基于OAV和PCA的茄芯煙葉中關鍵呈香物質

毛亞浩 丁靜怡 余君 王志 陳雄 楊春雷 姚蘭

[摘 要]為探究恩施茄芯煙葉中性香氣成分，篩選關鍵呈香物質，以晾制結束后的恩施茄芯煙葉作為研究對象，分別做了兩組處理：無菌水發(fā)酵處理、Bacillus megaterium m1加培養(yǎng)基混合發(fā)酵處理，利用GC-MS鑒定茄芯煙葉中的中性香氣成分，通過氣味活性值（OAV）與主成分分析（PCA）相結合篩選其關鍵致香成分。結果表明：從茄芯煙葉共鑒定出30種中性致香成分，包括酮類11種、醇類5種、酯類1種、雜環(huán)類2種、烯烴類1種、醛類8種、酚類2種，其中酮類種類較豐富，烯烴類含量較高。揮發(fā)性成分中有11種OAV大于1，最終確認苯甲醛、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、苯乙醛、巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2為恩施茄芯煙葉中性香氣成分的關鍵呈香物質。這為解析恩施茄芯煙葉的特征性香味風格與品質定向調控提供了理論基礎。

[關鍵詞]茄芯煙葉；中性香氣；氣味活性值；主成分分析

[中圖分類號]TS453[文獻標識碼]A

雪茄煙是一種卷煙產品，具有獨特的香氣^[1]。按照其不同的用途，可以將卷制雪茄的煙葉分為茄衣、茄套、茄芯^[2]。其中茄芯是雪茄的核心部分，決定著雪茄的味道和吸食過程中的香氣品質^[1]。

香氣是評價煙葉內在質量的重要指標和核心內容之一，其在很大程度上決定著煙葉品質的優(yōu)劣^[3]。煙葉香氣是由多種揮發(fā)性致香成分的組成、含量及相互作用共同決定的^[3]。在煙草重要香氣的鑒定中，氣相色譜質譜聯(lián)用（GC-MS）是煙草揮發(fā)性香氣成分鑒定和定量中常用的應用技術，但它無法確定揮發(fā)性香氣成分對樣品的貢獻度^[4]。氣味活性值（OAV）表示分子的濃度與其氣味閾值的比值，其值越大，表明該揮發(fā)性物質對香氣貢獻度越大，可以用來分析關鍵呈香物質^[5]。胡安福^[6]等利用OAV明確了卷煙主流煙氣中各成分對奶香、焦甜豆香的貢獻度。范武^[7]等利用OAV明確了異戊酸和乙酸對卷煙主流煙氣酸香貢獻最大。楊靖^[8]等發(fā)現β大馬酮、二氫大馬酮的OAV均較大，在彰顯烤煙煙氣清香香韻方面起主要作用。多元統(tǒng)計分析方法中的主成分分析（PCA）通過降維，將交叉、重復、相互作用的變量進行剔除，確定最關鍵的變量^[9]。潘玲^[10]等對湖北烤煙中性香氣成分的主成分分析，發(fā)現巨豆三烯酮、大馬酮等是烤煙香味品質的主要成分。薛超群^[11]等對不同產地的烤煙煙葉外觀特征指標進行主成分分析，確定了葉面組織、柔韌性、色度、油分、厚度、底色等為烤煙煙葉外觀特征評價的指標。

煙葉的揮發(fā)性香氣成分是其風味的主要貢獻者^[4]。而發(fā)酵是提高茄芯煙葉品質的重要環(huán)節(jié)，微生物在發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要作用，經過發(fā)酵的煙葉刺激性會降低，香氣也更加突出^[12]。然而，關于恩施雪茄茄芯煙葉中性香氣成分的關鍵呈香物質未見報道，因此研究該煙葉中性香氣成分對于解析其風味特征與品質的調控具有重要意義。為了確定恩施茄芯煙葉中關鍵呈香物質，作為評價煙葉發(fā)酵優(yōu)劣的重要指標，本研究對晾制結束的恩施茄芯煙葉做了兩組發(fā)酵處理：無菌水處理、Bacillus megaterium m1加培養(yǎng)基混合處理，通過GC-MS來定性、定量煙葉中的中性香氣成分，OAV結合PCA的方法來確定煙葉中性香氣中關鍵呈香物質，以期為工業(yè)生產中提高恩施茄芯煙葉品質提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙葉來自湖北恩施州晾制結束的CX-014雪茄茄芯。

供試菌種來自本實驗室保藏的一株巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium m1）。

LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.2～7.4（用pH計進行調節(jié)，PE-28，梅特勒-托利多儀器有限公司）。

胰蛋白胨（生化試劑BR）來自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，酵母粉（分析純）來自蘇州嘉葉生物科技有限公司，氯化鈉（分析純AR）來自國藥試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雪茄煙的固態(tài)發(fā)酵 參照蕈明娟^[13]的方法并進行了一定的調整，將Bacillus megaterium m1菌接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，在37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至對數生長期，取對數生長期的菌液在10000 r/min離心5 min后，用無菌水清洗兩次，加入50 mL新鮮LB培養(yǎng)基進行重懸，得到重懸液，然后將供試茄芯煙葉進行切絲，寬度為2 mm左右，稱取75 g的煙絲放入自封袋中，均勻的將重懸液噴灑在煙絲上，平衡水分至30%，放入恒溫恒濕箱中進行發(fā)酵，控制發(fā)酵過程中的溫度、濕度，發(fā)酵結束后75℃烘干過40 mm孔徑篩。

1.2.2 變溫發(fā)酵 參照喬保明^[14]的方法，將茄芯煙葉的變溫發(fā)酵過程分為三個階段：第一階段，35℃～40℃，培養(yǎng)箱濕度80%～85%，發(fā)酵6 d；第二階段，40℃～45℃，培養(yǎng)箱濕度80%～85%，發(fā)酵6 d；第三階段，45℃～50℃，培養(yǎng)箱濕度85%～90%，發(fā)酵6 d，同時設置兩組實驗，實驗1為只補無菌水的變溫發(fā)酵；實驗2為按煙絲重量加入10%的Bacillus megaterium m1加培養(yǎng)基的變溫發(fā)酵。

1.2.3 蒸餾萃?。⊿DE）（GC/MS）測定煙草致香物質 參考文獻[15]測定雪茄茄芯中致香物質。

1.2.4 揮發(fā)性香氣成分定性 將通過GC-MS分析得到的各色譜峰的質譜圖在安捷倫科技自主研發(fā)的質譜數據庫NIST14.0進行相似度對比，將匹配度最高的作為鑒定標準，得到定性的揮發(fā)性香氣成分。

1.2.5 揮發(fā)性香氣成分定量 采用內標乙酸苯乙酯定量香氣成分，每個揮發(fā)性成分的含量

W_i=（30×M_i）/S_i×2/10 ???（1）

式中：W_i代表每個揮發(fā)性香氣物質的含量，μg/g；M_i代表每個揮發(fā)性成分的峰面積；S_i表示內標乙酸苯乙酯的峰面積。

1.2.6 氣味活性值計算 OAV為致香成分在體系中的濃度與該物質察覺閾值的比值^[16]

H_i=W_i/O_i（2）

式中：H_i代表揮發(fā)性香氣成分的氣味活度值；W_i代表每個揮發(fā)性香氣成分的含量，μg/g；O_i代表每個揮發(fā)性成分在水中的察覺閾值，μg/g。

1.3數據處理

所有實驗均設置3個平行，采用Origin 2019作圖，SPSS26.0進行相關性分析和主成分分析。

2 結果與分析

2.1 雪茄煙葉中性香氣物質組分分析

茄芯煙葉中性香氣成分GC-MS定性定量分析及香氣類型描述見表1。在煙葉中檢測到30種中性香氣物質，包括酮類11種、醇類5種、酯類1種、雜環(huán)類2種、烯烴類1種、醛類8種、酚類2種。從香氣物質種類上來看，3種處理中酮類物質種類均較豐富，其次是醛類、醇類、雜環(huán)類、酚類、烯烴類、酯類。這些香氣成分都是雪茄茄芯煙葉中重要的中性香氣物質，對煙葉香氣風格凸顯有重要作用^[15]。其中菌加培養(yǎng)基發(fā)酵后中性香氣物質總量較高，可達到905.38 μg/g，與發(fā)酵前、無菌水發(fā)酵后相比存在顯著差異，這可能是由于加入Bacillus megaterium m1和培養(yǎng)基能協(xié)同促進雪茄煙葉發(fā)酵，提高香氣質量。

茄芯煙葉中性香氣主要分為6類，種類占比見圖1（其中組分百分比是由該組分的含量與香氣物質總量的比值）。此6類共同構成了煙葉的香氣特征。3組樣品中均以烯烴類含量最高，占中性香氣成分總量的66%～75%；其次為酮類，占中性香氣成分總量的14%～15%；再次為醇類（6%～13%）、醛類（2%～4%）、酚類（0.1%～2%）和雜環(huán)類（1%～2%）。

2.2 雪茄茄芯煙葉中性香氣物質的OAV分析

香氣物質對雪茄茄芯煙葉的特征香氣風格的貢獻不僅與該物質在煙葉中的含量有關，其閾值也是重要的參考依據^[21]。致香成分所呈現的風味強度可以用OAV來體現，OAV值越大，表明致香成分對香氣的貢獻越大^[22]。利用OAV值可以從濃度和閾值兩個層面揭示香氣成分對體系的貢獻度^[23]。一般認為OAV大于1的致香成分為呈香的關鍵物質^[24]。

通過對30種中性致香成分中已報道的閾值查詢和計算，發(fā)現其中11種中性香氣物質的OAV不小于1（表2）。OAV由高到低依次是巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2、苯乙醛、吲哚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、BETA-環(huán)檸檬醛、香葉基丙酮、苯乙醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-乙?；拎?、苯甲醛。其中巨豆三烯酮、香葉基丙酮、6-甲基-5-庚烯-2-酮具有典型的清香、果香和煙草香^{[19， 22]}；4-乙烯基愈創(chuàng)木酚具有木香^[25]。BETA-環(huán)檸檬醛具有清香^[19]；吲哚具有花香^[18]；3-乙?；拎ぞ哂袌怨?sup>[16， 18]；苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛帶有果香和清香^[3]。

劉哲^[26]用OAV研究了煙草中的關鍵香氣成分，發(fā)現巨豆三烯酮、苯乙醛、吲哚為煙草中的重要香氣成分。沈進^[27]在對陳化煙葉的致香物質研究中，用OAV確定了陳化煙葉中重要的香氣成分。這些重要的中性香氣成分來源于不同的香氣物質前體^[3]。

雪茄煙葉中存在著大量的香氣物質，不同物質之間存在著復雜的協(xié)同、加和、抑制等相互作用^[28]。兩個處理發(fā)酵后和發(fā)酵前茄芯煙葉主要中性香氣物質間的OAV相關性分析見表3，結果顯示茄芯煙葉的主要中性香氣物質間存在著密切的關聯(lián)程度，如苯甲醛、苯乙醛、3-乙?；拎ぞ曙@著正相關，6-甲基-5-庚烯-2-酮與苯乙醇、吲哚、巨豆三烯酮1呈顯著負相關，苯乙醇與巨豆三烯酮2呈顯著負相關。

2.3 雪茄茄芯煙葉關鍵中性呈香物質分析

對煙葉中11種OAV＞1的中性香氣成分進行主成分分析^[30]，KMO檢驗根據變量間簡單相關系數和偏相關系數的關系來檢驗變量數據^[31]。由表4可得KMO值為0.590（＞0.5），Bartlett球度檢驗的相伴概率為0.000（<0.05），說明煙葉中OAV＞1的11種中性香氣成分適合做主成分分析^[31]。各主成分的特征值、方差貢獻率、和累計方差貢獻率見表5，由表5可以看出，主成分分析提取了前兩個關鍵主成分，其中主成分1的累計貢獻率達到57.667%，主成分2的累計貢獻率為38.533%，2個主成分的累計貢獻率為96.201%（>90%），表明2個主成分構成的信息能夠反映原來變量的大部分信息。在圖2中，大橢圓（R²=1.0）表示100%的解釋方差，小橢圓（R²=0.5）表示50%的解釋方差，如果有成分處于小橢圓之中，說明此成分不能被主成分解釋^[28]。11種中性香氣成分均在大橢圓的附近，說明能夠被主成分解釋，也表明這些中性香氣成分對雪茄煙葉的香氣均有貢獻。各變量對主成分的影響可用載荷表示，載荷絕對值越大，其影響越大^[32]。在圖3中，以各主成分載荷絕對值在0.95以上的香氣成分作為雪茄煙葉中的關鍵呈香物質。根據兩個主成分中載荷值的大小依次為：苯甲醛、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、苯乙醛、巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2，其中苯甲醛、苯乙醛的香氣類型主要為甜香、果香、花香等；4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2的香氣類型為木香、清香等。

3 結論

恩施雪茄茄芯中11種OAV>1的主要中性香氣物質存在著復雜的相互作用。本文運用OAV結合PCA的方法，最終確定苯甲醛、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、苯乙醛、巨豆三烯酮1、巨豆三烯酮2為恩施茄芯煙葉中性香氣的關鍵呈香物質。煙葉發(fā)酵過程中關鍵呈香物質含量的變化對煙葉香氣品質具有重要影響，可用來評價恩施茄芯煙葉發(fā)酵后的品質。

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Analysis of Key Aroma Compounds in Filler Leaves

based on OAV and PCA

MAO Yahao¹， DING Jingyi¹， YU Jun¹， WANG Zhi¹， CHEN Xiong²， YANG Chunlei²， YAO Lan¹

（1 Key Laboratory of Fermentation Engin.，Ministry of Education，

Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068，China;

2 Hubei Provincial Key Laboratory of Industrial Microbiology，

Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China;

3 Hubei Tobacco Research Institute， Wuhan 430030， China）

Abstract：In order to screen the key aroma substances of cigar filler leaves from Enshi， two groups of treatments on the cigar filler leaves after drying were performed： sterile water， or Bacillus megaterium m1 plus the medium was mixed evenly with cigar filler leaves and then fermented for 18 days. The neutral aroma components in cigar filler leaves were determined by GC-MS， and the key aroma components were screened by the combination of Odor Activity Value （OAV） and Principal Component Analysis （PCA）. The result showed that a total of 30 neutral aroma components were detected from cigar filler leaves， including 11 ketones， 5 alcohols， 1 ester， 2 heterocycles， 1 olefin， 8 aldehydes， and 2 phenols Ketones are more abundant than other types of components， and olefins are the highest in content. Among the volatile components， 11 kinds of OAVs are greater than 1. Finally， benzaldehyde， 4-vinylguaiacol， phenylacetaldehyde， megastigmatrienon1 and megastigmatrienon 2 were selected as the key aroma compounds of neutral aroma components in cigar filler leaves from Enshi. The results of this study provide a theoretical basis for analyzing the characteristic aroma style and quality-oriented regulation of Enshi cigar filler leaves.

Keywords：Cigar filler leaves; Neutral aroma; OAV; PCA

[責任編校：張 眾]