美洲狼尾草HXK基因家族鑒定及表達(dá)

祝詩詞, 葉歆雅, 王凈潔, 阿布都沙拉木, 范欲航, 黃琳凱

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科技學(xué)院, 四川 成都 610000)

己糖激酶是參與糖酵解第一步反應(yīng)的不可逆酶[1]。糖酵解途徑又稱EMP途徑,是將葡萄糖或糖原進(jìn)行分解代謝,并伴有能量生成的反應(yīng)途徑[2-3]。己糖激酶主要是將細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖催化磷酸化生成6-磷酸葡萄糖(Glc-6-P)[4],達(dá)到活化葡萄糖的目的,有利于完成進(jìn)一步的分解、合成代謝[5]。己糖激酶可以催化葡萄糖、果糖及氨基葡萄糖等發(fā)生不可逆的磷酸化反應(yīng),生成相應(yīng)的6-磷酸酯,是植物呼吸代謝過程中的關(guān)鍵酶之一[2,6]。它也可將對(duì)葡萄糖的感受與來自激素、蔗糖、光照和應(yīng)激信號(hào)組成一個(gè)信號(hào)網(wǎng)絡(luò),參與響應(yīng)非生物脅迫,對(duì)植物體的生長發(fā)育和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起調(diào)節(jié)作用[7-8]。

己糖激酶可從多種植物體內(nèi)獲得,在高等植物中具有多樣化的酶活性調(diào)控機(jī)制和基因表達(dá)。Karve等[9]研究中發(fā)現(xiàn)植物HXK基因均以多基因家族形式存在。其中,在雙子葉植物中,如枇杷(Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.),7個(gè)HXK基因家族的成員因其能催化己糖磷酸化,參與調(diào)控糖代謝過程,促進(jìn)植株生長發(fā)育的作用而被廣泛研究[10]。除此之外,HXK基因也在其他雙子葉植物中開展了研究,如擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.)Heynh)中有6個(gè)家族成員[11],番茄(SolanumlycopersicumL)有4個(gè)家族成員[12]等,在單子葉植物中,如水稻(OryzasativaL.)有10個(gè)家族成員[13],玉米(ZeamaysL.)有9個(gè)家族成員[14],苔蘚植物中已糖激酶基因家族成員相對(duì)較多,如小立碗蘚(Physcomitrellapatens)有11個(gè)家族成員[15]。此外還在茶樹[16]、葡萄[17-18]、桂花[19-20]和煙草[21]中進(jìn)行的試驗(yàn)表明,大多數(shù)HXK蛋白與線粒體外膜結(jié)合,在糖酵解中發(fā)揮作用[22]。脅迫過程中,NBhxk1、AThxk1和AThxk2基因能響應(yīng)甲基紫精和病原體侵染誘導(dǎo)的氧化脅迫,高水平的HXK能增強(qiáng)對(duì)氧化脅迫的抵抗力;AThxk2和AThxk3基因能在低溫、高鹽處理下表達(dá)上調(diào);麻風(fēng)樹JChxk1、JChxk2和JChxk1基因在葉片內(nèi)同樣能響應(yīng)低溫而誘導(dǎo)表達(dá);油菜BNhxk1、BNhxk3和BNhxk9基因能響應(yīng)核盤菌在抗性品種內(nèi)的侵染而表達(dá)顯著上調(diào)[19]。目前,未見美洲狼尾草HXK基因功能有關(guān)的研究報(bào)道。

美洲狼尾草(Pennisetumglaucum(L.)R.Br.),又名御谷,一年生草本植物,是一種在糧食栽培與飼料利用等領(lǐng)域具有高效產(chǎn)能的優(yōu)質(zhì)牧草,其具有生長速度快、抗旱能力強(qiáng)、抗逆性高[3,23]、耐瘠薄能力強(qiáng)等特點(diǎn),其分布最廣的地區(qū)是在中非與西非的熱帶草原[24],而干旱、鹽脅迫等是影響美洲狼尾草品質(zhì)和產(chǎn)量的重要因素[25]。

本研究采用Blastp、hmmer以及關(guān)鍵字檢索三種方法鑒定出12個(gè)美洲狼尾草HXK基因,系統(tǒng)地分析了美洲狼尾草HXK基因家族成員的理化特性、染色體定位、多序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和保守基序、順式作用元件以及鹽和干旱脅迫下的表達(dá)模式,來揭示HXK基因的特征,為進(jìn)一步深入探討美洲狼尾草中HXK基因家族的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 美洲狼尾草HXK基因家族成員鑒定

本研究所使用的美洲狼尾草基因組數(shù)據(jù)、蛋白序列文件從美洲狼尾草全基因組數(shù)據(jù)庫(http://117.78.45.2:91/home)中獲得。為鑒定美洲狼尾草中HXK的基因家族成員,從pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)獲得HXK基因的保守結(jié)構(gòu)域文件Hexokinase_1、Hexokinase_2(PF00349、PF03727)[26],通過Linux系統(tǒng)中的hmmer軟件構(gòu)建隱馬可夫模型,搜索含有對(duì)應(yīng)保守結(jié)構(gòu)域的候選蛋白序列;利用美洲狼尾草的全基因組序列構(gòu)建本地BLASTP數(shù)據(jù)庫,以擬南芥、水稻和玉米的HXK基因家族成員比對(duì)得到美洲狼尾草HXK家族的候選成員,閾值設(shè)為E<0.001[27];在美洲狼尾草全基因組數(shù)據(jù)庫(http://117.78.45.2:91/search)中以HXK與Hexokinase為關(guān)鍵字進(jìn)行檢索獲得HXK基因家族的候選成員。合并上述所有候選成員并進(jìn)行去重復(fù)與去冗余工作,再利用NCBI CD-search在線工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)去除無典型HXK結(jié)構(gòu)域[28]的序列,最終鑒定到美洲狼尾草的HXK基因家族成員。

1.2 HXK基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及蛋白性質(zhì)預(yù)測

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載擬南芥、玉米和水稻相對(duì)應(yīng)的HXK蛋白序列,利用MEGA 7.0軟件對(duì)美洲狼尾草、擬南芥、水稻和玉米展開分析[29],使用Clustal W對(duì)這四種物種的HXK蛋白序列進(jìn)行多序列聯(lián)配比對(duì),并利用最大似然法(Maximum Likelihood estimation)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,Model/Method參數(shù)設(shè)置為”Possion model”,Gaps,missing Data Treatment參數(shù)設(shè)置為”Partial deletion”,Bootstrap校驗(yàn)參數(shù)為1 000,使用Figtree v1.4.4對(duì)結(jié)果文件進(jìn)行調(diào)整。最后,利用EXPASY(https://web.expasy.org/protparam/)[30]在線工具對(duì)美洲狼尾草HXK基因家族蛋白的相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測,包括氨基酸數(shù)量、相對(duì)分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂溶系數(shù)、親水性平均值等屬性。

1.3 HXK基因順式作用元件分析

在基因組數(shù)據(jù)庫中,利用Linux系統(tǒng)自帶的檢索功能獲取HXK家族基因上游1 500 bp的序列,使用PlantCARE[31]網(wǎng)站預(yù)測該序列范圍內(nèi)的啟動(dòng)子元件,采用GSDS 2.0在線工具(http://gsds.gao-lab.org/index.php)與excel構(gòu)圖功能將預(yù)測結(jié)果繪制成HXK基因家族的順勢作用元件柱狀圖。

1.4 美洲狼尾草HXK基因家族蛋白結(jié)構(gòu)域及轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)美洲狼尾草全基因組數(shù)據(jù)庫(http://117.78.45.2:91/home)注釋文件gff,利用Linux自帶的檢索功能獲得了HXK基因家族的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù);利用NCBI CD-search在線工具對(duì)HXK基因家族成員進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析,獲得了所有HXK基因的蛋白保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)。利用Tbtools軟件的Gene Structure View工具對(duì)得到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)與蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)進(jìn)行共建分析。

1.5 HXK基因motif分析與染色體位置定位

利用Linux系統(tǒng)的MEME軟件對(duì)美洲狼尾草HXK家族成員的蛋白序列進(jìn)行motif基序分析,nmotif參數(shù)設(shè)置為10,minw參數(shù)設(shè)置為6,maxw參數(shù)設(shè)置為50,分析結(jié)果利用Tbtools軟件可視化。從美洲狼尾草全基因組數(shù)據(jù)庫提取PI537069的全基因組注釋文件,通過Linux自帶的檢索功能提取HXK家族成員的染色體位置信息,利用MG2C v2.1在線工具(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/)繪制染色體定位圖。

1.6 美洲狼尾草HXK基因家族的表達(dá)分析

基于美洲狼尾草全基因組數(shù)據(jù)庫(http://117.78.45.2:91/tools/geneexpression/)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),將美洲狼尾草中的HXK基因在不同組織器官、不同脅迫條件下的表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析,利用Tbtools軟件的Heatmap工具完成進(jìn)一步的對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化、標(biāo)準(zhǔn)化和聚類分析等工作,分析結(jié)果包含基因在根、莖、葉、穗和胚共五種組織中的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 美洲狼尾草HXK基因家族的鑒定及特性

共鑒定到12個(gè)美洲狼尾草HXK基因,為其命名PMhxk-1至PMhxk-12(表1)。PMhxk氨基酸數(shù)量介于108～590之間;蛋白質(zhì)分子量介于12 016.81～63 510.52Da之間;理論等電點(diǎn)介于4.63～9.74之間,其中理論等電點(diǎn)大于7的僅有PMhxk-5,PMhxk-7,PMhxk-8,PMhxk-11四個(gè)蛋白,屬于堿性蛋白,其他8個(gè)蛋白為酸性;不穩(wěn)定指數(shù)位于29.41～61.37之間,差異明顯,其中PMhxk-2、PMhxk-3、PMhxk-6、PMhxk-7、PMhxk-8、PMhxk-9、PMhxk-10、PMhxk-12的不穩(wěn)定系數(shù)小于40,具有穩(wěn)定性;脂肪系數(shù)變化范圍為48.24～110.65;親水性平均值介于-0.937～0.401之間,其中PMhxk-1,PMhxk-4,PMhxk-5,PMhxk-7,PMhxk-10具有親水性。

表1 美洲狼尾草HXK基因家族成員基本信息Table 1 basic information of HXK gene family members of Pennisetum glaucum

2.2 美洲狼尾草HXK基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

基于MEGA7軟件,對(duì)美洲狼尾草、擬南芥、水稻和玉米的HXK基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析,并構(gòu)建了進(jìn)化樹圖。如圖1所示,根據(jù)分支關(guān)系,美洲狼尾草HXK基因被分為4個(gè)亞組,其中Ⅱ亞組分布的美洲狼尾草HXK基因家族成員最多,包含5個(gè)成員(PMhxk-1、PMhxk-2、PMhxk-4、PMhxk-9、PMhxk-11),其次為Ⅰ亞組與Ⅳ亞組,分別包含3個(gè)成員(Ⅰ亞組:PMhxk-6、PMhxk-10、PMhxk-12;Ⅳ亞組:PMhxk-3、PMhxk-7、PMhxk-8)而Ⅲ亞組分布的成員最少,只有一個(gè)成員(PMhxk-5)。

圖1 美洲狼尾草HXK基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of HXK gene family in Pennisetum glaucum

2.3 美洲狼尾草HXK基因家族順式作用元件分析

鑒定HXK轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控元件,基于Plant CARE數(shù)據(jù)庫,對(duì)美洲狼尾草HXK基因上游1 500 bp序列進(jìn)行作用元件的預(yù)測,美洲狼尾草HXK基因的啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)與植物生長發(fā)育和逆境響應(yīng)相關(guān)的調(diào)控元件(圖2),共有16種順式作用元件類型(圖3),根據(jù)注釋信息大致分為光響應(yīng)元件(F2)、逆境脅迫調(diào)控元件(F3,F4,F7,F12)、植物生長調(diào)控元件(F1,F5,F6,F8,F9,F10,F11,F13,F14,F15,F16)3類,其中光響應(yīng)元件的占比最大且在每個(gè)成員中均有分布,每個(gè)成員都具有脅迫響應(yīng)元件中的厭氧響應(yīng)位點(diǎn)。植物生長調(diào)控元件中多數(shù)為植物激素調(diào)控的位點(diǎn),包括茉莉酸響應(yīng)、生長素響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)等。大量植物激素的作用位點(diǎn)預(yù)示著多種生命活動(dòng)的響應(yīng)途徑,這表明HXK基因在美洲狼尾草的生長發(fā)育與逆境響應(yīng)過程中具有潛在的功能。

圖2 美洲狼尾草HXK基因啟動(dòng)子區(qū)域中的調(diào)控元件Fig.2 Regulatory Elements in the HXK Gene Promoter Region of Pennisetum glaucum注:F1,茉莉酸響應(yīng);F2,光響應(yīng);F3,無氧響應(yīng);F4,低溫響應(yīng);F5,玉米醇溶蛋白;F6,分生組織;F7,干旱響應(yīng);F8,水楊酸響應(yīng);F9,脫落酸響應(yīng);F10,生長素響應(yīng);F11,種子特異性;F12,防御與應(yīng)激響應(yīng);F13,免疫應(yīng)答響應(yīng);F14,晝夜節(jié)律調(diào)控;F15,柵欄葉肉細(xì)胞;F16,細(xì)胞周期調(diào)控。下同Note:F1,MeJa responsive;F2,Light responsive;F3,Anaerobic responsive;F4,Low-temperature responsive;F5,Zein metabolism;F6,Meristem expression;F7,Drought responsive;F8,SA responsive;F9,ABA responsive;F10,IAA responsive;F11,Seed responsive;F12,Defense and stress responsive;F13,Immune responsive;F14,Circadian control;F15,Differentiation of the palisade mesophyll cells;F16,Cell cycle regulation.The same as below

圖3 美洲狼尾草HXK基因啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測Fig.3 Prediction of cis-acting elements of HXK gene promoter in Pennisetum glaucum

2.4 美洲狼尾草HXK基因家族基因結(jié)構(gòu)與蛋白保守序列分析

分析美洲狼尾草HXK基因之間的轉(zhuǎn)錄組結(jié)構(gòu)成分,基于NCBI CD-search及MEME分析HXK基因的外顯子與內(nèi)含子的分布、保守motifs,再基于轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)以及蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù),利用Tbtools軟件的GeneStructureView工具進(jìn)行共建分析。分析結(jié)果如圖4所示:各基因成員均存在外顯子和內(nèi)含子,但成員之間存在差異化的結(jié)構(gòu),其中PMhxk-9含有一個(gè)超長的內(nèi)含子,所有成員的外顯子數(shù)量介于1～9個(gè)之間。PMhxk-1,PMhxk-4,PMhxk-5僅含有2個(gè)外顯子,而PMhxk-5含有1個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子,PMhxk-10,PMhxk-3,PMhxk-6,PMhxk-7,PMhxk-8含有外顯子數(shù)量最多,含有9個(gè),而PMhxk-3,PMhxk-6,PMhxk-7含有內(nèi)含子數(shù)量最多,含有9個(gè)。此外,同一亞組內(nèi)的外顯子和內(nèi)含子的分布模式相似,而外顯子的位置在亞組之間存在顯著差異,這種亞組之間的差異與系統(tǒng)進(jìn)化分析中的分組規(guī)律一致。根據(jù)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)美洲狼尾草HXK蛋白僅有一個(gè)蛋白保守結(jié)構(gòu)域(PLN02914 superfamily)(圖4),5個(gè)基因(PMhxk-1,PMhxk-3,PMhxk-4,PMhxk-7,PMhxk-12)同時(shí)含有5′端和3′端非翻譯區(qū)(UTR),5個(gè)基因(PMhxk-2,PMhxk-5,PMhxk-9,PMhxk-10,PMhxk-11)不含UTR區(qū),基因PMhxk-8僅含有3′端非翻譯區(qū)(UTR),基因PMhxk-6僅含有5′端非翻譯區(qū)(UTR)。

圖4 美洲狼尾草HXK基因家族結(jié)構(gòu)及聚類分析Fig.4 HXK gene family structure and cluster analysis of Pennisetum glaucum

圖5 美洲狼尾草HXK基因家族結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Analysis of HXK gene family structure of Pennisetum glaucum

2.5 美洲狼尾草HXK基因motif分析

分析PMhxk家族具有一定特征的蛋白超二級(jí)結(jié)構(gòu)(motif),基于Linux系統(tǒng)MEME軟件對(duì)美洲狼尾草HXK家族成員的蛋白保守motif特征進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)美洲狼尾草HXK蛋白的motif結(jié)構(gòu)之間有一定的差異性和相似性,共鑒定得到10個(gè)比較保守的基序(Motif1-Motif10)(圖6,圖7)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)類型大致分為三類,只含有motif5、motif2的單基序結(jié)構(gòu)(PMhxk-4,PMhxk-1,PMhxk-11),含有少量motif的片段結(jié)構(gòu)(PMhxk-5,PMhxk-9,PMhxk-2)和含有多個(gè)motif組合的多基序結(jié)構(gòu)(PMhxk-3,PMhxk-12,PMhxk-10,PMhxk-6,PMhxk-7,PMhxk-8)。根據(jù)進(jìn)化分析的分組依據(jù),發(fā)現(xiàn)僅含有一個(gè)motif結(jié)構(gòu)的HXK成員均來自Ⅱ亞組,而含有多個(gè)連續(xù)motif結(jié)構(gòu)的HXK成員均來自Ⅰ亞組與Ⅳ亞組,在這些連續(xù)motif基序中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)較為保守的片段結(jié)構(gòu),分別是motif2-motif5-motif6-motif2和motif7-motif4-motif8-motif3-motif9-motif1片段,其出現(xiàn)在Ⅰ亞組和Ⅳ亞組的所有HXK蛋白結(jié)構(gòu)中。

圖6 美洲狼尾草HXK基因家族蛋白特征分析Fig.6 Analysis of protein characteristics of HXK gene family in Pennisetum glaucum

圖7 美洲狼尾草HXK基因家族蛋白的10個(gè)保守結(jié)構(gòu)域Fig.7 The conserved domains of HXK gene family proteins in Pennisetum glaucum

2.6 美洲狼尾草HXK基因家族染色體定位分析

基于MG2Cv2.1分析網(wǎng)站,對(duì)PMhxk家族的12個(gè)基因進(jìn)行染色體定位分析(圖8),發(fā)現(xiàn)HXK基因僅分布在美洲狼尾草的1,2,5,6,7號(hào)染色體上且每條染色染上基因數(shù)量分布不均勻,其中,1號(hào)染色體上染色體分布最多,共有5個(gè)基因,而第2,7號(hào)染色體上的基因成員最少,均只有1個(gè)。

圖8 美洲狼尾草HXK基因家族染色體定位圖Fig.8 Chromosome mapping of HXK gene family in Pennisetum glaucum

2.7 美洲狼尾草不同組織中的PMhxk基因表達(dá)

將美洲狼尾草HXK基因家族的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析后,結(jié)果如圖9所示,從不同植物組織中HXK基因家族成員的表達(dá)量差異來看,在植物的穗組織中,六個(gè)成員表達(dá)量顯著,數(shù)值均大于0.5,分別是:PMhxk-6,PMhxk-12,PMhxk-11,PMhxk-9,PMhxk-10,PMhxk-3,占據(jù)基因家族成員數(shù)量的一半;而在種子中除了PMhxk-6與PMhxk-12外整體呈現(xiàn)低表達(dá)量趨勢;在分蘗期根組織中僅有PMhxk-7表現(xiàn)出較為明顯的高表達(dá)量,且相較于該基因在其他組織中的表達(dá)量差異顯著。從不同亞組之間的表達(dá)差異來看,Ⅰ亞組的差異變化最為明顯,其所有成員在穗組織中均有較高的表達(dá),在根組織中的表達(dá)量也明顯高于其他亞組;于Ⅰ亞組相比,Ⅱ亞組的表達(dá)上調(diào)事件并不顯著,但是其成員PMhxk-1、PMhxk-2、PMhxk-4在穗、葉、莖、根和分蘗組織中均有穩(wěn)定的表達(dá)。綜上分析,我們發(fā)現(xiàn)美洲狼尾草的HXK基因的高表達(dá)主要集中在抽穗期的穗組織中,這表明該基因可能參與穗組織的生長與發(fā)育調(diào)控,并在美洲狼尾草籽粒成熟時(shí)期行使一定的生物功能。

圖9 美洲狼尾草不同組織PMhxk基因表達(dá)Fig.9 Expression of PMhxk gene in different tissues of Pennisetum glaucum

2.8 PMhxk基因表達(dá)分析

為探究PMhxk基因在干旱和鹽脅迫下的潛在功能,我們采用美洲狼尾草非生物脅迫處理下的RNA-seq數(shù)據(jù)集,選取脅迫處理的時(shí)間分布為0到144小時(shí)(圖10),以達(dá)到檢測PMhxk基因的轉(zhuǎn)錄豐度的目的。結(jié)果表明,PMhxk基因在干旱和鹽脅迫處理下存在差異基因。在葉片干旱脅迫144 h后,有4個(gè)PMhxk基因表達(dá)上調(diào),其中PMhxk-6和PMhxk-12顯著上調(diào),同時(shí)有3個(gè)PMhxk基因在葉片中顯著下調(diào);在根組織干旱脅迫144 h后,有2個(gè)基因表達(dá)上調(diào),有7個(gè)PMhxk基因表達(dá)下調(diào),其中PMhxk-7下調(diào)較為顯著。此外在干旱脅迫過程中還有7個(gè)基因表達(dá)呈現(xiàn)先增加再降低的趨勢,例如PMhxk-8與PMhxk-2在葉片干旱誘導(dǎo)48 h時(shí)顯著上調(diào)、144 h時(shí)顯著下調(diào),PMhxk-4在根組織干旱誘導(dǎo)96 h時(shí)上調(diào)表達(dá)、144 h時(shí)顯著下調(diào)。在鹽脅迫過程中我們發(fā)現(xiàn)多數(shù)PMhxk基因表達(dá)呈現(xiàn)先增加后降低或者先降低后增加的趨勢。在葉片中PMhxk-1和PMhxk-5均在3 h和96 h顯著上調(diào)而144 h時(shí)又呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá),在根組織中PMhxk-2、PMhxk-4、PMhxk-9均在48 h時(shí)顯著上調(diào)。PMhxk基因?qū)τ诿{迫誘導(dǎo)較為敏感,并在脅迫處理的早期呈現(xiàn)差異表達(dá),例如PMhxk-12在兩種脅迫誘導(dǎo)1 h的根組織中均表現(xiàn)出顯著的上調(diào)表達(dá),PMhxk-4在鹽脅迫誘導(dǎo)1 h的葉片中顯著下調(diào)表達(dá)。根據(jù)PMhxk基因在這兩種脅迫誘導(dǎo)下的差異表達(dá)可以說明美洲狼尾草在面對(duì)高溫和高鹽的環(huán)境壓力時(shí)能夠產(chǎn)生響應(yīng),同時(shí)也表明PMhxk基因可能在美洲狼尾草耐旱耐鹽的機(jī)制中有一定的貢獻(xiàn)。

圖10 美洲狼尾草在干旱、鹽脅迫處理下HXK的相對(duì)表達(dá)量Fig.10 Relative expression of HXK in Pennisetum glaucum under drought and salt stress注:L,葉組織;R,根組織;0-144(h) 脅迫處理的時(shí)間(小時(shí))Note:L,leaves;R,root;0-144(h),Time for coerion treatment(h)

3 討論

己糖激酶具有催化己糖磷酸化的作用,在植物的糖感知和糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中扮演重要的角色[32],是植物體呼吸代謝過程中的關(guān)鍵酶之一[33],正是基于其重要的生物學(xué)功能,有關(guān)己糖激酶的研究在植物育種領(lǐng)域逐漸成為熱點(diǎn)[3]。

3.1 美洲狼尾草HXK基因家族成員鑒定分析

本研究從美洲狼尾草全基因組數(shù)據(jù)庫中分離并鑒定出12個(gè)美洲狼尾草HXK基因家族成員,已知幾種作物中的HXK家族成員數(shù)量,擬南芥中6個(gè)HXK基因[11]、水稻中10個(gè)HXK基因[13]、玉米中9個(gè)HXK基因[14],其數(shù)量特征較為穩(wěn)定,雖為基數(shù)較小的亞家族,但是不同物種之間卻沒有特別大的數(shù)量差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)該特征與同為單子葉的禾本科植物比較更為明顯,可能是因?yàn)镠XK是一種參與植物生命活動(dòng)的關(guān)鍵基因,其始終伴隨植物的生命形態(tài)變化及進(jìn)化過程。

3.2 HXK基因染色體位置定位和順式作用元件分析

在多數(shù)作物物種中,HXK基因家族成員的染色體分布均位于3-5條染色體上,例如擬南芥、水稻與玉米[26],而PMhxk具有相似的特征,其成員共分布于5條染色體中,且多位于染色體的上下兩端。在順式作用元件分析中,研究發(fā)現(xiàn)大部分成員都具有厭氧響應(yīng)位點(diǎn),這表明面對(duì)一些代謝損傷的脅迫環(huán)境,HXK家族與其相關(guān)的調(diào)節(jié)過程有密切關(guān)系。此外,大部分HXK基因啟動(dòng)子還具有生長素響應(yīng)、水楊酸響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)位點(diǎn),這與其他植物中報(bào)道的一致。其中,谷子SIhxk家族成員中就含有大量與植物激素響應(yīng)、光反應(yīng)和逆境脅迫相關(guān)的作用元件[26]。

3.3 HXK基因motif分析

美洲狼尾草HXK基因家族中有5個(gè)成員具有9個(gè)外顯子片段,這種外顯子的數(shù)量特征與幾種其他植物的HXK家族特征一致[13-14,26],在谷子中,除SIhxk3的所有SIhxk基因均含有9個(gè)外顯子編碼[26],這一特點(diǎn)再一次的說明HXK基因家族是一種關(guān)鍵基因,其在生命形態(tài)變化及進(jìn)化過程中相當(dāng)保守。同時(shí)本研究中的結(jié)構(gòu)分析顯示,PMhxk家族同一亞組內(nèi)的外顯子和內(nèi)含子分布模式極為相似,其中Ⅳ亞組中所有成員的外顯子具有相同的數(shù)量。在保守基序的分析過程中,結(jié)果顯示僅含有一個(gè)motif結(jié)構(gòu)的HXK成員均來自Ⅱ亞組,Ⅰ亞組和Ⅳ亞組的所有HXK蛋白結(jié)構(gòu)中均出現(xiàn)了兩個(gè)較為保守的連續(xù)motif結(jié)構(gòu),這表明具有保守功能結(jié)構(gòu)的HXK基因可能行使相同方向的功能或是彼此協(xié)同作用共同調(diào)控。綜上,在基因家族的常規(guī)分析中,本研究發(fā)現(xiàn)美洲狼尾草HXK基因保守且穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)特征預(yù)示著該家族成員參與植物關(guān)鍵的功能調(diào)控過程,并且在進(jìn)化關(guān)系上也趨于穩(wěn)定,這進(jìn)一步的體現(xiàn)HXK基因家族具有一定的研究價(jià)值。

3.4 非生物脅迫誘導(dǎo)HXK基因的表達(dá)分析

一些研究表明,HXK基因在植物不同組織間的表達(dá)量有所差異,對(duì)植物的各個(gè)器官起不同的調(diào)控作用[12,13]。水稻多數(shù)HXK在水稻的未成熟的種子、莖、葉片、花中均有表達(dá);茶樹CShxk大都在葉片中的高表達(dá),在根組織和種子中低表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)美洲狼尾草其成員表達(dá)量顯著上調(diào)的事件主要發(fā)生在植物的穗組織中,而在種子和根組織中整體表現(xiàn)出一個(gè)明顯的低表達(dá)量趨勢,這表明該基因可能在美洲狼尾草籽實(shí)成熟過程發(fā)揮著重要作用。

此外,HXK廣泛參與植物非生物脅迫響應(yīng)過程,例如過表達(dá)擬南芥AThxk1和AThxk2可顯著提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)氧化脅迫的耐受性[11];茶樹HXK面臨高溫、干旱等逆境時(shí),將提高HXK的轉(zhuǎn)錄水平[16]。本研究也有類似的結(jié)果,即美洲狼尾草在鹽和干旱脅迫處理后,發(fā)現(xiàn)美洲狼尾草HXK基因家族在面對(duì)干旱和高鹽的環(huán)境壓力時(shí)能夠產(chǎn)生響應(yīng),大多數(shù)基因的相對(duì)表達(dá)量在不同非生物脅迫條件下均會(huì)上調(diào),其中干旱處理下,在根組織中PMhxk-2、PMhxk-4、PMhxk-9均在48 h時(shí)顯著上調(diào),在葉片中有4個(gè)PMhxk基因在144 h時(shí)上調(diào)表達(dá)。在鹽處理下,美洲狼尾草葉片中的PMhxk-5、PMhxk-1、PMhxk-8,根中的PMhxk-7、PMhxk-3、PMhxk-6、PMhxk-11、PMhxk-12、PMhxk-4、PMhxk-9、PMhxk-2在幾乎每一個(gè)處理時(shí)間下相對(duì)表達(dá)量均上調(diào)。根據(jù)PMhxk基因在這兩種脅迫誘導(dǎo)下的差異表達(dá)表明PMhxk基因可能在美洲狼尾草耐旱耐鹽的機(jī)制中有一定的貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

本文利用生物信息學(xué)方法對(duì)美洲狼尾草HXK基因家族進(jìn)行了分析,鑒定出12個(gè)美洲狼尾草PMhxk基因成員,得到兩個(gè)較為保守的motif片段,發(fā)現(xiàn)基因成員集中表達(dá)于抽穗期的穗組織中,部分PMhxk成員在干旱脅迫和鹽脅迫中出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)。綜上,本研究為美洲狼尾草HXK基因家族進(jìn)一步的功能研究提供了有力參考。