宏基因組二代測序?qū)ο潞粑栏腥驹\斷治療的價(jià)值研究

劉莉瓊 劉露 黃暉 徐艷 萬敏娜

（江西省宜春市人民醫(yī)院1.呼吸內(nèi)科；2.全科醫(yī)學(xué)科，宜春 336000）

呼吸系統(tǒng)感染是臨床常見疾病，實(shí)驗(yàn)室檢測對呼吸系統(tǒng)感染性疾病的及時(shí)診斷和治療方案的完善有著重要意義[1]。傳統(tǒng)檢測方法存在敏感性低、特異性差等方面的不足，而且對于罕見病原微生物等不能夠快速識別，影響診斷結(jié)果，延誤臨床治療[2]。隨著研究進(jìn)展，宏基因組二代測序（metagenomic next generation sequencing，mNGS）應(yīng)用于疾病的診斷，能夠更為快速、準(zhǔn)確得對下呼吸道感染進(jìn)行診斷，便于臨床及時(shí)進(jìn)行目標(biāo)抗感染治療[3]。本院開展了這方面的研究，效果較好。匯報(bào)如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

招募2019年11月至2022年11月江西省宜春市人民醫(yī)院接診的100例疑似下呼吸道感染患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①有疑似下呼吸道感染相關(guān)癥狀；②同意行纖維支氣管鏡檢查及肺泡灌洗并將支氣管肺泡灌洗液（bronchocalveolar lavage fluid，BALF）進(jìn)行mNGS檢測；③均簽署知情同意協(xié)議書。將患者按隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組，每組50例。A組男女34∶16，年齡為20~78歲，平均（51.24±7.58）歲；B組男女33∶17，年齡為21~78歲，平均（52.16±7.96）歲。兩組上述基本資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。排除：①有精神疾病或認(rèn)知交流障礙者；②無配對的傳統(tǒng)培養(yǎng)者；③不能耐受纖維支氣管鏡檢查者；④mNGS樣本未通過質(zhì)量控制者；⑤重要數(shù)據(jù)遺失者。剔除：①病例納入后，因各種原因各個環(huán)節(jié)，發(fā)現(xiàn)不符合入選標(biāo)準(zhǔn)者；②患者依從性差，特殊生理變化，不適宜繼續(xù)接受隨訪觀察者。

1.2 方法

A組接受mNGS及常規(guī)培養(yǎng)、細(xì)菌、真菌涂片或PCR等傳統(tǒng)檢測。B組接受常規(guī)培養(yǎng)、細(xì)菌、真菌涂片或PCR等傳統(tǒng)檢測?；颊呷朐汉蟾鶕?jù)病情予抗感染、營養(yǎng)支持等對癥治療，根據(jù)檢測結(jié)果及時(shí)調(diào)整治療方案。

BALF的收集根據(jù)支氣管肺泡灌洗術(shù)操作規(guī)范進(jìn)行[4]。合格的BALF根據(jù)《宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專家共識》[5]行mNGS檢測：①樣本滅活處理后提取核酸；②通過DNA片段化、修復(fù)末端、測序接頭連接以及PCR擴(kuò)增等步驟制備文庫，然后上機(jī)進(jìn)行高通量測序；③對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制[讀長50 bp以上檢出序列數(shù)（reads）及20 M以上測序數(shù)據(jù)量]及數(shù)據(jù)過濾（去除宿主人源序列），與美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的微生物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析；④報(bào)告應(yīng)包括檢測出的所有病原微生物（10 bp以上的匹配獨(dú)特讀長及＞1%的數(shù)據(jù)庫總數(shù)比例）及其分類、檢測內(nèi)容、檢測方法、檢測結(jié)果說明及附錄；⑤臨床醫(yī)生通過綜合檢測結(jié)果及臨床特征，并結(jié)合《下呼吸道感染宏基因組二代測序報(bào)告臨床解讀路徑專家共識》[6]進(jìn)行判斷。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組檢測耗時(shí)，并以臨床最終診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，比較兩組對下呼吸道感染的診斷價(jià)值（靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度）。②每日1次，持續(xù)評定或檢測患者急性生理與慢性健康評分Ⅱ（acute physiology and chronic health e-valuationⅡ，APACHE Ⅱ）[7]、白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、降鈣素原（proealcitonin，PCT）及C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平。③根據(jù)衛(wèi)生部《抗菌藥物臨床研究指導(dǎo)原則》[8]評價(jià)臨床療效。痊愈：臨床癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查及細(xì)菌學(xué)檢查指標(biāo)均恢復(fù)正常；顯效：病情明顯好轉(zhuǎn)，但上述四項(xiàng)中1項(xiàng)未完全恢復(fù)；有效：病情有一定好轉(zhuǎn)，上述四項(xiàng)中2項(xiàng)或2項(xiàng)以上未完全恢復(fù)；無效：病情無好轉(zhuǎn)或加重，甚至死亡。總有效率=（痊愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù)）÷總例數(shù)×100%。④觀察兩組體溫、啰音、CRP、WBC、胸片檢查改善時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件，計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料符合正態(tài)分布比較采用兩個獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，符合偏態(tài)分布比較采用秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，根據(jù)樣本條件分別采用χ2檢驗(yàn)、McNemar檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組檢測耗時(shí)及診斷價(jià)值比較

A組經(jīng)臨床最終診斷確診43例為下呼吸道感染；B組經(jīng)臨床最終診斷確診41例為下呼吸道感染。A組檢測耗時(shí)短于B組（P＜0.05），對下呼吸道感染診斷的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度均高于B組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組檢測耗時(shí)及診斷價(jià)值比較

2.2 兩組APACHE Ⅱ評分、WBC、PCT及CRP水平比較

治療前，兩組APACHE Ⅱ評分、WBC、PCT及CRP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，兩組APACHE Ⅱ評分、WBC、PCT及CRP水平均低于治療前，且A組低于B組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組APACHE Ⅱ評分、WBC、PCT及CRP水平比較（±s）

表2 兩組APACHE Ⅱ評分、WBC、PCT及CRP水平比較（±s）

分組APACHE II評分/分WBC/（×109/L）PCT/（ng/mL）CRP/（mg/L）治療前治療后治療前治療后治療前治療后治療前治療后A組（n=43）21.14±3.4810.24±1.4620.22±2.318.18±1.040.87±0.090.39±0.074.78±0.981.77±0.26 B組（n=41）21.23±3.5715.77±2.4820.33±3.1414.27±1.380.89±0.110.61±0.094.81±1.212.59±0.32 t值0.17024.8370.31238.3991.45720.6090.20120.681 P值＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05

2.3 兩組療效比較

A組治療總有效率為100.00%，高于B組的85.37%（P＜0.05），見表3。

表3 兩組療效比較[n（%）]

2.4 兩組體溫、啰音、CRP、WBC、胸片檢查改善時(shí)間比較

A組體溫、啰音、CRP、WBC、胸片檢查改善時(shí)間均早于B組（P＜0.05），見表4。

表4 兩組體溫、啰音、CRP、WBC、胸片檢查改善時(shí)間比較（±s，d）

表4 兩組體溫、啰音、CRP、WBC、胸片檢查改善時(shí)間比較（±s，d）

分組體溫改善時(shí)間啰音改善時(shí)間CRP改善時(shí)間WBC改善時(shí)間胸片檢查改善時(shí)間A組（n=43）1.98±0.642.87±0.773.02±0.753.11±0.814.22±0.94 B組（n=41）2.87±0.974.02±0.944.88±0.875.12±0.926.12±1.03 t值9.1199.79416.26216.27213.254 P值＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

3 討論

下呼吸道感染是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，包括急性氣管-支氣管炎、肺炎、慢性支氣管炎急性加重、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支氣管擴(kuò)張等多種類型[9]。臨床上以發(fā)熱、咳嗽、咳痰等為主要癥狀，嚴(yán)重者可出現(xiàn)氣短、胸悶、呼吸衰竭甚至死亡。下呼吸道感染可由多重病原體引起，主要包括細(xì)菌、病毒、真菌、肺炎支原體、衣原體等多種病原微生物，特別是在免疫力低下的人群中，容易并發(fā)多重病原體感染[10-11]。因此，快速微生物學(xué)診斷對于提高肺部感染的治愈率、降低死亡率顯得尤為重要。但目前的檢測方法只能識別出30%~40%肺部感染性疾病患者的病原體[12]。病原體確診的延遲通常會迫使醫(yī)生開出經(jīng)驗(yàn)性的廣譜抗生素處方，大大增加抗生素的濫用以及多重耐藥菌的風(fēng)險(xiǎn)，并可能增加嚴(yán)重感染患者的死亡率。

由于抗生素的不合理使用等因素，病原微生物種類呈多樣化、復(fù)雜化，下呼吸道感染性疾病的診療難度越來越大，這對臨床上病原微生物的診斷方法提出了更高的要求和挑戰(zhàn)[13]。傳統(tǒng)的病原體檢測技術(shù)主要是基于病原微生物培養(yǎng)和分離，方法包括傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)技術(shù)、免疫學(xué)方法、PCR等，在病原體檢驗(yàn)及鑒定中具有不可替代的地位。但傳統(tǒng)病原體檢測受多種因素影響，有陽性率低、耗時(shí)長、對檢測人員水平要求高等缺陷，且預(yù)防性或經(jīng)驗(yàn)性抗生素的使用可能會阻礙實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)結(jié)果，生長緩慢的病原體也在一定程度上限制了實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的敏感性[14]。因此，目前迫切需要一種更靈敏、準(zhǔn)確的微生物診斷方法來彌補(bǔ)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測方式的缺陷。

mNGS作為一種新型DNA/RNA測序方法，其核心思想是邊合成邊測序，即通過捕捉新合成的末端標(biāo)記來確定DNA序列，可以同時(shí)測定幾百萬甚至上億條DNA或者RNA序列[15-16]。mNGS以其高通量、短耗時(shí)、無偏倚的特點(diǎn)在臨床工作中已逐漸得到認(rèn)可，它不僅可用于多種病原體的檢測，也可用于多種標(biāo)本的檢測，如痰液、血液、腦脊液、肺泡灌洗液、組織等[17-18]。本研究結(jié)果顯示，A組檢測耗時(shí)短于B組（P＜0.05）。A組對下呼吸道感染診斷的靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度均高于B組（P＜0.05），說明mNGS對于下呼吸道感染的病原學(xué)診斷價(jià)值更高。A組治療后APACHE Ⅱ評分、WBC等感染指標(biāo)均低于B組（P＜0.05），體溫等癥狀改善時(shí)間均早于B組（P＜0.05），治療總有效率高于B組（P＜0.05），提示患者經(jīng)積極診斷，能更及時(shí)改善診療方案，使得患者獲得更為專業(yè)的治療，預(yù)后得到明顯提高。mNGS檢測方法雖好，但依然存在一定的漏診率。其原因可能受數(shù)據(jù)庫完整性的影響，或者缺少基因數(shù)據(jù)庫，使得診斷效果受到影響。而且樣本前處理存在的污染可能也會影響結(jié)果。RNA的易降解性也使得檢測難度增加。還需進(jìn)一步提高mNGS的檢測設(shè)備、技術(shù)等，以提高診斷準(zhǔn)確性，更好地輔助臨床診治。

總之，mNGS對下呼吸道感染診斷的價(jià)值較好，可以輔助臨床診治，值得臨床推薦。