一株彎曲固氮菌對(duì)多環(huán)芳烴的降解特性研究

張宏宏 葉晨 張曉昀 孟恬 王黎明 黃玉屏

[摘 要]微生物修復(fù)在多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs）污染治理方面有著優(yōu)良特性。為了獲得高效降解PAHs的微生物，以熒蒽為唯一碳源進(jìn)行篩選，分離得到一株高效降解細(xì)菌，命名為CE3。經(jīng)16S rDNA序列分析法鑒定，菌株CE3屬于彎曲固氮菌屬（Azoarcus），這是首次發(fā)現(xiàn)該屬菌株對(duì)高分子量PAHs具有降解能力。菌株CE3除了能降解熒蒽，還能降解苯、菲、芘、熒蒽、苯并[a]蒽、3-4苯并芘和苯并[b]熒蒽，且對(duì)熒蒽和芘的降解率較高，均達(dá)到50%以上。分析各種條件對(duì)CE3菌降解熒蒽和芘的影響，發(fā)現(xiàn)CE3菌能在較廣的溫度和pH范圍降解熒蒽或芘，并且添加酵母提取物、蔗糖和果糖可使CE3菌降解能力提高。

[關(guān)鍵詞]多環(huán)芳烴；熒蒽；芘；降解；彎曲固氮菌

[中圖分類號(hào)]Q939.99; X53[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs）是一類含有兩個(gè)及兩個(gè)以上苯環(huán)的有機(jī)化合物，具有遺傳毒性、致突變性、致癌性、生物蓄積性和化學(xué)穩(wěn)定性^[1-3]，是我國農(nóng)用和居住用地土壤評(píng)估的重要指標(biāo)之一。根據(jù)環(huán)數(shù)的不同，PAHs可以分為高分子量PAHs（4環(huán)及以上）和低分子量PAHs（2～3環(huán)），且高分子量PAHs比低分子量PAHs具有更高的穩(wěn)定性、更強(qiáng)的致癌性、致畸性和致突變性，對(duì)人類健康和生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的危害更大^[4-5]。我國大部分地區(qū)表層土壤中整體上都含有一定量的PAHs，并多處于中度污染水平，其中4環(huán)的PAHs熒蒽和芘含量較高，2環(huán)的PAHs含量較低^[6]。例如本研究的供試土壤采樣區(qū)湖北黃石新冶鋼有限公司東鋼廠區(qū)，其焦化車間受到的多環(huán)芳烴污染十分嚴(yán)重，其中大部分為高分子量多環(huán)芳烴污染物。由于在環(huán)境中低分子量的PAHs比高分子量的容易降解，因此對(duì)高分子量PAHs的污染治理非常重要。在PAHs污染治理方法中，微生物治理方法因其環(huán)境友好、成本低、高效等特點(diǎn)，成為了PAHs污染治理的熱點(diǎn)^[7]。然而，目前分離到的降解高分子量PAHs菌株非常有限，對(duì)其降解機(jī)制所知甚少。為此，迫切需要分離更多的高分子量PAHs降解菌，探明它們對(duì)高分子量PAHs的代謝機(jī)制，從而加快微生物在環(huán)境污染治理和修復(fù)中的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品的采集 本研究所用土壤樣品采自湖北省黃石市新冶鋼有限公司東鋼廠焦化車間，取距表層10 cm下的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

1）無機(jī)鹽培養(yǎng)基 （1 L）：338.8 mg KH₂PO₄、234.0 mg （NH₄）₂SO₄、100.0 mg Na₂CO_3、3.9 mg CaCl₂、59.3 mg MgSO₄·7H₂O、890.7 mg Na₂HPO₄·12H₂O、0.3 mg FeSO₄·7H₂O，1 mL 微量元素母液。

2）微量元素母液（1 L）：1500 mg FeCl₂·4H₂O、190 mg CoCl₂·6H₂O、100 mg MnSO₄·7H₂O、70 mg ZnCl₂、24 mg NiCl₂·6H₂O、24 mg NaMoO₄·2H₂O、6 mg MnCl₂·4H₂O、2 mg CuCl₂·2H₂O。

1.1.3 試劑與儀器 除上述培養(yǎng)基配方中的化學(xué)試劑（購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）外，本研究試劑主要有：菲、熒蒽、芘、3-4苯并芘、苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽、丙酮、二氯甲烷（分析純）、甲醇（色譜純）（購自阿拉丁工業(yè)公司）。本研究所用實(shí)驗(yàn)儀器包括島津UV2500型分光光度計(jì)、Agilent 1200高效液相色譜儀、Ultimate PAH高效液相色譜柱（5 μm， 250 mm×4.6 mm）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多環(huán)芳烴降解菌的分離純化 稱取10 g混合土壤樣品，加入90 mL無菌水和適量玻璃珠振蕩3 h；靜置待土壤沉降后，取10 mL上清液接入加有熒蒽的90 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。每次均按10％的體積比移取培養(yǎng)液接入新鮮的液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，進(jìn)行富集培養(yǎng)，共重復(fù)5次。富集培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基中熒蒽的濃度依次為10、20、40、60、80 mg/L。之后，將培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋涂布，并將單菌落在平板上進(jìn)一步劃線分離純化。

1.2.2 降解菌的鑒定

1）菌株形態(tài)特征的觀察：a）挑取單菌落分別在LB平板和含有熒蒽的無機(jī)鹽平板上劃線，30℃培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭氏染色。b）將菌株接入含有熒蒽的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)，觀察其在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的生長狀態(tài)。

2） 菌株的分子生物學(xué)鑒定：用細(xì)菌 16S rDNA 通用引物 （ 27F： 5-CAGCGGTACCAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和1492R： 5-CTCTCTGCAGTACGGCTACCTTGTTACGACTT-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物送公司測序。將序列信息輸入NCBI 網(wǎng)站，經(jīng) Blast 程序與 GenBank 中已有的核酸序列進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析，并用MEGA 11.0軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 多環(huán)芳烴濃度的測定 將活化之后的菌液8000 r/min離心5 min，棄上清，用無機(jī)鹽培養(yǎng)基洗滌2次，再用無機(jī)鹽培養(yǎng)基將菌體重懸；將菌液OD₆₀₀調(diào)至1.0，按所需的接種量轉(zhuǎn)接于50 mL加有多環(huán)芳烴為單一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。

1）分光光度法檢測多環(huán)芳烴

a）配制各種多環(huán)芳烴溶于甲醇的標(biāo)準(zhǔn)品，用島津UV2500分光光度計(jì)做全波段掃描，來確定每種多環(huán)芳烴對(duì)應(yīng)的最大吸收波長。

b）分別在各種多環(huán)芳烴的最大吸收波長處測定不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，多環(huán)芳烴的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定加標(biāo)回收率，計(jì)算變異系數(shù)，分析重復(fù)性。

c）向50 mL 培養(yǎng)液中加入25 mL 二氯甲烷，振蕩萃取30 min，之后倒入分液漏斗中，靜置15 min，分層后收集下層的有機(jī)相，上層的水相按同樣的方法連續(xù)萃取2 次。

d）合并3次萃取獲得的有機(jī)相，離心去掉有機(jī)相中殘留的水分，并測量有機(jī)相的體積。

e）測定于上述有機(jī)相樣品在最大吸收波長下的吸收值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多環(huán)芳烴的濃度和降解率。

2）高效液相色譜法測定熒蒽和芘

a）繪制熒蒽和芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制不同濃度梯度的熒蒽和芘的標(biāo)準(zhǔn)樣品，上機(jī)分析。分析的色譜條件為：流動(dòng)相為V（甲醇）∶V（水）=9∶1，紫外檢測器室溫檢測，設(shè)置流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為30 μL，檢測波長為254 nm，分析時(shí)間為30 min。以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)分別繪制熒蒽和芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

b）培養(yǎng)液中加入等體積的二氯甲烷萃取，振蕩萃取30 min，倒入分液漏斗中，靜置15 min，分層后收集有機(jī)相，水相重復(fù)萃取2次。

c）將有機(jī)相離心，去掉殘留的水分后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，水浴溫度為40℃；向蒸干后的圓底燒瓶中加入50 mL色譜純的甲醇，充分溶解多環(huán)芳烴。

d）取1 mL上述多環(huán)芳烴甲醇溶液，過濾除去雜質(zhì)，制得待測樣品。將待測樣品上機(jī)檢測，根據(jù)檢測結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算熒蒽及芘的濃度和降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株CE3的形態(tài)特征

通過逐次提高培養(yǎng)基中的熒蒽濃度，并用平板劃線分離純化，篩選得到一株高效降解熒蒽的菌株，編號(hào)CE3。菌株CE3在LB平板（圖1a）和無機(jī)鹽平板（圖1b）上的菌落呈規(guī)則圓形，透明，淡黃色，凸起，表面光滑濕潤，質(zhì)地粘稠易挑起。菌株CE3為革蘭氏陰性菌，菌體呈略彎曲的棒狀（圖1c）。菌株CE3在含有熒蒽的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，隨著熒蒽被降解，培養(yǎng)液逐漸變清亮，菌體呈絮狀聚集（圖1d）。

2.2 菌株CE3的分子生物學(xué)鑒定

菌株CE3的16S rDNA序列GenBank 登錄號(hào)為 MT 498785，Blast序列同源性比對(duì)顯示其菌株CE3與Azoarcus（固氮彎曲菌）屬細(xì)菌的16S rDNA序列同源性高，核苷酸一致性均達(dá)95%以上，其中與Azoarcus evansii DQS-4的16S rDNA序列同源性最高。系統(tǒng)發(fā)育分析也表明菌株CE3與彎曲固氮菌屬（Azoarcus）的菌株親緣關(guān)系較近（圖2），故初步將菌株CE3鑒定為Azoarcus sp. CE3。

2.3 菌株CE3的多環(huán)芳烴利用范圍

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除熒蒽外，菌株CE3能在以苯、芘、菲、3-4苯并芘、苯并[a]蒽、苯并[b]熒蒽為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長。為此，檢測了菌株CE3對(duì)各種高分子量PAHs的降解能力（表1）。結(jié)果表明菌株CE3對(duì)幾種高分子量PAHs都有一定的降解能力，對(duì)熒蒽和芘的降解率超過了50%。故后續(xù)對(duì)菌株CE3在不同條件下降解熒蒽和芘的能力進(jìn)行了詳細(xì)分析。

2.4 菌株CE3降解特性的研究

2.4.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株CE3降解率的影響 未接種細(xì)菌的對(duì)照組中熒蒽和芘濃度在不同培養(yǎng)溫度下無明顯差別，說明溫度對(duì)熒蒽和芘的自身散逸沒有顯著影響。菌株CE3降解熒蒽和芘的最適溫度均為30℃，溫度提高到35℃時(shí)，CE3菌對(duì)芘的降解率略有降低，但對(duì)熒蒽的降解率則下降了一半（圖3）。菌株CE3在25～45℃條件下都能生長，但溫度超過40℃時(shí)CE3菌的生長受到明顯抑制，降解率也明顯降低。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)都在30℃條件下進(jìn)行。

2.4.2 不同接菌量對(duì)菌株CE3降解率的影響 降解體系中的PAHs含量恒定時(shí)，不同的接菌量對(duì)降解率也有明顯影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接菌量從2%到8%時(shí)，菌株CE3對(duì)熒蒽的降解率逐漸提高，最高降解率達(dá)到58.9%；增加接種量到10%時(shí)，降解率反而降低。芘的降解率變化與熒蒽的不同，當(dāng)接菌量為6%時(shí)，菌株CE3對(duì)芘的降解率達(dá)到最大值60.2%。其他不同比例接菌量下，芘的降解率無明顯差別（圖4）。

2.4.3 熒蒽或芘初始濃度對(duì)菌株CE3降解能力的影響 菌株對(duì)PAHs耐受能力的研究是探究其降解特性的重要一環(huán)，本研究測定了不同初始培養(yǎng)濃度下菌株CE3對(duì)熒蒽和芘的降解效率（圖5）。初始濃度為100 mg/L時(shí)，菌株CE3對(duì)熒蒽和芘的降解率最高，分別達(dá)到50.8%和65.3%，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中熒蒽或芘的初始濃度均為100 mg/L。在熒蒽和芘濃度較高時(shí)，菌株CE3仍具有一定的降解能力，說明菌株CE3能耐受高濃度熒蒽和芘，具有應(yīng)用于高濃度熒蒽或芘污染治理的潛力。

2.4.4培養(yǎng)基的初始pH對(duì)菌株CE3降解率的影響 pH值會(huì)影響酶的活性、物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程和營養(yǎng)物質(zhì)的利用^[8]，從而影響微生物的代謝過程，因此本研究探究了培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株CE3降解熒蒽和芘效率的影響（圖6）。培養(yǎng)基初始pH值在5～10之間時(shí)，菌株CE3對(duì)熒蒽和芘的降解率先隨著pH值的增加而增加，當(dāng)pH為8時(shí)CE3菌對(duì)熒蒽的降解率達(dá)到最高，隨后pH越高降解率越低；而菌株CE3對(duì)芘的降解率在pH 9時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)pH為10 或8時(shí)，芘的降解率也沒有明顯降低。由此可見，菌株CE3比較適應(yīng)弱堿性環(huán)境，而酸性環(huán)境對(duì)其生長和降解活動(dòng)明顯不利。

2.4.5 不同外源營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)菌株CE3降解率的影響 微生物需要碳源、氮源、磷源、鉀和鐵等保證其正常代謝和生長^[9]，不同的共代謝底物也是影響微生物降解PAHs的因素之一^[10]。本研究選擇蔗糖（A）、果糖（B）、葡萄糖（C）、麥芽糖（D）、木糖（E）、酵母提取物（F）、蛋白胨（G）作為外源營養(yǎng)物質(zhì)，探究它們對(duì)菌株CE3降解熒蒽和芘能力的影響。結(jié)果顯所示，各種營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)菌株CE3降解熒蒽和芘的影響不同，酵母提取物使菌株對(duì)熒蒽和芘的降解率分別提高了12.3%和5.8%，蛋白胨使菌株對(duì)熒蒽和芘的降解率分別提高了5.7%和3.6%；而蔗糖使菌株對(duì)熒蒽的降解率提高了11.5%，但抑制了對(duì)芘的降解；與之相反，果糖使菌株對(duì)芘的降解率提高了13.9%，抑制了對(duì)熒蒽的降解（圖7）。因此，為了促進(jìn)菌株CE3對(duì)熒蒽和芘的降解，可在降解體系中添加酵母提取物和蛋白胨，作為共代謝底物促進(jìn)菌株CE3對(duì)熒蒽和芘的降解；如果只需降解熒蒽，可以選取蔗糖作為外源碳源物質(zhì)促進(jìn)降解；如果只需降解芘，則可選取果糖作為外源碳源物質(zhì)促進(jìn)降解。

3 討論

本文從PAHs污染土壤中以熒蒽為唯一碳源分離到一株P(guān)AHs降解菌CE3，通過分子生物學(xué)方法鑒定，該菌為Azoarcus sp. CE3。雖然早先有報(bào)道Azoarcus屬的菌能夠厭氧降解含單個(gè)苯環(huán)的芳香烴和單個(gè)六元環(huán)結(jié)構(gòu)如間二甲苯、二氧己烷等有機(jī)物^[11-13]，還有報(bào)道通過宏基因組測序發(fā)現(xiàn)一種能降解熒蒽和菲的混合菌中Azoarcus屬細(xì)菌的含量高達(dá)58.5%^[14]，但本研究是首次分離到能降解PAHs的Azoarcus屬菌株。CE3菌能以多種PAHs為唯一碳源進(jìn)行生長，特別是能降解幾種高分子量PAHs，說明CE3菌具有應(yīng)用于環(huán)境PAHs污染治理的潛力。探究各種環(huán)境條件對(duì)菌株CE3降解熒蒽或芘的影響，發(fā)現(xiàn)菌株CE3能在較廣的溫度和pH范圍降解熒蒽或芘；同時(shí)，添加酵母提取物、蔗糖和果糖可使CE3菌降解率提高。因此，菌株CE3在PAHs類污染物的修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景，本實(shí)驗(yàn)為CE3菌應(yīng)用于環(huán)境PAHs污染治理及修復(fù)奠定了良好的基礎(chǔ)。

由于目前僅完成實(shí)驗(yàn)室水平的液體體系降解測試，為實(shí)現(xiàn)CE3菌在PAHs污染土壤或水體中的應(yīng)用，后期需要繼續(xù)探究CE3菌在應(yīng)用于環(huán)境治理時(shí)是否能保持其高效利用底物的特性，是否會(huì)與環(huán)境中原有的微生物群落相互作用等問題。

[ 參 考 文 獻(xiàn) ]

[1] MOORTHY B， CHU C， CARLIN D J. Polycyclic aromatic hydrocarbons： from metabolism to lung cancer[J]. Toxicological Sciences， 2015， 145（01）： 5-15.

[2] LABIB S， WILLIAMS A， KUO B， et al. A framework for the use of single-chemical transcriptomics data in predicting the hazards associated with complex mixtures of polycyclic aromatic hydrocarbons[J]. Archives of Toxicology， 2017， 91（7）： 2599-2616.

[3] IZZO S A， QUINTANA S， ESPINOSA M， et al. First characterization of PAH-degrading bacteria from Rio de la Plata and high-resolution melting： an encouraging step toward bioremediation[J]. Environmental Technology， 2019， 40（10）： 1250-1261.

[4] SHI W， GUO Y， NING G， et al. Remediation of soil polluted with HMW-PAHs by alfalfa or brome in combination with fungi and starch[J]. Journal of Hazardous Materials， 2018， 360： 115-121.

[5] HESHAM A L， KHAN S， TAO Y， et al. Biodegradation of high molecular weight PAHs using isolated yeast mixtures： application of meta-genomic methods for community structure analyses[J]. Environmental Science and Pollution Research， 2012， 19（8）： 3568-3578.

[6] 馬妍， 程蘆， 阮子淵，等. 近20年中國表層土壤中多環(huán)芳烴時(shí)空分布特征及源解析[J]. 環(huán)境科學(xué)， 2021， 42（03）： 1065-1072.

[7] GHOSAL D， GHOSH S， DUTTA T K， et al. Current state of knowledge in microbial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）： A Review[J]. Frontiers in Microbiology， 2016， 7： 1369.

[8] PATEL V， PATEL J， MADAMWAR D. Biodegradation of phenanthrene in bioaugmented microcosm by consortium ASP developed from coastal sediment of Alang-Sosiya ship breaking yard[J]. Marine Pollution Bulletin， 2013， 74（01）： 199-207.

[9] LEE K， PARK J W， AHN I S. Effect of additional carbon source on naphthalene biodegradation by Pseudomonas putida G7[J]. Journal of Hazardous Materials， 2003， 105（01-03）： 157-167.

[10]VAIDYA S， DEVPURA N， JAIN K， et al. Degradation of chrysene by enriched bacterial consortium[J]. Frontiers in Microbiology， 2018， 9： 1333.

[11]FERNANDEZ H， PRANDONI N， FERNANDEZ-PASCUAL M， et al. Azoarcus sp. CIB， an anaerobic biodegrader of aromatic compounds shows an endophytic lifestyle[J]. PLoS One， 2014， 9（10）： e110771.

[12]DENG D， PHAM D N， LI F， et al. Discovery of an inducible toluene monooxygenase that cooxidizes 1，4-dioxane and 1，1-dichloroethylene in propanotrophic Azoarcus sp. strain DD4[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2020， 86（17）： e01163-20.

[13]BLAZQUEZ B， CARMONA M， DIAZ E. Transcriptional regulation of the peripheral pathway for the anaerobic catabolism of toluene and m-xylene in Azoarcus sp. CIB[J]. Frontiers in Microbiology， 2018， 9： 506.

[14]PATEL A B， SINGH S， PATEL A， et al. Synergistic biodegradation of phenanthrene and fluoranthene by mixed bacterial cultures[J]. Bioresource Technology， 2019， 284： 115-120.

Degradation Characteristics of Polycyclic Aromatic

Hydrocarbons by Azoarcus sp. CE3

ZHANG Honghong¹， YE Chen¹， ZHANG Xiaoyun²， MENG Tian¹_，WANG Liming²， HUANG Yuping¹

（1 College of Life Sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， China;

2 Hubei Environmental Remediation & Governance

Techonlogical Research Co.， ltd.，Huangshi 435000，China）

Abstract：Microbial remediation has excellent characteristics in the control of polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） pollution. In order to obtain microorganisms that can efficiently degrade PAHs， fluoranthene was used as the only carbon source to screen microorganisms. And then a high-efficiency degrading bacterium named CE3 was isolated. Strain CE3 was identified to belong to Azoarcus genus based on its 16S rDNA sequence analysis. To our knowledge， this is the first report that the strain of the Azoarcus genus has the ability to degrade high molecular weight PAHs. In addition to fluoranthene， strain CE3 also could degrade benzene， phenanthrene， pyrene， fluoranthene， benzo [a]anthracene， benzo [3，4]pyrene and benzo [b]fluoranthene. The degradation rates of fluoranthene and pyrene are more than 50% and higher than the degradation rates of other PAHs. Then， the degradation rates of fluoranthene and pyrene by strain CE3 under various conditions were analyzed in detail by HPLC method. The results showed that Azoarcus sp. CE3 could degrade fluoranthene or pyrene in a wide range of temperature and pH; moreover， the addition of yeast extract， sucrose and fructose to the medium could improve its degradation ability.

Keywords：polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）; fluoranthene; pyrene; degradation; Azoarcus

[責(zé)任編校：張 眾]