28],蚜蟲Acyrthosiphonpisum(13個(gè)CSPs)但數(shù)目多于意大利蜜蜂Apismellifera(6個(gè)CSPs)[29],甘藍(lán)蚜Lipaphiserysimi(8個(gè)CSPs)[30],點(diǎn)蜂緣蝽Riptortuspedestris(4個(gè)CSP)基因[31]。青海草原毛蟲CSPs屬于分泌型疏水性蛋白,熱穩(wěn)定性較高。除GqinCSP5和GqinCSP8外都有信號肽。全長的CSPs序列,無信號肽的原因推測是不具有信號肽剪切位點(diǎn)造成的[24]。二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,GqinCSPs主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示,8個(gè)GqinCSPs三級結(jié)構(gòu)具有6個(gè)α螺旋,表明青海草原毛蟲CSPs種內(nèi)結(jié)構(gòu)相似度高,三維結(jié)構(gòu)相似的化學(xué)感受蛋白可能在昆蟲尋找寄主、識別定位中具有相似的功能[32]。多序列比對的結(jié)果表明GqinCSP8蛋白序列不屬于保守半胱氨酸序列,推測其原因可能有兩點(diǎn):一是青海草原毛蟲在進(jìn)化時(shí)自然丟失[33]。二是在高通量轉(zhuǎn)錄過程中造成基因片段的缺失。GqinCSPs系統(tǒng)發(fā)育分析表明,大部分GqinCSPs與柑橘鳳蝶Papilioxuthus和棉鈴蟲Heliothisarmigera聚到同一個(gè)小分枝上。只有少數(shù)幾個(gè)GqinCSPs沒有聚在同一個(gè)小分枝上,但聚集在同一個(gè)大進(jìn)化枝上,表明這些物種的CSP基因可能擁有共同的祖先,但為了適應(yīng)不同的環(huán)境,后來逐漸分化成不同的基因型。

基因功能研究的重要參考手段是表達(dá)譜分析[34]。本研究利用用qRT-PCR技術(shù)對青海草原毛蟲不同發(fā)育階段和成蟲不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,GqinCSPs基因在雌雄成蟲頭部和雄蟲觸角中均有表達(dá),且體現(xiàn)不同的表達(dá)水平。這與張志春等[35]研究的小菜蛾CSP不僅在化學(xué)器官中表達(dá),而且在其它非感受器官也有表達(dá)的結(jié)果相同,表明GqinCSPs可能參與昆蟲化學(xué)感受以外的其它生理過程。GqinCSP3在雌蟲的腹部高表達(dá),推測其原因:GqinCSP3對雌蟲激素分泌、卵巢發(fā)育及產(chǎn)卵等眾多生理過程起著重要作用[36]。GqinCSP2在雄蟲頭部的表達(dá)量顯著高于雌蟲頭部,這表明該基因可能與性別特異性行為有關(guān)[37]。本研究獲得的GqinCSP3,GqinCSP7,GqinCSP10,GqinCSP11在雄成蟲觸角中表達(dá)量較高,推測其在雄蟲尋找和定位寄主植物的過程中發(fā)揮重要作用[38]。GqinCSP4,GqinCSP5,GqinCSP6,GqinCSP8,GqinCSP9在雄足中的表達(dá)量最高,推測這五個(gè)基因可能與昆蟲的運(yùn)動(dòng)行為相關(guān),有助于其生長發(fā)育并擴(kuò)大分布范圍[39],同時(shí)也反應(yīng)了青海草原毛蟲對外環(huán)境的一種適應(yīng)機(jī)制。

不同發(fā)育階段的青海草原毛蟲表達(dá)譜顯示,GqinCSP1,GqinCSP3,GqinCSP5,GqinCSP8,GqinCSP9在2齡階段的相對表達(dá)量顯著高于其他階段,推測其原因是這些基因在幼蟲信息素運(yùn)輸中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[40]。GqinCSP11在卵中的相對表達(dá)量明顯高于其他發(fā)育階段,這與譚瑤等[41]的研究結(jié)果,GdHsp70在卵期高表達(dá)相同,推測其可能參與胚胎的正常發(fā)育[42]。因此,GqinCSPs在不同組織與發(fā)育階段的表達(dá)譜非常復(fù)雜,表明它們在青海草原毛蟲的生長發(fā)育和化學(xué)感受過程中起著至關(guān)重要的作用。

4 結(jié)論

本研究基于青海草原毛蟲轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),利用生物信息學(xué)方法首次鑒定出青海草原毛蟲的11個(gè)CSP基因,之后對其表達(dá)譜進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)11個(gè)青海草原毛蟲CSP基因在雌雄成蟲頭部、雄蟲觸角以及2齡至7齡階段中均有表達(dá),且體現(xiàn)不同的表達(dá)水平,為進(jìn)一步研究青海草原毛蟲嗅覺識別機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。