高海拔地區(qū)血液篩查核酸檢測系統(tǒng)性能驗證結(jié)果評價*

臧亮 周磊 多吉 林豪 白睿 楊梅 旦超 范亞欣△

(1.大連市血液中心，遼寧 大連 116001；2.那曲市中心血站)

近年來，隨著病毒核酸檢測技術(shù)(nucleic acid testing，NAT)在血液篩查中的全面推行，大大降低了HBV/HCV/HIV 的輸血傳播風(fēng)險[1-3]。 按照《血站質(zhì)量管理規(guī)范》《血站實驗室質(zhì)量管理規(guī)范》和《血液技術(shù)操作規(guī)程(2019 版)》的要求[4-6]，應(yīng)對核酸檢測系統(tǒng)進行性能驗證，確認(rèn)核酸檢測系統(tǒng)能夠滿足實驗室檢測工作的要求，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。 目前現(xiàn)有的驗證方案與方法均是參考低海拔地區(qū)實驗室建立的，針對高海拔地區(qū)的驗證方案與方法尚未見報道。 西藏那曲地區(qū)海拔約4 450 米，高寒缺氧，氣壓低、氣候條件差，對核酸檢測系統(tǒng)的性能驗證指標(biāo)的選擇、驗證方案的標(biāo)準(zhǔn)化以及驗證結(jié)果的評價與低海拔地區(qū)的差異值得研究。 我們基于國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，針對高海拔地區(qū)實驗室檢測模式和實際工作特點，選擇分析靈敏度、特異性、重復(fù)性、符合率、檢測系統(tǒng)比對等關(guān)鍵指標(biāo)，建立適宜高海拔地區(qū)的性能驗證方案，以保證血液檢測過程的標(biāo)準(zhǔn)化和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，提升高海拔地區(qū)的血液安全，同時也為其他高海拔地區(qū)的采供血機構(gòu)順利開展核酸檢測工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 核酸檢測系統(tǒng)性能驗證血清盤由國家衛(wèi)健委臨檢中心提供。 其中，NAT 血清盤C—G(分析靈敏度驗證盤)共30 份標(biāo)本，包括HBV C 型標(biāo)本5 份(C2—C6)，濃度為25、12、6、3、1.5 IU/mL；HCV 2a 型標(biāo)本5 份(D2—D6)，濃度為170、85、40、20、10 IU/mL；HIV CRF07_BC 型標(biāo)本5 份(E2—E6)，濃度為210、105、50、25、12.5 IU/mL；HCV 1b 型標(biāo)本5 份(F2—F6)，濃度為140、70、35、17、8.5 IU/mL；HCV 6a型標(biāo)本5 份(G2—G6)，濃度為220、110、55、27、13 IU/mL；陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)5 份。 血清盤A(單檢檢測策略評估)共46 份標(biāo)本，每一編號3 支，每份標(biāo)本3 mL。

1.2 試劑與儀器 HBV、HCV 和HIV-1 病毒核酸檢測試劑盒(達(dá)安基因公司，批號:202201001)；血液核酸篩查系統(tǒng):DA3500S 全自動核酸提取儀(達(dá)安基因公司)、AGS4800 PCR擴增儀(杭州安譽公司)。

1.3 方法

1.3.1 靈敏度 采用國家衛(wèi)健委臨檢中心提供的NAT 血清盤C—G 進行檢測，標(biāo)本濃度覆蓋試劑說明書聲明的最低檢出限(HBV/HCV/HIV≤100 IU/mL)，標(biāo)本檢測前置于室溫復(fù)融，漩渦震蕩30 s 或顛倒30 次充分混勻，為防止交叉污染，混勻后瞬時離心再打開蓋子。 每個靈敏度驗證盤分3 d進行檢測，每天每個濃度檢測≥6 次，3 d 檢測每個濃度合計檢測≥20 次。 匯總每種病毒的所有重復(fù)測試數(shù)據(jù)并采用SPSS 20.0 進行PROBIT 分析，評估該核酸檢測系統(tǒng)的LOD和雙側(cè)95%置信區(qū)間。

1.3.2 重復(fù)性 采用國家衛(wèi)健委臨檢中心提供的濃度≤3倍LOD 的HBV DNA、HCV RNA、HIV-1 RNA 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，重復(fù)單檢20 次，匯總檢測結(jié)果評價檢測系統(tǒng)的重復(fù)性。

1.3.3 抗交叉污染 將分析靈敏度驗證盤中的5 支陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(C2—G2)與血清盤中配套的5 支陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)交叉放置于標(biāo)本架，以單檢模式進行檢測，分析陽性與陰性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測情況。

1.3.4 檢測系統(tǒng)比對評估 采用國家衛(wèi)健委臨檢中心提供的NAT 血清盤A 中46 份HBV DNA 低濃度標(biāo)本進行核酸檢測，標(biāo)本檢測前置于室溫復(fù)融，漩渦震蕩30 s 或顛倒30 次充分混勻，1 000～1 500×g 離心5 min。 所有標(biāo)本均進行單樣檢測，初次檢測僅檢測1 次，第2 次檢測為雙孔復(fù)檢。 匯總血清盤A 的標(biāo)本的檢測結(jié)果，與其他核酸檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果進行比較，分析該核酸檢測系統(tǒng)在高海拔地區(qū)的檢出能力，以評估當(dāng)前檢測策略。

2 結(jié)果

2.1 靈敏度驗證結(jié)果 見表1～5。 分別對HBV DNA、HCV RNA、HIV-1 RNA 的重復(fù)檢測數(shù)據(jù)進行PROBIT 分析，計算每種病毒的95%評估檢測下限(95% LOD)和雙側(cè)95%置信區(qū)間，結(jié)果見表6。

表1 HBV DNA C 型分析靈敏度驗證結(jié)果

表2 HCV RNA 2a 型分析靈敏度驗證結(jié)果

表3 HCV RNA 1b 型分析靈敏度驗證結(jié)果

表4 HCV RNA 6a 型分析靈敏度驗證結(jié)果

表5 HIV-1 RNA CRF07_BC 型分析靈敏度驗證結(jié)果

表6 不同病毒分析靈敏度的PROBIT 分析

2.2 重復(fù)性試驗結(jié)果 見表7。

表7 核酸檢測系統(tǒng)重復(fù)性驗證結(jié)果

2.3 交叉污染試驗檢測結(jié)果 陰性標(biāo)本和陽性標(biāo)本交叉排列單檢結(jié)果顯示，5 個陽性標(biāo)本(含HBV DNA、HCV RNA 和HIV RNA)的檢測結(jié)果均為反應(yīng)性，陽性符合率為100%；5個陰性標(biāo)本的結(jié)果均為無反應(yīng)性，陰性符合率為100%。 未出現(xiàn)檢測標(biāo)本之間的相互交叉污染情況。

2.4 檢測系統(tǒng)比對評估 所有標(biāo)本經(jīng)化學(xué)發(fā)光法檢測HBsAg，結(jié)果均為無反應(yīng)性，臨檢中心確證為HBV DNA 低濃度標(biāo)本，見表8。 其中，18 份經(jīng)羅氏核酸檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果為反應(yīng)性的標(biāo)本，在本站初篩檢測結(jié)果為反應(yīng)性的有8 份，初篩陽性符合率為44.44%，復(fù)測結(jié)果為反應(yīng)性的有14 份，復(fù)檢陽性符合率為77.78%；22 份經(jīng)浩源核酸檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果為反應(yīng)性的標(biāo)本，在本站初篩檢測結(jié)果為反應(yīng)性的有13份，初篩陽性符合率為59.09%，復(fù)測結(jié)果為反應(yīng)性的有13份，復(fù)檢陽性符合率為59.09%。 在血清學(xué)檢測HBcAb 呈反應(yīng)性的38 份標(biāo)本中，本站初篩檢出率為47.37%(18/38)，復(fù)測檢出率為68.57%(24/35)，有3 份標(biāo)本因標(biāo)本量不足而未對其進行復(fù)測，結(jié)果按初篩結(jié)果判定。 在對NAT 血清盤A中所有的低濃度HBV DNA 標(biāo)本的檢測結(jié)果中，本站檢測系統(tǒng)與低海拔地區(qū)檢測結(jié)果的一致性分別為77.78%和77.27%，見表9。

表8 HBV DNA 低濃度標(biāo)本信息及在不同系統(tǒng)的檢測結(jié)果

表9 HBV DNA 低濃度標(biāo)本在不同海拔地區(qū)系統(tǒng)的檢出情況

3 討論

NAT 具有高靈敏度和高特異性，能夠顯著縮短血清學(xué)檢測的“窗口期”，降低病毒經(jīng)血傳播風(fēng)險，提升血液安全[1-3]。隨著我國血液篩查核酸檢測的基本全覆蓋，如今NAT 已成為血液篩查實驗室的重要檢測手段[7]。 西藏那曲地區(qū)海拔在4 450 米以上，高寒缺氧，氣候干燥，對國產(chǎn)的核酸檢測系統(tǒng)是一個全新的挑戰(zhàn)，因此其核酸檢測過程的標(biāo)準(zhǔn)化要求也與低海拔地區(qū)具有明顯差異[8]。 目前血液檢測的標(biāo)準(zhǔn)化文件以及相關(guān)的法律法規(guī)，更多的是體現(xiàn)低海拔地區(qū)的特性，亟待建立符合高海拔地區(qū)特點的核酸檢測系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)和性能驗證方法，以確保核酸檢測工作的順利進行，提升高海拔地區(qū)的血液安全[9-11]。 我們參考國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，在國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心的大力支持下，結(jié)合西藏那曲血站采供血特點和血液篩查實驗室的工作實際，從多方面探索符合高海拔地區(qū)特點的核酸檢測性能驗證方案與方法。該研究選擇在4 千米以上的海拔地區(qū)進行研究，再結(jié)合其他海拔高度的數(shù)據(jù)，如拉薩(海拔3 650 米)[18-19]等，可以得出該研究結(jié)果也適用于其他海拔高度的地區(qū)。

通過對分析靈敏度血清盤多濃度多基因型HBV DNA/HCV RNA/HIV-1 RNA 標(biāo)本進行單人份檢測，對HBV DNA和HIV-1 RNA 的高濃度標(biāo)本的檢出率均為100%，對中濃度標(biāo)本的檢出率均為90%以上；對檢測結(jié)果進行分析靈敏度的PROBIT 分析顯示，該系統(tǒng)對HBV DNA 的平均95% LOD 為8.29 IU/mL，HIV-1 RNA 的平均95% LOD 為40.52 IU/mL，遠(yuǎn)低于說明書聲明的≤100 IU/mL。 由于該血清盤的標(biāo)本量無法滿足在低海拔地區(qū)再次檢測的要求，因此本研究與低海拔地區(qū)的分析靈敏度的比較無法通過該血清盤的再次檢測來實現(xiàn)，但通過相關(guān)報告[20]可以看出，使用該系統(tǒng)在低海拔地區(qū)進行性能驗證的結(jié)果與高海拔地區(qū)沒有差異。

該檢測系統(tǒng)對HBV 和HIV 的檢出能力均較好；HCV RNA 各基因型的檢出率之間差異較大，這與檢測系統(tǒng)對不同分型的HCV 檢出存在一定的差異有關(guān)，不同的核酸檢測系統(tǒng)之間對于HCV 片段的模板選擇不一致，因此對于不同的分型檢出能力就不一致[13-15]；2 份220 IU/mL 的HCV RNA 6a 型高濃度標(biāo)本未檢出，均發(fā)生在同1 批檢測中，原因可能與標(biāo)本處理不當(dāng)、病毒分布不均、提取過程受到抑制或操作過程中病毒核酸發(fā)生降解有關(guān)，這與高海拔地區(qū)的氣壓和空氣密度的影響也有一定的關(guān)系，這就對實驗室人員的操作提出了更高的要求，因此在進行核酸檢測時的操作規(guī)范性就顯得更為重要。 低濃度標(biāo)本的檢出在不同的檢測系統(tǒng)的確存在一定的差距，但不同的檢測系統(tǒng)在某種基因型上的檢出能力上也的確可能各有不同。 從性能驗證的數(shù)據(jù)看，與低海拔地區(qū)不存在明顯的差異，因此低濃度標(biāo)本的檢出情況應(yīng)該與低海拔地區(qū)沒有明顯的差異。 但系統(tǒng)本身在HCV 不同基因型的低濃度標(biāo)本的檢出上的確存在著較大的差異，這也與HCV 病毒本身的變異較大有關(guān)，不同的檢測系統(tǒng)在模板的選擇上存在著差異。 同時由于該血清盤標(biāo)本的選擇為其他系統(tǒng)檢出的低濃度標(biāo)本，因此使用在該系統(tǒng)進行檢測本身就存在一定的客觀影響，不能完全體現(xiàn)出該系統(tǒng)的檢測性能。 從HBV DNA 以及HIV-1 RNA 在低濃度的檢測數(shù)據(jù)來看，在性能上基本可以滿足實驗室檢出性能的要求。 因此總體來看，該檢測系統(tǒng)分析靈敏度基本能夠滿足實驗室實際檢測的需求。

重復(fù)性分析結(jié)果顯示均為100%，且反應(yīng)性標(biāo)本的Ct 值變異系數(shù)波動范圍較小，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的≤5%，說明該系統(tǒng)檢測的批內(nèi)精密度較好，完全能夠滿足當(dāng)?shù)匮九繕?biāo)本的檢測要求。 交叉污染性能驗證中，將陽性標(biāo)本和陰性標(biāo)本匯集交叉放置，按照日常檢測模式進行檢測，結(jié)果顯示標(biāo)本間沒有發(fā)生交叉污染，說明該核酸檢測系統(tǒng)具有良好的抗交叉污染的能力。

我國西藏地區(qū)是乙型肝炎的高發(fā)地區(qū)。 由于西藏地區(qū)的交通相對閉塞，醫(yī)療資源緊缺，因此對乙肝的防治開展較晚，獻(xiàn)血人群中HBV 的感染率和漏檢率都相對較高[12]。 為了減少HBV 的輸血傳播風(fēng)險，在西藏自治區(qū)政府的支持下，血站與國家衛(wèi)健委臨檢中心合作，對HBV DNA 低濃度標(biāo)本進行多系統(tǒng)平行檢測，以評估當(dāng)前核酸檢測實驗室檢測系統(tǒng)與其他系統(tǒng)之間的差異性[16]。 結(jié)果顯示，該核酸檢測系統(tǒng)對HBV 的檢測能力較好，雖然實驗室檢測條件與低海拔地區(qū)具有一定的差異，但對弱陽性標(biāo)本的總體陽性檢出率也達(dá)到80%左右，復(fù)測陽性符合率為59.09%—77.78%，這與檢測的次數(shù)有一定的關(guān)系，檢測次數(shù)越多，檢出的概率也越高[17]。 高海拔地區(qū)的采供血量相對較少，單檢模式的篩查策略既能夠在更大程度上減少HBV 低濃度標(biāo)本的漏檢率，也符合高海拔地區(qū)核酸實驗室的日常檢測要求。

根據(jù)國家衛(wèi)健委關(guān)于做好“組團式” 對口支援西藏采供血工作的有關(guān)部署，大連市血液中心對口支援那曲市中心血站，以充分發(fā)揮優(yōu)質(zhì)醫(yī)療衛(wèi)生資源作用。 那曲市海拔4 450米，其高海拔、低含氧量、低氣壓等特點對實驗室檢測設(shè)備、檢測技術(shù)以及檢測策略方面有不同程度的影響，與低海拔地區(qū)有著較大的差異[18-19]。 檢測設(shè)備在高海拔地區(qū)的性能驗證與低海拔地區(qū)的差異化評價是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的重要手段，針對不同的檢測系統(tǒng)進行性能驗證，能夠有效保證檢測過程標(biāo)準(zhǔn)化以及檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。 本研究通過對核酸檢測系統(tǒng)的分析靈敏度、重復(fù)性、防交叉污染等多項關(guān)鍵指標(biāo)進行驗證，對檢測策略進行評估，結(jié)果達(dá)到預(yù)期要求，可滿足高海拔地區(qū)實際檢測的工作需要，填補了高海拔地區(qū)血液篩查核酸檢測系統(tǒng)性能驗證的空白，有助于確保高海拔地區(qū)血液檢測過程的標(biāo)準(zhǔn)化，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，從而提升高海拔地區(qū)的血液安全水平，有利于提升高海拔地區(qū)的血液安全。 同時，本文提出的高海拔地區(qū)性能驗證方案和方法也能為其他高海拔地區(qū)的采供血機構(gòu)開展核酸檢測工作提供了參考。 在不同的高海拔地區(qū)，可以根據(jù)本研究的方案和方法進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整和優(yōu)化，以確保核酸檢測系統(tǒng)在各地的準(zhǔn)確性和可靠性。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。