新麥草細(xì)胞分裂素調(diào)控基因CKX4克隆及表達(dá)分析

任曉敏, 云 嵐,2*, 李 珍, 艾 芊, 趙 喬, 石鳳翎

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院, 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018; 2.草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011; 3.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院, 廣東 深圳 518055)

細(xì)胞分裂素(Cytokinin,CK)是植物生長發(fā)育及環(huán)境應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子,通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制發(fā)揮作用[1]。細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶(Cytokinin oxidase/dehydrogenase,CKX)通過斷裂細(xì)胞分裂素N6位置上的不飽和異戊烯類側(cè)鏈,生成腺嘌呤和不飽和醛,降解細(xì)胞分裂素,進(jìn)而對植物的生長發(fā)育起到調(diào)控作用。大部分CKX的N端和C端分別有黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide,FAD)-binding保守結(jié)構(gòu)域和cytokinine-binding保守結(jié)構(gòu)域,保持其基因成員之間功能的相似性[2-3]。CKX4是CKX基因家族成員之一,和植物籽實(shí)產(chǎn)量等調(diào)控相關(guān)[4]。水稻(OryzasativaL.)中的OsCKX4基因主要在根部和葉片中表達(dá),該基因在ATG翻譯啟動子區(qū)域內(nèi)有七個(gè)細(xì)胞分裂素應(yīng)答元件和一個(gè)生長素應(yīng)答元件[5],在水稻中參與生長素及細(xì)胞分裂素的信號通路來調(diào)控根冠的發(fā)育,根特異性表達(dá)CKX4可以提高水稻的鋅含量和籽實(shí)產(chǎn)量[6-7]。小麥(TriticumaestivumL.)中的TaCKX4基因在各個(gè)器官中均有表達(dá),對一些性狀如分蘗數(shù)、籽粒數(shù)、籽粒產(chǎn)量和穗數(shù)有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用[8-9]。

新麥草[Psathyrostachysjuncea(Fisch.) Nevski]為禾本科(Poaceae)小麥族多年生禾草[10],是新麥草屬唯一具有飼用價(jià)值的物種[11],該種原產(chǎn)于中亞和西伯利亞,在我國主要分布在新疆和內(nèi)蒙古等地,具有抗寒、抗旱、耐牧、返青早、耐鹽堿等優(yōu)良特性,并在北方寒旱區(qū)生態(tài)治理方面發(fā)揮著重要作用[10-12]。近年來,隨著生態(tài)修復(fù)工程對優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)草種的需求不斷增加,改良產(chǎn)量性狀成為當(dāng)下草育種需要解決的關(guān)鍵問題。

新麥草是下繁型禾草,分蘗數(shù)量是影響此類禾草飼草和種子產(chǎn)量的關(guān)鍵因素之一。前期研究發(fā)現(xiàn)并篩選到CKX4等與新麥草分蘗相關(guān)的候選基因[13]。在新麥草中,CKX4基因功能研究還很不充分,未見CKX4基因克隆、蛋白亞細(xì)胞定位及表達(dá)鑒定分析的報(bào)道。因此,本研究以新麥草分蘗節(jié)為材料,克隆CKX4基因,并利用生物信息學(xué)分析新麥草及其近緣物種之間的親緣關(guān)系,預(yù)測新麥草CKX4基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)等,通過定量實(shí)時(shí)PCR(qRT-PCR)對CKX4基因在不同分蘗類型種質(zhì)中的相對表達(dá)量進(jìn)行驗(yàn)證,利用煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分析CKX4定位及表達(dá)情況,為深入了解CKX4基因在多年生禾草生長發(fā)育中的作用機(jī)制及新麥草CKX4基因功能進(jìn)一步驗(yàn)證提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選取內(nèi)蒙古呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草資源圃的30株疏蘗型(ST)和30株密蘗型(DT)的新麥草為材料,提取分蘗節(jié)組織總RNA,疏蘗型和密蘗型新麥草的總RNA分別重復(fù)3次,共6個(gè)樣品,由北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組測序,并以相同株數(shù)的多分蘗和少分蘗新麥草不同組織為材料提取總RNA,進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,以1個(gè)月齡的煙草為材料進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。試驗(yàn)所用過表達(dá)載體為p1300-cYFP、轉(zhuǎn)化菌株為感受態(tài)DH5α、農(nóng)桿菌菌株為GV3101感受態(tài)、利福平(Rif)和卡那霉素(Kan),均由中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成所實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA提取和cDNA合成 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1),按照總RNA提取試劑盒(DP432,天根,北京)提取新麥草分蘗節(jié)的總RNA,微量核酸檢測儀(Implen NP80 Mobile)測定濃度及RNA提取質(zhì)量,通過一步法去除gDNA及cDNA合成試劑盒(AW311-02,全式金,北京)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并于—20℃保存。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2新麥草CKX4基因克隆 以新麥草植株分蘗節(jié)為材料,按照總RNA提取試劑盒(DP432,天根,北京)的方法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過SnapGene 6.0.2設(shè)計(jì)PCR引物(表1)。以2 μL新麥草分蘗節(jié)cDNA為模板,加25 μL 2×Phanta Max Master Mix,各2 μL上下游引物,19 μL ddH2O,總反應(yīng)體系50 μL,進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 3 min ×1;95℃ 15 s,61℃ 15 s,72℃ 2 min共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,按照膠回收試劑盒(DP209,天根,北京)說明回收目的條帶,利用克隆試劑盒(CB501-01,全式金,北京)連接Blunt和膠回收產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化搖菌,按照質(zhì)粒小提試劑盒(DP105,天根,北京)說明提取質(zhì)粒,由廣州睿博興科公司進(jìn)行測序。

1.2.3近緣物種CKX4基因編碼區(qū)同源性分析 新麥草CKX4基因的CDS序列通過克隆并由廣州睿博興科公司測序獲得。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源序列比對,下載小麥等10個(gè)物種CKX4基因編碼區(qū)的氨基酸序列。通過DNAMAN軟件對以上物種的CKX4基因編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行比對。利用MEGA 11軟件對不同物種的CKX4基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹繪制。用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)分別預(yù)測不同物種的等電點(diǎn)(Isoelectric point)、氨基酸數(shù)量(Number of amino acids)、分子量(Molecular weight)、親水系數(shù)及不穩(wěn)定系數(shù)。通過NCBI中的Structure(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析不同物種的蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.4新麥草CKX4基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)分析 利用PRABI中的SOPMA(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行新麥草CKX4蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu),并用SAVESv 6.0(https://saves.mbi.ucla.edu/)進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)模型質(zhì)量評估;預(yù)測好的模型用i-TASSER(https://zhanggroup.org/I-TASSER/registration.html)的ModRefiner進(jìn)行蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)預(yù)測,利用軟件Pymol對功能位點(diǎn)進(jìn)行三維立體結(jié)構(gòu)繪制。

1.2.5新麥草CKX4基因相對表達(dá)分析 基于RNA-Seq結(jié)果,利用Ge Norm,Norm Finder和Best Keeper 3種內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價(jià)軟件篩選出表達(dá)穩(wěn)定的CKX4基因;利用IBM SPSS Statistics 23軟件分析CKX4基因分別在30株DT和30株ST新麥草中的相對表達(dá)量。以不同分蘗類型新麥草不同組織的cDNA為模板,進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,cDNA模板加1 μL,正反向引物各0.6 μL,2×Talent qPCR Pre Mix加10 μL,最后補(bǔ)加RNase-free ddH2O,總反應(yīng)體系為20 μL;用qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線評估CKX4基因的擴(kuò)增效率,最后通過2-ΔΔCt法計(jì)算CKX4基因分別在DT和ST中的相對表達(dá)量。

1.2.61300-cYFP-CKX4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草及亞細(xì)胞定位 以0.5 μL克隆質(zhì)粒為模板,p1300上下游連接引物各2 μL,其余同1.2.2方法中PCR反應(yīng);單酶切p1300-cYFP載體反應(yīng)體系為:20 μL p1300-cYFP載體質(zhì)粒,1.5 μL SpeI酶和5 μL Cut Smart,總反應(yīng)體系50 μL,將目的基因與載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化。反應(yīng)體系為:1 μL E×naseⅡ,2 μL 5×CEⅡ buffer,目的基因與載體共7 μL,總體系10 μL。PCR中37℃溫控30 min;進(jìn)行菌液陽性PCR后提質(zhì)粒測序。將GV3101感受態(tài)菌株與CKX4-YFP連接產(chǎn)物連接后涂在含卡那霉素和利福平的抗性板上,30℃培養(yǎng)2 d,挑取菌落于含Kan和Rif的25 mL 1×LB中,30℃振蕩培養(yǎng)12 h,4 000 r·min-1離心30 min;倒凈上清后加入侵染液把菌液的OD600調(diào)為0.5～0.6,50 mL侵染液由500 μL 1 mol·L-1MgCl2,500 μL 1 mol·L-1MES,50 μL 200 mmol·L-1AS和超純水組成,用1 mL的注射器將調(diào)好的菌液注射到煙草葉片中,培養(yǎng)2 d后于尼康共聚焦顯微鏡下拍照分析。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡 將上述轉(zhuǎn)化煙草葉片于液氮中磨成粉末置于離心管中并加入等量的2×SDS loading buffer,混勻后于沸水浴中加熱10 min,12 000 r·min-1離心5 min,取上清。將預(yù)制膠安裝在電泳槽中,加入1×SDS-PAGE電泳緩沖液,向膠孔中點(diǎn)入蛋白上清和全新預(yù)染彩色蛋白Marker,120 V電壓下電泳1 h。PVDF膜于甲醇中浸泡,將濾紙浸泡于轉(zhuǎn)膜液中,轉(zhuǎn)膜液由2.9 g甘氨酸、5.8 g Tris、200 mL甲醇、0.37 g SDS和ddH2O配制而成,總體系為1 L。電泳結(jié)束后,將凝膠反向置于PVDF膜下,覆蓋濾紙和海綿后于4℃下恒壓100 V轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜置于孵育盒中,用1×TBST(20×TBST、Tween-20和ddH2O組成)稍微洗滌后加入封閉液(含5%脫脂奶粉的1×TBST),室溫40 r·min-1轉(zhuǎn)速下?lián)u1 h,倒掉封閉液,加入含GFP抗性的封閉液搖1 h,1×TBST洗滌30 min,加入含HRP標(biāo)記山羊抗小鼠lgG(H+L)的封閉液,40 r·min-1搖1 h,1×TBST洗滌10 min,將PVDF膜置于成像板上,滴加混合等量BeyoECL Moon A液和B液的ECL工作液,于WB曝光儀下拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 新麥草CKX4基因克隆

以新麥草分蘗節(jié)cDNA為模板,克隆CKX4基因全長(圖1),測序結(jié)果目的片段大小為1 596 bp,編碼531個(gè)氨基酸。

圖1 新麥草CKX4基因克隆Fig.1 Cloning of CKX4 gene in Psathyrostachys juncea

2.2 近緣物種CKX4蛋白理化性質(zhì)分析

蛋白理化性質(zhì)分析顯示(表2),新麥草等11個(gè)物種的CKX4基因CDS序列長度最短為1 569 bp,最長為1 596 bp;蛋白質(zhì)序列最短的含有523個(gè)氨基酸,最長則為531個(gè),蛋白質(zhì)分子量為57.52～58.44 KD。新麥草、野生稻(OryzabrachyanthaA.Chev. & Roehr.)和大麥亞種(Hordeumvulgaresubsp.VulgareSpenn.)的等電點(diǎn)分別為7.33,7.09和7.32,為堿性蛋白,其余物種CKX4蛋白的等電點(diǎn)在6.47～6.66之間,均為酸性蛋白。各物種CKX4蛋白親水系數(shù)均為負(fù)值,表明11個(gè)物種的CKX4蛋白均為親水蛋白。新麥草CKX4蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)大于40,小麥和二粒小麥[Triticumdicoccoides(Koern. ex Asch. &Graebn.) Schweinf.]的不穩(wěn)定系數(shù)也均大于40,均為不穩(wěn)定蛋白,新麥草與小麥和二粒小麥的CKX4蛋白在理化性質(zhì)方面較相似。

表2 各物種CKX4蛋白理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of CKX4 protein in individual species

2.3 CKX4基因編碼區(qū)同源序列分析

2.3.1多序列比對及保守結(jié)構(gòu)域分析 將新麥草及10個(gè)近緣物種的CKX4基因編碼區(qū)的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對分析,結(jié)果顯示(圖2),新麥草等9個(gè)物種的FAD輔因子在CKX4蛋白中與GHS基序相關(guān)聯(lián),二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon(L.) P.Beauv.)CKX4在相同的位置則為AHS基序。11個(gè)物種存在相同的保守結(jié)構(gòu)域,說明該基因在物種間比較保守可能具有相似功能,其中細(xì)胞素結(jié)合(Cytokin-bind)結(jié)構(gòu)域范圍相同,細(xì)胞分裂素脫氫酶結(jié)構(gòu)域(PLN02441)的起始位置有一定差異,野生稻開始于第6位氨基酸,節(jié)節(jié)麥亞種(Aegilopstauschiisubsp.Strangulata(Eig) Tzvelev)開始于第30位氨基酸,新麥草及其余物種均從第25位V殘基開始。

圖2 新麥草與其近緣物種CKX4蛋白序列比對Fig.2 Alignment of CKX4 protein sequences of P. juncea with those of its relatives注:倒三角之間代表細(xì)胞素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Cytokin-bind);矩形框與紅色圓形之間代表細(xì)胞分裂素脫氫酶結(jié)構(gòu)域(PLN02441)Note:Between the inverted triangles represents the cytotin binding domain(Cytokin-bind);Between the rectangular box and the red circle represents the cytokinin dehydrogenase domain(PLN02441)

2.3.2同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹分析 采用MEGA 11軟件對CKX4基因編碼區(qū)進(jìn)行分析(圖3),CKX4基因編碼蛋白聚類分析將所有材料初步分為兩類,野生稻、柳枝稷(PanicumvirgatumL.)及哈氏黍(PanicumhalliiVasey)為一類,其余物種聚成的一類可進(jìn)一步分為兩個(gè)亞類,其中一個(gè)亞類僅包含硬直黑麥草(LoliumrigidumGaudin)和二穗短柄草兩個(gè)物種,新麥草與小麥等麥類植物劃分為同一亞類,進(jìn)一步表明在考察的10個(gè)禾本科近緣物種中,節(jié)節(jié)麥、小麥類及大麥亞種與新麥草親緣關(guān)系最近,具有高度同源性。

圖3 基于CKX4氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of P. juncea based on CKX4 amino acid sequence

2.3.3新麥草CKX4蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測 新麥草CKX4蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示(圖4),該蛋白中有186個(gè)氨基酸形成α-螺旋,占比35.03%;延伸鏈占比18.46%,由98個(gè)氨基酸形成;β-轉(zhuǎn)角占6.59%,由35個(gè)氨基酸形成;不規(guī)則卷曲占39.92%,由212個(gè)氨基酸形成,表明α-螺旋和不規(guī)則卷曲是新麥草CKX4蛋白的主要二級結(jié)構(gòu)。新麥草CKX4蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)主要由不同數(shù)量的α-螺旋和β片層折疊構(gòu)成(圖5),通過預(yù)測其功能位點(diǎn)顯示,該蛋白存在和FAD相關(guān)的GHS基序的組氨酸殘基位點(diǎn)和Leu(亮氨酸)殘基位點(diǎn)(L223)。

圖4 新麥草CKX4蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Secondary structure prediction of CKX4 protein in P. juncea

圖5 新麥草CKX4蛋白三級結(jié)構(gòu)及配體結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測Fig.5 Prediction of tertiary structure and ligand binding sites of CKX4 protein in P. juncea

2.4 新麥草CKX4基因相對表達(dá)量分析

RNA-Seq結(jié)果顯示(圖6A),新麥草CKX4基因在DT中的相對表達(dá)量為3.677,而ST中相對表達(dá)量為8.160,ST中相對表達(dá)量顯著高于DT中的相對表達(dá)量(P<0.05);用相同生育期材料進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果顯示DT中的CKX4基因相對表達(dá)量為27.723,而ST中的該基因相對表達(dá)量為72.011,該基因在ST類型新麥草材料中相對表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01),表明CKX4基因與新麥草分蘗過程相關(guān),且在該過程中起到降低分蘗數(shù)的作用。進(jìn)一步對不同分蘗類型新麥草不同組織中的CKX4基因的相對表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果顯示(圖6B),CKX4基因在不同分蘗類型的新麥草中,根和葉中的基因相對表達(dá)量無顯著差異,分蘗節(jié)中ST型新麥草中CKX4基因相對表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01),且表達(dá)量高于其他組織。

圖6 新麥草CKX4基因表達(dá)量分析Fig.6 Analysis of CKX4 gene expression in P. juncea注:圖上標(biāo)* 表示CKX4基因不同分蘗型新麥草相比差異顯著(P<0.05),標(biāo)**表示差異極顯著(P<0.01),ns表示無顯著差異,DT表示多分蘗型新麥草,ST表示少分蘗型新麥草Note:The marker * in the figure indicates that there was a significant difference in CKX4 gene expression between different tillering types of P. juncea (P<0.05),and the marker ** that the difference was extremely significant (P<0.01);ns denotes that there was no significant difference;DT stands for the multi-tillering type of P. juncea, ST the less tillering type

2.5 新麥草CKX4亞細(xì)胞定位及蛋白質(zhì)印記分析

將CKX4克隆質(zhì)粒與單酶切后的p1300-cYFP載體進(jìn)行連接,構(gòu)建CKX4-YFP過表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后侵染煙草,分析CKX4蛋白亞細(xì)胞定位及表達(dá)情況,結(jié)果顯示(圖7),p1300-cYFP載體可以正常表達(dá),新麥草CKX4蛋白定位于細(xì)胞內(nèi),推測可能定位于高爾基體中。利用蛋白質(zhì)印跡法分析新麥草CKX4蛋白在煙草中的表達(dá)情況,結(jié)果(圖8)顯示,CKX4-YFP表達(dá)位置在85.48 kDa。

圖7 CKX4的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of CKX4

圖8 新麥草CKX4-YFP蛋白質(zhì)印跡分析Fig.8 Western blot analysis of CKX4-YFP in P. juncea

3 討論

細(xì)胞分裂素與植物的各種生理活動密切相關(guān),如營養(yǎng)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分裂和葉片衰老等[14-15]。CKX是專一催化且不可逆降解細(xì)胞分裂素的黃素酶,通過各種化學(xué)和分子方法抑制CKX會導(dǎo)致不同組織中的細(xì)胞分裂素聚集,進(jìn)而提高谷物產(chǎn)量和非生物脅迫耐受性,并延緩衰老[6]。

本研究通過PCR的方法成功克隆了新麥草CKX4基因序列,經(jīng)測序后進(jìn)行同源序列比對及保守結(jié)構(gòu)域分析,結(jié)果表明11個(gè)近緣物種均存在FAD-binding保守結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞素結(jié)合(Cytokin-bind)結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞分裂素脫氫酶結(jié)構(gòu)域(PLN02441),說明新麥草與10個(gè)近緣物種的CKX4編碼蛋白有功能相似的部分,細(xì)胞素結(jié)合結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞分裂素脫氫酶1、FAD和細(xì)胞分裂素結(jié)合區(qū)域,主要存在于細(xì)胞分裂素脫氫酶1中,能夠結(jié)合FAD和細(xì)胞分裂素底物[16]。在不同物種的系統(tǒng)發(fā)育樹及理化性質(zhì)分析中,新麥草與小麥等麥類作物的親緣關(guān)系最近,CKX4編碼蛋白也有相似的理化性質(zhì),表明其具有高度的同源性,蛋白功能相似。有研究表明,小麥CKX基因?qū)π←湹纳L發(fā)育及產(chǎn)量形成有明顯的影響[17-18],TaCKX3 基因在‘豫麥 8679’/‘紅芒春 31’ 重組自交系(RILs)群體中有較好的多態(tài)性,與小麥的穗粒數(shù)相關(guān)[19],除此之外,TaCKX2-1和TaCKX2-2基因與小麥穗粒數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系,且在幼穗和莖中高表達(dá),說明兩個(gè)基因可能對穗分化發(fā)育起重要作用,從而對小麥產(chǎn)量形成影響[20]。小麥TaNAC1基因通過下調(diào)TaCKX4基因的表達(dá)量,促進(jìn)細(xì)胞分裂素的產(chǎn)生和積累,從而抑制小麥的根系生長,TaCKX4基因在整個(gè)調(diào)控過程中對小麥鋅含量和產(chǎn)量也有一定的影響,該基因通過調(diào)節(jié)小麥籽粒數(shù)、穗數(shù)和分蘗數(shù)等性狀,進(jìn)而影響小麥產(chǎn)量,但這種調(diào)節(jié)依賴于田間環(huán)境[8-9]。Chang等人[21]研究發(fā)現(xiàn)小麥中TaCKX4攜帶A型基因的葉綠素含量和粒重顯著高于B型基因的個(gè)體,對小麥的產(chǎn)量有一定影響。以上說明CKX4基因不僅通過調(diào)控新麥草的分蘗數(shù)對新麥草產(chǎn)量產(chǎn)生影響,也可能通過調(diào)控穗分化影響種子產(chǎn)量。

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)存在折疊結(jié)構(gòu),骨架的原子之間存在相互作用,形成多肽,決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),進(jìn)而決定生化功能,二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測對于識別蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)及其折疊也有重要意義[22-23]。新麥草CKX4蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和不規(guī)則卷曲組成,探究其結(jié)構(gòu)對揭示該蛋白功能有重要作用。FAD輔因子在活性CKX蛋白中與保守GHS基序的組氨酸殘基共價(jià)結(jié)合[16],H是植物CKX中的結(jié)合殘基[1],但二穗短柄草CKX4在相同的位置為AHS基序,該突變可能會影響FAD的結(jié)合[24],有研究推測降解CK的主要反應(yīng)機(jī)制與FAD結(jié)構(gòu)域相關(guān)[16,25-26]。新麥草CKX4編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和β片層折疊構(gòu)成,該模型已通過SAVESv6.0軟件的質(zhì)量評估,在其功能位點(diǎn)預(yù)測中,新麥草CKX4蛋白存在Leu(亮氨酸)殘基和組氨酸殘基位點(diǎn),GHS基序的存在可能在降解CK的反應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮作用,從而影響CKX4基因調(diào)控新麥草的相關(guān)表型。新麥草中Leu(亮氨酸)殘基位點(diǎn)主要為L223,楊樹(PopulusL.)CKX中存在高度保守的L492殘基,用于構(gòu)建對順式玉米素(cZ)類CK具有修飾特異性的細(xì)胞分裂素脫氫酶變體,因?yàn)閏Z衍生物與生長受限的發(fā)育階段相關(guān),過表達(dá)這些變體的植物可用于揭示cZ衍生物在植物生長中的作用,所以該殘基可能是分子操作的潛在目標(biāo),推測新麥草該類殘基對其生長特性有一定的作用[27]。此外,亮氨酸殘基在CKX中主要影響催化降解細(xì)胞分裂素過程中的氧化反應(yīng)速率[24,27],新麥草CKX4中Leu殘基的存在可能是影響催化降解細(xì)胞分裂素過程氧化反應(yīng)速率的主要因素,進(jìn)而也是影響CKX4蛋白功能的重要結(jié)構(gòu)。

RNA-Seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)DT型的新麥草中CKX4基因相對表達(dá)量顯著偏低,與qRT-PCR結(jié)果相符,該研究方式同紫花苜蓿(MedicagosativaL.)[28]、草地早熟禾(PoapratensisL.)[29]及狗尾草(Setariaviridis)[30]等物種相關(guān)基因表達(dá)分析方式相同,通過對不同分蘗型新麥草不同組織中的CKX4基因相對表達(dá)量分析顯示,分蘗節(jié)中CKX4基因相對表達(dá)量高于其他組織,這可能由于CKX4基因下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞分裂素脫氫酶活性下降,從而降低CKX4對細(xì)胞分裂素的降解作用,促進(jìn)新麥草產(chǎn)生更多分蘗。這與石斛蘭(Dendrobium)[31]DSCKX1基因研究相似,在過量表達(dá)DSCKX1基因的石斛蘭和擬南芥(Arabidopsisthaliana)中,細(xì)胞分裂素含量會隨著細(xì)胞分裂素氧化酶活性水平的升高而降低,從而會產(chǎn)生細(xì)胞分裂素缺失的植株表型。植物不同器官中的細(xì)胞分裂素脫氫酶活性不同[32],CKX的活性調(diào)節(jié)與其在細(xì)胞中的濃度相關(guān)[33]。有研究表明CKX在參與植物脅迫反應(yīng)時(shí),細(xì)胞分裂素脫氫酶活性在脅迫植物的葉和根中受到強(qiáng)烈刺激而增強(qiáng),并與細(xì)胞分裂激素的負(fù)調(diào)節(jié)相吻合[34],說明新麥草的CKX4蛋白可能通過參與細(xì)胞分裂素脫氫酶反應(yīng)的過程進(jìn)而影響新麥草的生長發(fā)育。

新麥草CKX4亞細(xì)胞定位于細(xì)胞內(nèi),與水稻(OryzasativaL.)[35]OsCKX3定位一致,OsCKX3推測定位于高爾基體,歐李(Cerasushumilis)[36]ChCKX4定位于質(zhì)膜中,ChCKX4基因家族中部分成員定位于細(xì)胞質(zhì)中,蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)[37]MtCKX定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核上。綜上所述,新麥草CKX4定位與禾本科植物水稻定位圖相似,故推測新麥草CKX4可能也定位于高爾基體中。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示CKX4-YFP能在煙草中正常表達(dá),說明CKX4于目的植物中可正常轉(zhuǎn)化表達(dá),為CKX4基因調(diào)控改進(jìn)新麥草分蘗數(shù)和產(chǎn)量提供了理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

4 結(jié)論

研究通過PCR方法成功克隆了新麥草CKX4基因;新麥草與小麥等麥類作物具有高度同源性;新麥草CKX4蛋白存在FAD相關(guān)的GHS基序的組氨酸殘基和Leu(亮氨酸)殘基位點(diǎn);通過RNA-Seq分析及qRT-PCR驗(yàn)證均發(fā)現(xiàn)在疏蘗型新麥草中CKX4基因表達(dá)量相對更高,說明該蛋白在調(diào)控新麥草生長發(fā)育中起關(guān)鍵作用。煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)染與蛋白質(zhì)印記分析均顯示CKX4-YFP可在煙草中正常表達(dá),亞細(xì)胞定位于細(xì)胞內(nèi)。本研究將為新麥草產(chǎn)量性狀精準(zhǔn)改良提供理論依據(jù)和參考。