艷山姜總黃酮改善無水乙醇致胃黏膜細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制Δ

魏 晴，薛 娟，梁珊珊 （貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽(yáng) 550025）

艷山姜是姜科植物艷山姜Alpiniazerumbet（Pers.）Burtt.et Smith 的干燥根及根莖，是貴州特色苗藥，能溫中燥濕、行氣止痛，可用于心腹冷痛、胸腹脹滿、消化不良、嘔吐腹瀉等癥[1]。本課題組前期研究結(jié)果表明，艷山姜可通過抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而減輕胃黏膜損傷，對(duì)無水乙醇和阿司匹林誘導(dǎo)的小鼠急性胃潰瘍均有明顯的改善作用[2]，但關(guān)于其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制尚不明確。有研究指出，黃酮類成分是艷山姜中的主要成分，其中二氫-5，6-脫氫香豆素、5，6-脫氫卡因均具有抗實(shí)驗(yàn)性潰瘍的作用，二氫-5，6-去氫醉椒素、5，6-去氫醉椒素均能拮抗實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍和十二指腸潰瘍，山柰酚可通過調(diào)控白三烯C4和前列腺素E的表達(dá)而發(fā)揮抗?jié)冏饔肹3―4]。由此推測(cè)，黃酮類成分可能是艷山姜抗?jié)兊挠行С煞帧?/p>

微RNA（microRNA，miRNA）是內(nèi)源性的小非編碼RNA（長(zhǎng)度為17～25 個(gè)核苷酸），可通過直接與靶基因的3′-非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）結(jié)合來負(fù)向調(diào)控該靶基因的表達(dá)，從而參與多種生理過程[5―6]。研究指出，miRNA-146a-5p（miR-146a-5p）過表達(dá)可降低核因子κB p65（nuclear factor-κB p65，NF-κB p65）蛋白及mRNA 的表達(dá)水平，同時(shí)還能減少炎癥因子[腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）]的分泌，并可負(fù)向調(diào)控應(yīng)激性胃潰瘍的炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮抗胃潰瘍作用[7]；進(jìn)一步研究表明，miR-146a-5p 可通過預(yù)測(cè)靶蛋白腫瘤壞死因子受體關(guān)聯(lián)因子6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）而進(jìn)一步影響NF-κB 的下游通路，抑制人肝星狀細(xì)胞中相關(guān)細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)炎癥反應(yīng)具有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。基于艷山姜的傳統(tǒng)功效、miRNA的研究進(jìn)展和本課題組的前期探索，本研究擬以人胃黏膜細(xì)胞為對(duì)象，以無水乙醇誘導(dǎo)建立急性胃潰瘍模型，通過檢測(cè)細(xì)胞中miR-146a-5p 與胃潰瘍、炎癥相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)/含量，探討艷山姜總黃酮能否通過調(diào)控miR-146a-5p來發(fā)揮抗胃潰瘍作用，為艷山姜及其活性成分的開發(fā)及利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括CFX96 型定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）儀、Trans-Blot TurboTM型Western轉(zhuǎn)膜儀、DDY-10型電泳儀、Gel Doc XR 型凝膠成像分析儀（美國(guó)Bio-Rad 公司），D180型CO2恒溫培養(yǎng)箱（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），SMZ645 型光學(xué)顯微鏡（日本Nikon 公司），YTMB96A 全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（山東云唐智能科技有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

艷山姜藥材采自貴州省羅甸縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為姜科植物艷山姜A.zerumbet（Pers.）Burtt.et Smith的干燥根及根莖，標(biāo)本存放于貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院產(chǎn)地加工與炮制實(shí)驗(yàn)室（標(biāo)本號(hào)GY20221005001）。

兔源TRAF6、NF-κB p65、TNF-α、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)分別為CL647-66498、10745-1-AP、17590-1-AP、10494-1-AP、SA00001-2）均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；過表達(dá)miR-146a-5p（miR-146a-5p mimic）及其陰性對(duì)照（mimic NC）、敲減miR-146a-5p（miR-146a-5p inhibitor）及其陰性對(duì)照（inhibitor NC）、敲減TRAF6（TRAF6 siRNA）及其陰性對(duì)照（NC siRNA）、含TRAF6野生型（TRAF6 WT）或突變型（TRAF6 MUT）的3′-UTR片段均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；腺病毒表達(dá)載體pacAd5 CMV-GFP（批號(hào)VECT10037）購(gòu)自北京華越洋生物科技有限公司；熒光素酶pmirGLO載體（批號(hào)GN1439）購(gòu)自上海蓋寧生物科技有限公司；Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)MAN0009872）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；正常兔IgG單克隆抗體（貨號(hào)10010322-1）購(gòu)自深圳艾美捷科技有限公司；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)分別為CW0581M、CW2569M）均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；IL-1β、IL-6、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)分別為A220819、A220815、A220806）均購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物科技有限公司；MTT 試劑（貨號(hào)SR0051）購(gòu)自南京都萊生物技術(shù)有限公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（批號(hào)P0018S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；青-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）消化液、蛋白裂解液、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（批號(hào)D0010）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。

1.3 細(xì)胞

人胃黏膜細(xì)胞GES-1（貨號(hào)BFN60807461）購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 艷山姜總黃酮的制備

取艷山姜藥材，粉碎，取粗粉100 g，用95%乙醇1 000 mL加熱回流提取2 h×3次；合并提取液，過濾，濃縮，制得浸膏（浸膏得率18.69%）。取上述浸膏，用適量水溶解，再加入適量乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，濃縮，制得總黃酮浸膏[總黃酮浸膏得率2.28%，純度42.61%（以蘆丁計(jì)）]，再用水溶解，制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL（按生藥量計(jì)）的艷山姜總黃酮溶液，備用。

2.2 艷山姜總黃酮對(duì)細(xì)胞活力影響的考察及作用濃度的篩選

2.2.1 對(duì)細(xì)胞活力影響的考察

將正常GES-1 細(xì)胞接種于96 孔板中并分為空白組和艷山姜總黃酮不同質(zhì)量濃度組（24、48、60、80、120 mg/L，質(zhì)量濃度按前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M加入RPMI-1640 培養(yǎng)液（含青-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清）20 μL，其余各組分別加入含不同質(zhì)量濃度艷山姜總黃酮的RPMI-1640 培養(yǎng)液20 μL；培養(yǎng)24 h 后，每孔加入MTT 溶液20 μL[9]；孵育4 h 后，吸棄培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜150 μL，振蕩15 min后，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的光密度（OD）值并按下式計(jì)算各組細(xì)胞活力：細(xì)胞活力＝實(shí)驗(yàn)組OD 值/空白組OD值×100%。

2.2.2 作用濃度的篩選

將正常GES-1細(xì)胞接種于96孔板中并分為空白組、模型組和模型+艷山姜總黃酮不同質(zhì)量濃度組（24、48、60、80、120 mg/L，質(zhì)量濃度按前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔?？瞻捉M和模型組加入RPMI-1640培養(yǎng)液（含青-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清）20 μL；各藥物組加入含不同質(zhì)量濃度艷山姜總黃酮的RPMI-1640 培養(yǎng)液20 μL；培養(yǎng)12 h后，模型組和各藥物組分別加入無水乙醇7 μL以建立急性胃潰瘍細(xì)胞模型，空白組加入RPMI-1640 培養(yǎng)液（含青-鏈霉素雙抗和10%胎牛血清）7 μL；培養(yǎng)12 h 后，每孔加入MTT 溶液20 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)各組細(xì)胞活力，以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中艷山姜總黃酮的最適作用濃度。

2.3 細(xì)胞中miR-146a-5p表達(dá)水平的檢測(cè)

采用qRT-PCR 法進(jìn)行檢測(cè)。將正常GES-1 細(xì)胞接種于96孔板中并分為空白組、模型組和模型+艷山姜總黃酮組（質(zhì)量濃度按“2.2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。按“2.2.2”項(xiàng)下方法培養(yǎng)、處理后，收集各組細(xì)胞，提取總RNA 并使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒處理得到cDNA。以所得cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系（20 μL）包括：cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，水8 μL，2×Mix 10 μL。miR-146a-5p的上游引物為5′-AGAACTGAATTCCATGGGTT-3′，下游引物為5′-GACAGAGATATCCCAGCTGAAGAA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為397 bp；U6的上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為94 bp。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。以U6 為內(nèi)參，使用2－ΔΔCt法計(jì)算miR-146a-5p 的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果以空白組為參照進(jìn)行歸一化處理。

2.4 細(xì)胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。收集“2.3”項(xiàng)下空白組、模型組、模型+艷山姜總黃酮組細(xì)胞，以RIPA裂解液裂解、提取細(xì)胞中的總蛋白，以BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，于100 ℃下加熱5 min 變性；取變性蛋白適量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入GAPDH、NF-κB p65、TRAF6、TNF-α一抗（稀釋比例分別為1∶20 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000），于4 ℃下孵育過夜；加入相應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶1 000），于室溫下孵育1 h；用ECL 試劑顯影后，使用凝膠成像儀檢測(cè)并使用Image-Pro Plus 6軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值的比值作為目的蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果以空白組為參照進(jìn)行歸一化處理。

2.5 細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的檢測(cè)

采用ELISA 法進(jìn)行檢測(cè)。收集“2.3”項(xiàng)下空白組、模型組、模型+艷山姜總黃酮組細(xì)胞上清液，參照相應(yīng)試劑盒說明書方法，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平。

2.6 miR-146a-5p與TRAF6靶向關(guān)系的驗(yàn)證

2.6.1 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

本課題組前期采用Targetscan 預(yù)測(cè)軟件，設(shè)置物種為“human”，依據(jù)“context score”進(jìn)行miR-146a-5p 靶點(diǎn)篩選（評(píng)分越低則靶向的可能性越大），結(jié)果顯示，miR-146a-5p能夠與TRAF6的3′-UTR結(jié)合，提示兩者存在靶向關(guān)系。為進(jìn)一步確認(rèn)兩者關(guān)系，本研究采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)行驗(yàn)證：將含有預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)TRAF6 WT 或TRAF6 MUT 的3′-UTR 片段分別克隆于熒光素酶pmirGLO 載體上，經(jīng)DNA 測(cè)序驗(yàn)證后，利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑分別將TRAF6 WT 和miR-146a-5p mimic、TRAF6 WT 和mimic NC、TRAF6 MUT和miR-146a-5p mimic、TRAF6 MUT 和mimic NC 共轉(zhuǎn)染至正常GES-1細(xì)胞中（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔）；24 h后取出，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

2.6.2 RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)

將正常GES-1細(xì)胞接種于6孔板中并分為不加抗體的input組（作背景參考）、與正常兔IgG抗體共孵育的陰性對(duì)照組和與TRAF6 抗體共孵育的anti-TRAF6 組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。收集細(xì)胞，使用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀裂解緩沖液裂解；取裂解物100 μL，與含磁珠的緩沖液混合后，與正常兔IgG 抗體或TRAF6 抗體（稀釋比例均為1∶200）一起孵育；蛋白經(jīng)蛋白酶K 緩沖液消化后，使用Trizol 試劑盒分離上述抗體結(jié)合的RNA，采用qRTPCR 法測(cè)定miR-146a-5p 的表達(dá)水平（具體操作和結(jié)果處理同“2.3”項(xiàng)）。若TRAF6抗體結(jié)合的miR-146a-5p的表達(dá)高于陰性對(duì)照，則說明miR-146a-5p 與TRAF6 有特異性結(jié)合。

2.6.3 Western blot實(shí)驗(yàn)

將正常GES-1 細(xì)胞接種于6 孔板中并分為mimic NC 組、miR-146a-5p mimic 組、inhibitor NC 組和miR-146a-5p inhibitor 組，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染mimic NC、miR-146a-5p mimic、inhibitor NC、miR-146a-5p inhibitor；24 h后，收集各組細(xì)胞，采用Western blot 法檢測(cè)TRAF6 蛋白的表達(dá)水平（具體操作和結(jié)果處理同“2.4”項(xiàng)）。

2.7 過表達(dá)miR-146a-5p或敲減TRAF6對(duì)模型細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2影響的檢測(cè)

為進(jìn)一步確認(rèn)miR-146a-5p 能否通過TRAF6 調(diào)控胃潰瘍的發(fā)生，本研究借助過表達(dá)miR-146a-5p 或敲減靶點(diǎn)TRAF6 蛋白的方式，觀察急性胃潰瘍模型細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2的變化情況。取正常GES-1細(xì)胞，消化后接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h；將細(xì)胞分為模型組、模型+mimic NC 組、模型+miR-146a-5p mimic 組（過表達(dá)miR-146a-5p 實(shí)驗(yàn)），以及空白組、空白+NC siRNA組、空白+TRAF6 siRNA 組和模型組、模型+NC siRNA組、模型+TRAF6 siRNA組（敲減TRAF6實(shí)驗(yàn)），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。除模型組/空白組外，其余各組分別利用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染mimic NC、miR-146a-5p mimic、NC siRNA、TRAF6 siRNA；24 h 后，除空白組、空白+NC siRNA 組、空白+TRAF6 siRNA 組外的其余各組細(xì)胞均加入無水乙醇70 μL 以建立急性胃潰瘍細(xì)胞模型。培養(yǎng)12 h后，收集各組細(xì)胞，采用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中TRAF6 蛋白的表達(dá)水平（空白組、空白+NC siRNA 組、空白+TRAF6 siRNA 組，具體操作和結(jié)果處理同“2.4”項(xiàng)）以驗(yàn)證TRAF6 的敲減情況。再采用ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平（模型組、模型+mimic NC組、模型+miR-146a-5p mimic組和模型組、模型+NC siRNA 組、模型+TRAF6 siRNA 組，具體操作同“2.5”項(xiàng)）。

2.8 敲減miR-146a-5p 對(duì)艷山姜總黃酮抗胃潰瘍作用的影響

本研究進(jìn)一步通過敲減miR-146a-5p 的方式，觀察轉(zhuǎn)染miR-146a-5p inhibitor 能否逆轉(zhuǎn)艷山姜總黃酮對(duì)無水乙醇致胃黏膜細(xì)胞損傷的改善作用。取正常GES-1細(xì)胞，消化后接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h；將細(xì)胞分為模型+艷山姜總黃酮組、模型+艷山姜總黃酮+inhibitor NC組、模型+艷山姜總黃酮+miR-146a-5p inhibitor 組，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。除模型+艷山姜總黃酮組外，其余各組分別利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染inhibitor NC和miR-146a-5p inhibitor；24 h 后，各組細(xì)胞均用含艷山姜總黃酮（質(zhì)量濃度按“2.2.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置）的RPMI-1640 培養(yǎng)液200 μL；培養(yǎng)12 h 后，各組細(xì)胞均加入無水乙醇70 μL以建立急性胃潰瘍細(xì)胞模型。培養(yǎng)12 h后，收集各組細(xì)胞，采用Western blot 法檢測(cè)各組細(xì)胞中TRAF6 蛋白的表達(dá)水平（具體操作和結(jié)果處理同“2.4”項(xiàng)），采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平（具體操作同“2.5”項(xiàng)）。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件和GraphPad Prism 8 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 艷山姜總黃酮對(duì)細(xì)胞活力的影響及作用濃度篩選結(jié)果

隨著艷山姜總黃酮質(zhì)量濃度的升高，各藥物組細(xì)胞活力均較空白組逐漸降低，但組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見圖1A。與空白組比較，模型組細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，模型+艷山姜總黃酮48、60、80、120 mg/L組細(xì)胞活力均顯著升高（P＜0.05 或P＜0.01），詳見圖1B。因此，選取對(duì)細(xì)胞無明顯毒性但能改善無水乙醇所致?lián)p傷的60 mg/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)艷山姜總黃酮的作用濃度。

圖1 艷山姜總黃酮對(duì)細(xì)胞活力的影響及作用濃度篩選的結(jié)果（±s，n＝6）

3.2 艷山姜總黃酮對(duì)模型細(xì)胞中miR-146a-5p、炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)和上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響

與空白組比較，模型組細(xì)胞中miR-146a-5p 的相對(duì)表達(dá)量和上清液中PGE2水平均顯著降低（P＜0.01），細(xì)胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α蛋白的表達(dá)水平和上清液中IL-1β、IL-6水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，模型+艷山姜總黃酮組細(xì)胞中miR-146a-5p的相對(duì)表達(dá)量和上清液中PGE2水平均顯著升高（P＜0.01），細(xì)胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α蛋白的表達(dá)水平和上清液中IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）。結(jié)果見圖2、表1。

表1 艷山姜總黃酮對(duì)模型細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

表1 艷山姜總黃酮對(duì)模型細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01。

組別空白組模型組模型+艷山姜總黃酮組IL-1β/（ng/mL）3.17±0.12 18.32±1.13a 8.25±0.32b IL-6/（ng/mL）5.95±0.35 18.11±1.22a 8.68±0.92b PGE2/（ng/mL）6.86±0.38 3.14±0.19a 4.53±0.23b

圖2 艷山姜總黃酮對(duì)模型細(xì)胞中miR-146a-5p 和NFκB p65、TRAF6、TNF-α 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝6）

3.3 miR-146a-5p與TRAF6靶向關(guān)系的驗(yàn)證結(jié)果

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果（圖3A）顯示，轉(zhuǎn)染TRAF6 WT 后，共轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic 細(xì)胞的熒光素酶活性顯著低于共轉(zhuǎn)染mimic NC 細(xì)胞（P＜0.01）；而轉(zhuǎn)染TRAF6 MUT后，共轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic細(xì)胞的熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染mimic NC 細(xì)胞比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3B）顯示，與陰性對(duì)照比較，miR-146a-5p 在TRAF6抗體上的表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。進(jìn)一步的Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3C、3D）顯示，與mimic NC 組比較，轉(zhuǎn)染miR-146a-5p mimic 后，細(xì)胞中TRAF6 蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；與inhibitor NC 組比較，轉(zhuǎn)染miR-146a-5p inhibitor 后，細(xì)胞中TRAF6 蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。

圖3 miR-146a-5p與TRAF6靶向關(guān)系的驗(yàn)證結(jié)果

3.4 過表達(dá)miR-146a-5p或敲減TRAF6對(duì)模型細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響

3.4.1 過表達(dá)miR-146a-5p實(shí)驗(yàn)

與模型組或模型+mimic NC 組比較，模型+miR-146a-5p mimic 組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），PGE2水平顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 過表達(dá)miR-146a-5p對(duì)模型細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

表2 過表達(dá)miR-146a-5p對(duì)模型細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

a：與模型組比較，P＜0.05；b：與模型+mimic NC組比較，P＜0.05。

組別模型組模型+mimic NC組模型+miR-146a-5p mimic組PGE2/（ng/mL）5.92±0.28 5.74±0.27 6.93±0.32ab IL-1β/（ng/mL）3.20±0.12 3.02±0.11 2.17±0.09ab IL-6/（ng/mL）6.03±0.38 5.89±0.32 4.64±0.18ab

3.4.2 敲減TRAF6實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染TRAF6 siRNA 后，細(xì)胞中TRAF6 蛋白的表達(dá)水平顯著低于空白組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染NC siRNA的細(xì)胞（P＜0.05），表明敲減TRAF6蛋白的GES-1細(xì)胞構(gòu)建成功（圖4）。與模型組或模型+NC siRNA 組比較，模型+TRAF6 siRNA 組細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（P＜0.05），PGE2水平顯著升高（P＜0.05），說明TRAF6蛋白能夠激活下游通路，刺激無水乙醇誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞分泌炎癥因子（表3）。

表3 敲減TRAF6 對(duì)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

表3 敲減TRAF6 對(duì)細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

a：與模型組比較，P＜0.05；b：與模型+NC siRNA組比較，P＜0.05。

組別模型組模型+NC siRNA組模型+TRAF6 siRNA組PGE2/（ng/mL）5.86±0.28 5.80±0.27 6.84±0.29ab IL-1β/（ng/mL）3.17±0.12 3.14±0.11 2.05±0.08ab IL-6/（ng/mL）5.95±0.35 5.91±0.34 3.17±0.17ab

3.5 敲減miR-146a-5p對(duì)模型細(xì)胞中TRAF6蛋白表達(dá)及上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響

與模型+艷山姜總黃酮組或模型+艷山姜總黃酮+inhibitor NC組比較，模型+艷山姜總黃酮+miR-146a-5p inhibitor組細(xì)胞中TRAF6蛋白的表達(dá)水平和上清液中IL-1β、IL-6水平均顯著升高（P＜0.05），PGE2水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖5、表4。

表4 敲減miR-146a-5p 對(duì)模型細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6、PGE2水平的影響（±s，n＝6）

a：與模型+艷山姜總黃酮組比較，P＜0.05；b：與模型+艷山姜總黃酮+inhibitor NC組比較，P＜0.05。

PGE2/（ng/mL）6.28±0.34 5.89±0.30 3.47±0.19ab組別模型+艷山姜總黃酮組模型+艷山姜總黃酮+inhibitor NC組模型+艷山姜總黃酮+miR-146a-5p inhibitor組IL-1β/（ng/mL）2.28±0.09 2.31±0.10 3.68±0.28ab IL-6/（ng/mL）5.01±0.29 4.89±0.27 6.24±0.38ab

圖5 敲減miR-146a-5p 對(duì)模型細(xì)胞中TRAF6 蛋白表達(dá)的影響

4 討論

作為貴州特色苗藥，艷山姜常被用于治療胃潰瘍?，F(xiàn)代研究表明，黃酮類成分是艷山姜的主要成分，包括蘆丁、槲皮素和山柰酚等；同時(shí)，黃酮類成分也是艷山姜的藥效成分，具有降壓、利尿和抗?jié)兊幕钚訹10]。因此，本研究以艷山姜總黃酮為干預(yù)成分，以人GES-1細(xì)胞為對(duì)象，評(píng)價(jià)艷山姜總黃酮對(duì)無水乙醇致急性胃潰瘍模型細(xì)胞的改善作用。結(jié)果表明，艷山姜總黃酮能通過抑制細(xì)胞中NF-κB p65、TRAF6、TNF-α蛋白的表達(dá)和下游炎癥因子IL-1β、IL-6的分泌，從而發(fā)揮對(duì)胃黏膜細(xì)胞損傷的改善作用。

miRNA由內(nèi)源基因編碼，對(duì)多種生物學(xué)行為具有重要的調(diào)節(jié)作用，可廣泛參與多種基因表達(dá)和RNA 沉默的調(diào)控[11―12]。綜合既往文獻(xiàn)和現(xiàn)代研究進(jìn)展，本研究選擇了與胃潰瘍相關(guān)的miR-146a-5p進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在無水乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍模型細(xì)胞中，miR-146a-5p 的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，而模型+艷山姜總黃酮組細(xì)胞中miR-146a-5p的相對(duì)表達(dá)量顯著升高。

為進(jìn)一步探索miR-146a-5p 對(duì)胃潰瘍的調(diào)控作用，本研究通過qRT-PCR、Western blot、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等實(shí)驗(yàn)對(duì)miR-146a-5p的靶點(diǎn)和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探討。雙熒光素酶報(bào)告基因、RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀實(shí)驗(yàn)和針對(duì)TRAF6 蛋白的Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)了miR-146a-5p與TRAF6蛋白之間存在靶向關(guān)系，且miR-146a-5p能夠負(fù)向調(diào)控TRAF6蛋白的表達(dá)。本研究經(jīng)進(jìn)一步過表達(dá)miR-146a-5p 或敲減TRAF6 后發(fā)現(xiàn)，無水乙醇致急性胃潰瘍模型細(xì)胞上清液中與炎癥相關(guān)的IL-1β 和IL-6水平均顯著降低，而與胃潰瘍相關(guān)的PGE2水平顯著升高，說明過表達(dá)miR-146a-5p 或敲減TRAF6 均能抑制下游炎癥因子的釋放，從而發(fā)揮抗胃潰瘍作用。

為進(jìn)一步探索TRAF6 對(duì)下游通路的影響，本研究通過Western blot法對(duì)TRAF6下游的NF-κB p65和TNFα蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，在無水乙醇誘導(dǎo)的急性胃潰瘍模型細(xì)胞中，艷山姜總黃酮能顯著提高上述蛋白的表達(dá)。TRAF6、NF-κB p65、TNF-α均為NF-κB信號(hào)通路上的關(guān)鍵蛋白，而NF-κB通路能夠調(diào)控胃黏膜上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生[13―15]。研究指出，在生長(zhǎng)因子等活性物質(zhì)的刺激下，胃潰瘍患者的胃黏膜上皮細(xì)胞通透性增加，可使有毒物質(zhì)和病原微生物穿過胃壁，從而激活TRAF6；TRAF6 可進(jìn)一步激活下游核因子κB 抑制因子B（inhibitory subunit of NF-κB，IкB），使細(xì)胞質(zhì)中原本與IкB蛋白相結(jié)合的NF-кB從復(fù)合體中釋放出來，并遷移到細(xì)胞核中；細(xì)胞核中的NF-кB可觸發(fā)其他促炎細(xì)胞因子（如IL-1β 和TNF-α）的轉(zhuǎn)錄和釋放，從而促進(jìn)潰瘍的發(fā)展[16―18]。本研究結(jié)果還表明，艷山姜總黃酮可上調(diào)無水乙醇致急性胃潰瘍模型細(xì)胞中miR-146a-5p 的表達(dá)；敲減miR-146a-5p 可逆轉(zhuǎn)艷山姜總黃酮對(duì)急性胃潰瘍模型細(xì)胞的改善作用，增加IL-1β、IL-6 的分泌，提示艷山姜總黃酮可通過上調(diào)miR-146a-5p 而抑制TRAF6的表達(dá)，進(jìn)一步抑制下游炎癥因子的分泌，從而發(fā)揮抗胃潰瘍作用。

綜上所述，艷山姜總黃酮對(duì)無水乙醇致胃黏膜細(xì)胞損傷有一定的改善作用，其機(jī)制可能與上調(diào)miR-146a-5p的表達(dá)、抑制TRAF6蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制相關(guān)炎癥因子的分泌有關(guān)。本研究結(jié)果為艷山姜總黃酮促進(jìn)miR-146a-5p 表達(dá)、參與調(diào)控胃潰瘍的研究提供了新的證據(jù)，對(duì)進(jìn)一步挖掘胃潰瘍的治療方法具有重要意義。