核殼型磁性分子印跡聚合物制備

樊世萌 劉戀 歐陽敬禹 劉浩 尤祥宇 李玲玲 蘇江濤

[摘 要]用表面分子印跡技術，以氨基化磁性納米顆粒為核，以馬尿酸（HA）為模板分子、甲基丙烯酸（MAA）為功能單體、偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，制備核殼型馬尿酸磁性分子印跡聚合物（HA-MMIPs）。通過電鏡對其結構進行表征，并通過動力學吸附、等溫吸附、比較HA-MMIPs與人血清白蛋白（HSA）對HA的吸附等實驗，對其性能進行評價。結果表明，HA-MMIPs對HA具有較好的吸附量和印跡效率，在吸附HA上表現出對HSA的明顯優(yōu)勢。HA五輪吸附-洗脫的循環(huán)實驗表明，HA-MMIPs具有很好的重復再利用能力。這項研究證明HA-MMIPs對馬尿酸分子具有良好的分離與吸附能力，對于尿毒癥患者體內馬尿酸分子的分離與吸附可能存在潛在的優(yōu)勢。

[關鍵詞]馬尿酸；尿毒癥毒素；分子印跡；人血清白蛋白

[中圖分類號]TB383.1[文獻標識碼]A

尿毒癥毒素是一類腎衰竭期間在血液或組織中蓄積，對機體的正常生理具有負面影響的物質^[1]。馬尿酸（Hippuric Acid， HA）是這類物質中的一種，在健康個體中，HA濃度低于5 mg/L，但在終末期腎病患者中可增加至247±112 mg/L^[2]。HA在血液中的積累，可抑制肌肉對葡萄糖的利用，引起尿毒癥患者的肌肉無力，并可抑制腎臟的有機陰離子分泌和血腦屏障的轉運。HA是蛋白結合性毒素，大多數血液凈化方式對此類物質的清除效果較差。有研究表明，通過血液透析清除HA的比例僅為64%^[3]。另外，HA是苯甲酸的甘氨酸結合物，而苯甲酸主要由腸道菌群代謝芳香族氨基酸產生，也可直接作為食品和飲料的防腐劑。機體內苯甲酸的大部分（約90%）主要與甘氨酸結合形成馬尿酸，其余的則與葡萄糖醛酸結合形成1-苯甲酰葡萄醛酸^[4]。因此，針對HA的分離技術或樣品前處理技術，不論在血液凈化領域或在食品飲料分析檢測領域中都具有一定的現實意義。

分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是用于提取目標分子的選擇性吸附劑，基本上模擬了生物分子識別過程中發(fā)生的“鎖和鑰匙”結合機制。模板分子（目標分子）與功能單體相互作用形成絡合物，在聚合反應中被三維聚合物網絡包裹；聚合反應結束后洗脫模板，留下特定的定制識別位點，由此方法制備的MIPs能夠根據獨特的大小、化學功能和立體結構識別目標分子^[4]。MIPs的物理、化學條件穩(wěn)定，對樣品環(huán)境的適應性很廣。與無模板制備的分子非印跡聚合物（NIPs）相比，MIPs表現出高選擇性和高吸附效率。MIPs目前被廣泛用于色譜、微萃取和傳感等分析應用中^[5]。磁性MIPs（Magnetic molecularly imprinted polymers，MMIPs）是MIPs和磁性納米顆粒（Nanoparticles，MNPs）技術相結合的產物，兼顧MIPs的特點和MNPs固有的高比表面積、優(yōu)良的磁學性質等優(yōu)點^[6]，在對樣品中目標分子的識別和分離方面更具效率和優(yōu)勢。本文利用表面分子印跡技術，以氨基化磁性納米顆粒為核，以HA為模板，制備一種馬尿酸磁性分子印跡聚合物（HA-MMIPs）。該方法簡易可行、條件溫和。除常規(guī)表征與吸附性能分析外，還將HA-MMIPs與人血清白蛋白（HSA）對HA的吸附性能進行了比較，考察HA-MMIPs應用于血液凈化領域去除尿毒癥毒素分子的潛力。

1 實驗

1.1 主要試劑

馬尿酸（HA）、人血清白蛋白（HSA）購于Sigma-Aldrich貿易有限公司；六水氯化鐵（FeCl₃·6H₂O）、無水乙酸鈉（NaAc）、1，6-己二胺、一縮二乙二醇、乙腈、甲醇、無水乙醇、乙酸等購于國藥集團化學試劑有限公司（分析純）；甲基丙烯酸（MAA）、偶氮二異丁腈（AIBN）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司（分析純）。甲醇、乙酸銨購于Sigma-Aldrich貿易有限公司（色譜級）。實驗用水均為去離子水。

1.2 主要儀器

Ultimate3000高效液相色譜儀，FEI TF20透射電鏡（美國，賽默飛世爾科技公司）；NANO-ITC等溫滴定微量熱儀（美國，TA儀器）。

1.3 HA-MMIPs和MNIPs的合成

制備馬尿酸磁性分子印跡聚合物（HA-MMIPs）的流程如圖1所示。

1.3.1 Fe₃O₄@NH₂的制備 參照文獻[7]，將3.0 g FeCl₃·6H₂O、12 g NaAc加入90 mL一縮二乙二醇，攪拌至完全溶解后加入19.5 g 1，6-己二胺，繼續(xù)攪拌至溶液澄清，轉移溶液至聚四氟乙烯內襯置入高壓反應釜中200 ℃反應6 h，產物用無水乙醇、去離子水各洗滌3次，真空干燥得到氨基化磁性納米顆粒（Fe₃O₄@NH₂）。

1.3.2 HA-MMIPs的制備 將0.14 g HA、400 μL MAA冰浴超聲溶于50 mL乙腈，4 ℃孵育過夜。后加入0.1 g超聲分散的Fe₃O₄@NH₂、80 mg AIBN、1mL EGDMA，通N₂除氧，N₂保護下 60 ℃反應2 h。反應結束后，產物用去離子水、甲醇乙酸（9：1）洗脫液、甲醇各洗滌3次，直至上清液無HA檢出，冷凍干燥得到馬尿酸磁性分子印跡聚合物（HA-MMIPs）。作為對照，按相同方法無模板制備磁性分子非印跡聚合物（MNIPs）。

1.4 TEM表征

使用FEI TF20透射電鏡觀察Fe₃O₄@NH₂或HA-MMIPs的形貌。將適量的納米材料分散于乙醇中，涂在碳涂層銅網格上晾干待測。

1.5 吸附實驗

1.5.1 動力學吸附實驗 稱取2 mg HA-MMIPs或MNIPs若干份于離心管內，各加入2 mL 100 μg/mL HA水溶液，超聲混勻后，室溫下將其置于恒溫振蕩器中振蕩吸附。在不同時間磁力分離HA-MMIPs（或MNIPs），對上清液HPLC分析，分析峰面積，計算上清液中HA濃度，按式（1）計算HA-MMIPs（或MNIPs）對HA的吸附量Q。

Q =（C₀-C）·V/m ???（1）

其中，Q為HA-MMIPs（MNIPs或HSA）對HA的吸附量，μg/mg；C₀為吸附前HA濃度，μg/mL；C為吸附后HA濃度，μg/mL；V為HA溶液體積，mL；m為HA-MMIPs（MNIPs或HSA）質量，mg。

1.5.2 等溫吸附實驗 稱取2 mg HA-MMIPs或MNIPs若干份于離心管內，各加入2 mL不同濃度的HA水溶液，超聲混勻后，室溫下將其置于恒溫振蕩器中振蕩吸附2 h。吸附完成后，磁力分離HA-MMIPs（或MNIPs），對上清液HPLC分析，分析峰面積，計算上清液中HA濃度，按式（1）計算HA-MMIPs（或MNIPs）對HA的吸附量Q。

1.5.3 HSA對HA的吸附實驗 稱取2 mg HA-MMIPs若干份于離心管內，各加入2 mL 100 μg/mL（或200 μg/mL）HA水溶液超聲混勻后，加入8 mg HSA，完全溶解后在室溫下將其置于恒溫振蕩器中振蕩吸附2 h。吸附完成后磁力分離HA-MMIPs，上清液經超濾濃縮管（Thermo Scientific^TMPierce濃縮管，10 000 MWCO）離心過濾，對濾過液HPLC分析，分析峰面積，計算濾過液中HA濃度，按式（1）計算HSA對HA的吸附量Q。

1.5.4 液相色譜條件 色譜柱為PALPAK Type R （φ4.6 mm×250 mm）；流動相為V（甲醇）∶V（0.02 M乙酸銨）=15∶85；流速1.0 mL/min；紫外檢測器波長228 nm；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。

1.6ITC實驗

采用納瓦級等溫滴定微量熱儀，樣品池體積為1 mL，注射器體積250 μL。將1 mL 4 mg/mL HSA溶液注入樣品池，250 μL 1 mg/mL HA溶液裝入注射器，恒溫至37℃，待基線穩(wěn)定后滴定，每次滴定體積為10 μL，間隔時間為600 s。

在相同條件下以HA溶液滴定純水作為空白。滴定完成后獲得微量熱曲線，數據處理后得到焓變（ΔH）、熵變（ΔS）和解離常數（K_d）等熱力學參數。

1.7 HA-MMIPs的重復使用

稱取2 mg HA-MMIPs或MNIPs若干份于離心管內，各加入2 mL 200 μg/mL HA溶液，超聲混勻后，室溫下將其置于恒溫振蕩器中振蕩吸附2 h。磁力分離HA-MMIPs（或MNIPs），獲取上清液待測。采用上述1.3中的洗滌方法對磁力分離的HA-MMIPs（或MNIPs）進行洗滌，直至上清液無HA檢出，冷凍干燥、回收。將回收的HA-MMIPs或MNIPs，循環(huán)重復以上吸附、洗滌實驗4次，將每次完成吸附實驗后的上清液（共5份），進行HPLC分析，分析峰面積，計算上清液中HA濃度，按式（1）計算HA-MMIPs（或MNIPs）對HA的吸附量Q。

2 結果與討論

2.1 印跡條件對HA-MMIPs吸附效果的影響

在MIPs的制備中，功能單體與模板之間相互作用力越強，越有利于MIPs選擇性識別位點的形成；MAA是最常用的非共價型MIPs的功能單體之一^[8]，既可以作為氫鍵的供體，也可以作為氫鍵的受體。丙烯酸基MIPs主要通過自由基聚合制備。通過大量實驗，我們對聚合反應中使用的溶劑及HA、MAA、Fe₃O₄@NH₂等的配比進行優(yōu)化，發(fā)現溶劑為乙腈，HA：MAA：Fe₃O₄@NH₂的比例為0.14 g：400 μL：0.1 g，且HA與MAA經過4 ℃孵育過夜，印跡聚合物對HA的吸附效果最好。推測HA與MAA經過4 ℃孵育過夜，有利于二者間產生氫鍵。在此基礎上進一步對分子印跡的聚合時間進行優(yōu)化，分別制備聚合時間為1、1.5、2、3、6、12、18 h的印跡聚合物，并評價其對HA的吸附能力（吸附條件同動力學吸附實驗，吸附時間為2 h）。由圖2可知，HA-MMIPs對HA的吸附量Q隨聚合時間延長呈現先增后減的趨勢（聚合時間為30 min時，聚合物產量極少，故無數據列出），且在聚合時間為2 h時Q值最大。作為對照，磁性分子非印跡聚合物（MNIPs）對HA的吸附隨聚合時間的變化不大，且明顯低于HA-MMIPs對HA的吸附。計算聚合時間為2 h時HA-MMIPs印跡因子IF（Q_MMIPs/Q_MNIPs）約為3。由此，得出最優(yōu)的聚合時間為2 h。分析可能原因：聚合時間過短時印跡腔未完全形成，聚合時間過長時則表面印跡層較厚，HA進入印跡腔受阻，導致吸附量減少。

2.2 TEM表征分析

如圖3所示，Fe₃O₄@NH₂和HA-MMIPs分散度均較好且尺寸均一。利用Nanomeasure軟件對聚合物的粒徑進行分析，Fe₃O₄@NH₂的平均粒徑約為20 nm，HA-MMIPs的平均粒徑約為23 nm。HA-MMIPs的粒徑比Fe₃O₄@NH₂的粒徑僅略有增加，提示分子印跡聚合物已包覆且包覆層比較薄。

2.3 HA-MMIPs吸附動力學

動力學吸附實驗結果如圖4所示：HA-MMIPs和MNIPs在0～2 h間對HA的吸附量均隨著時間的延長而增加，但是二者的增變模式有很大區(qū)別；HA-MMIPs對HA的吸附量在15 min～1.5 h間有個快速增加的過程，在1.5～2 h間增加略放緩；MNIPs對HA的吸附量在15 min～2 h間始終保持較慢的增加。當吸附時間大于2 h后，HA-MMIPs和MNIPs對HA的吸附曲線都趨于平緩。HA-MMIPs對HA早期吸附量的增加速率明顯高于MNIPs，且HA-MMIPs對HA的吸附量始終遠大于MNIPs，說明含印跡腔的HA-MMIPs相比MNIPs對HA具有更強的親和力，這是由于HA-MMIPs印跡腔內的空間、尺寸、化學鍵等共同作用、對HA進行特異性識別的結果?！岸ㄖ啤钡挠≯E腔能夠更多更快地吸附HA分子，這與不含印跡腔的MNIPs對HA的非特異性吸附完全不同。當HA-MMIPs印跡腔逐漸被HA占據飽和后，HA-MMIPs對HA的吸附量不再隨著時間延長而發(fā)生明顯變化。

為進一步研究吸附過程的速率控制和傳質機理，將一級（準一級）、二級（準二級）等動力學吸附模型用于評價HA-MMIPs對HA的吸附特性^[9]。根據擬合數據對比，圖4數據更符合Lagergren（拉格爾格倫）準一級動力學吸附模型（圖5）。Lagergren準一級動力學吸附模型的方程式為

Q = Q_t（1 - exp（-k_f·t）） ???（2）

其中：Q為HA-MMIPs對HA的吸附量，Q_t表示HA-MMIPs對HA的平衡吸附量，k_f表示一級吸附速率常數，t為吸附時間，h。由圖5可知，準一級動力學模型計算的Q_t值（≈ 47.7μg/mg）與實驗測出的Q_t值（≈ 44.8 μg/mg）吻合較好。Lagergren準一級動力學吸附模型表明，影響HA-MMIPs對HA吸附量Q值的最主要變量是時間。

2.4 HA-MMIPs的等溫吸附曲線

如圖6所示，HA-MMIPs和MNIPs的等溫吸附曲線略有不同。HA-MMIPs對HA的等溫吸附曲線大概有3種特征；HA濃度為0 ～ 140 μg/mL時，HA-MMIPs對HA的吸附量隨HA濃度增加而快速增加；HA濃度為140 ～ 200 μg/mL時，HA-MMIPs對HA的吸附量隨HA濃度增加而增速放緩；HA濃度大于200 μg/mL時，HA-MMIPs對HA的吸附量隨HA濃度增加而無明顯變化，說明吸附趨于飽和，對HA最大吸附量超過95 μg/mg。對于MNIPs，HA濃度為0 ～ 140 μg/mL時，MNIPs對HA的吸附量隨HA濃度增加而快速增加；HA濃度大于140 μg/mL時，MNIPs對HA的吸附量無隨HA濃度增加而明顯變化，吸附趨于飽和。相同HA濃度下，MNIPs的吸附量遠小于HA-MMIPs，這是由于HA-MMIPs對HA的特異性吸附，擁有印跡空穴的HA-MMIPs能吸附更多的HA。

2.5 HA-MMIPs和HSA對HA的吸附比較

由圖7可知，相同吸附條件下，HA濃度為100 μg/mL時，HA-MMIPs對于HA的吸附量略大于HSA對于HA的吸附量；HA濃度為200 μg/mL時，HA-MMIPs對于HA的吸附量遠大于HSA對于HA的吸附量。從圖6HA-MMIPs的等溫吸附曲線可以看出：當HA濃度大于200 μg/mL，HA-MMIPs對HA的吸附趨于飽和；在HA 200 μg/mL濃度下，HA-MMIPs對HA的吸附量相比HSA很有優(yōu)勢。

等溫滴定微量熱（ITC）技術能夠原位、在線、靈敏地監(jiān)測生物分子結合過程中產生的微熱變化，以此獲得其平衡解離常數K_d、摩爾結合焓ΔH、摩爾結合熵ΔS等熱力學參數。在37 ℃下HA滴定HSA，圖8a每一峰值表示每次滴定產生的熱變化補償，圖8b為每次滴定產生的熱效應與滴定和被滴定分子的摩爾比作圖得到一條結合曲線。由圖中數據可知，HA與HSA結合的焓變化為負值，表明結合過程都是放熱的。根據作圖后的結合曲線測算，HA與HSA的平衡解離常數為5.283×10^-4M，該數值和已有文獻報道的相應值很接近^[2]。另據文獻報道，蛋白結合性毒素^[1]如硫酸吲哚酚（Indoxyl sulfate， IS）、硫酸對甲酚（p-cresyl sulphate， PCS）、對甲酚（p-cresol， PC）、吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）等與HSA非共價結合，親和力多處于中低等親和力范圍^[10-13]；HA與HSA的親和力值在眾多蛋白結合性毒素與HSA的親和力值中處于中等水平。

大多數血液凈化方式對蛋白結合性毒素的清除效果較差^[1，14]。由于分子印跡聚合物的材料特性及ITC儀器使用限制，雖然無法直接應用ITC技術對HA與HA-MMIPs之間的親和力進行測算，但結合圖6、圖7與圖8能夠得出，HA-MMIPs對HA有著比HSA對HA更強的吸附能力。這說明，HA-MMIPs有進一步應用于血液凈化領域的潛力。臨床研究表明^[14]，在血液凈化透析液中加入一定濃度的HSA（如濃度為20 %），透析過程中血液一側部分毒素可與所結合的HSA解離、穿過透析膜，依靠膜兩側濃度梯度差配位結合于透析液一側的HSA。Mitzner等^[15]認為，毒素解離并跨膜趨向移動，是由于透析液一側的HSA始終具有大量的未結合位點?；诖?，可以大膽假設：如果把透析液一側中的HSA替換成與毒素親和力高很多的高分子聚合物材料，那么在透析過程中毒素跨膜趨向移動的作用將會更加顯著。

2.6 HA-MMIPs的可重復使用性

洗脫掉所結合的分子后的HA-MMIPs可以被回收并重復使用。對HA連續(xù)進行5個吸附-洗脫循環(huán)實驗，考察印跡聚合物的穩(wěn)定性及吸附能力（圖9），數據表明，HA-MMIPs性質很穩(wěn)定，經5次吸附—洗脫循環(huán)后，HA-MMIPs在第5次循環(huán)實驗中對HA的吸附量仍可達首次吸附量的92.8%。

3 結論

1）以氨基修飾的磁性納米顆粒為核，結合表面分子印跡技術，建立了一種制備核殼型馬尿酸磁性分子印跡聚合物的方法。所制備的磁性分子印跡聚合物HA-MMIPs對HA最大吸附量大于95 mg/g，相應的印跡因子約為3，說明具有較大的吸附量和較好的印跡效果。

2）研究其吸附動力學曲線發(fā)現，HA-MMIPs對HA的吸附在2 h基本達到平衡。

3）比較HSA對HA的吸附等實驗，HA-MMIPs在吸附HA上表現出對HSA的明顯優(yōu)勢，說明HA-MMIPs有進一步應用于血液凈化領域的潛力。

4）HA-MMIPs具有良好的可重復利用性，印跡聚合物經過了5次吸附-洗脫循環(huán)，依舊表現出對HA良好的吸附能力。

5）HA-MMIPs在各個實驗中以磁分離技術實現分離目的，具有快速、簡便的特點，提示其具有應用于復雜樣品的潛力。根據上述實驗結果可知，HA-MMIPs有希望作為潛在的選擇性吸附材料運用于血液凈化領域，分離和吸附尿毒癥患者血液內高濃度的HA。

[ 參 考 文 獻 ]

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Preparation for Core-shell Magnetic Molecularly Imprinted

Polymers Using Hippuric Acid Template

FAN Shimeng， LIU Lian， OUYANG Jingyu， LIU Hao， YOU Xiangyu， LI Lingling， SU Jiangtao

（1 School of Biological Engineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China;

2 Medical School ， Wuhan Univ. of Arts and Science， Wuhan 430345， China）

Abstract：Using surface molecular imprinting technology， aminated magnetic nanoparticles as the core， hippuric acid （HA） as the template molecule， methacrylic acid （MAA） as the functional monomer， azobisisobutyronitrile （AIBN） as the initiator， and ethyl acetate Glycol dimethacrylate （EGDMA） was used as a crosslinking agent to prepare core-shell hippuric acid magnetic molecularly imprinted polymers （HA-MMIPs）. Its structure was characterized by electron microscopy， and its performance was evaluated by experiments such as kinetic adsorption， isothermal adsorption， and comparison of HA-MMIPs and HSA's adsorption of HA. The results show that HA-MMIPs have better adsorption capacity for HA， better imprinting efficiency， and show obvious advantages over HSA in adsorbing HA; through at least five rounds of adsorption-elution cycle experiments on HA， it is shown that HA- MMIPs have a good ability to reuse. This study proves that HA-MMIPs have good separation and adsorption ability to hippuric acid， and may have potential advantages for the separation and adsorption of hippuric acid in uremia patients.

Keywords：Hippuric acid; uremic toxin; molecular imprinting; human serum albumin

[責任編校：張 眾]