異鉤藤堿對哮喘小鼠氣道炎癥的影響Δ

蔡 金 ，華詔召 ，張昌容 ，黃 丹 ，張淇華 ，王 毅 ，周素芳 ，劉 蓮 ，龔 安 （.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)經(jīng)典科，貴陽 55000；.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科，貴陽 55000；.貴州中醫(yī)藥大學(xué)微生態(tài)研究中心，貴陽 55000；.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床微生物與免疫學(xué)教研室，貴陽 55000；5.江西中醫(yī)藥大學(xué)岐黃國醫(yī)書院，南昌 005）

哮喘是一種常見的以氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥為特征的疾病，以咳嗽、喘息、胸悶和呼吸困難為主要癥狀，無法治愈。除了避免接觸過敏原，只能使用β 腎上腺素受體激動劑、吸入性皮質(zhì)類固醇或白三烯D4 受體拮抗劑治療哮喘，但長期使用上述藥物容易引發(fā)白內(nèi)障、骨質(zhì)疏松等不良反應(yīng)，故尋找新的治療方案至關(guān)重要[1]。異鉤藤堿（isorhynchophylline，IRN）是鉤藤的主要活性成分之一，具有抗高血壓、保護(hù)神經(jīng)、抗增殖和抗炎等多種生物學(xué)效應(yīng)[2]，主要用于治療心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[3]。Zhu 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，IRN 能抑制炎癥因子的產(chǎn)生以及氣道平滑肌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，具有治療哮喘的潛在作用。單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）也被稱為CC 趨化因子配體2（CC chemokine ligand 2，CCL2），是CC 趨化因子家族的成員，可與CC 趨化因子受體2（CC chemokine receptor 2，CCR2）結(jié)合，在單核巨噬細(xì)胞和T 細(xì)胞的遷移中起關(guān)鍵作用，是治療慢性炎癥性疾病和急性肺損傷的潛在靶點[5―6]?；谝陨衔墨I(xiàn)，本研究擬探討IRN 調(diào)節(jié)MCP-1/CCR2 信號通路對哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)的影響，旨在為尋找治療哮喘新藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

402AI型超聲霧化器購自江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；CX43 型光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus 公司；elx808型多功能酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；IC1000型全自動細(xì)胞計數(shù)器購自北京眾力挽生物科技有限公司；RM2235型石蠟切片機(jī)購自德國Leica公司。

1.2 主要藥品與試劑

IRN 對照品（貨號Ⅱ0310，純度≥98%）、蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色液（貨號G1120）均購自北京索萊寶科技有限公司；醋酸地塞米松片（貨號02621，規(guī)格0.75 mg）購自浙江仙琚制藥股份有限公司；卵清蛋白（貨號9006-59-1）購自美國Sigma Aldrich 公司；MCP-1/CCR2 信號通路激活劑CCL2 蛋白[貨號JN-（Ea）-02244]購自美國R&D Systems公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素13（interleukin-13，IL-13）、IL-4 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號分別為ml002095、ml063123、ml0631556）均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（貨號P0012）、RIPA緩沖液（貨號P0013）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠MCP-1、CCR2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗（貨號分別為ab308522、ab273050、ab8245、ab205719）均購自英國Abcam公司。

1.3 實驗動物

SPF級雌性BALB/c小鼠，7周齡，體重（18±2）g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（渝）2022-0011。小鼠飼養(yǎng)在單獨(dú)通風(fēng)的無菌籠里，室溫為22 ℃，相對濕度控制在（50±5）%，12 h 晝夜交替，并隨時獲得標(biāo)準(zhǔn)食物和正常飲用水。本研究所有動物實驗均經(jīng)貴州中藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（倫理編號20220006）。

2 方法

2.1 哮喘小鼠模型的建立、分組與給藥

參照文獻(xiàn)方法[7]建立哮喘小鼠模型：隨機(jī)選取50只小鼠，分別在第1、7、14天腹膜內(nèi)注射20 μg卵清蛋白和2 mg 氫氧化鋁佐劑，在第21 至27 天通過超聲霧化器吸入3%卵清蛋白溶液（每天1 次，每次30 min）。另取10只小鼠，分別在第1、7、14天腹膜內(nèi)注射等劑量的無菌磷酸鹽緩沖液（PBS），在第21至27天通過超聲霧化器吸入3%無菌PBS（每天1 次，每次30 min），標(biāo)記為空白對照組。當(dāng)造模小鼠出現(xiàn)煩躁不安、脾氣躁動、張口喘息并伴有飲水、噴嚏增多等現(xiàn)象，標(biāo)志著哮喘小鼠模型建立成功。將50只造模成功的小鼠隨機(jī)分為哮喘組、IRN低劑量（IRN-L）組、IRN 高劑量（IRN-H）組、IRN-H+CCL2組、陽性對照組，每組10只。其中，陽性對照組小鼠腹腔注射2 mg/kg地塞米松，同時灌胃生理鹽水[8]；IRN-L組、IRN-H 組小鼠分別灌胃10、20 mg/kg IRN[9]，同時腹腔注射生理鹽水；IRN-H+CCL2 組小鼠灌胃20 mg/kg IRN，同時腹腔注射7.5 ng CCL2[10]；哮喘組及空白對照組小鼠分別灌胃及腹腔注射等體積的生理鹽水，每天1 次，連續(xù)2周。

2.2 小鼠呼吸間歇值的檢測

干預(yù)結(jié)束后，小鼠按50 mg/kg 腹腔注射2%戊巴比妥鈉，麻醉成功后，切開氣管進(jìn)行插管。將小鼠放入與呼吸機(jī)相連的空腔中，待其呼吸穩(wěn)定后，分別以3.125、6.25、12.5 mg/mL 乙酰甲膽堿激發(fā)，以分析氣道高反應(yīng)指標(biāo)——呼吸間歇（enhanced pause，Penh）值。

2.3 標(biāo)本采集

氣道高反應(yīng)指標(biāo)檢測結(jié)束后，摘除小鼠眼球，取血0.3～0.5 mL，在室溫下靜置2 h 后，以2 500 r/min 離心20 min，收集血清儲存在－80 °C下備用；然后，處死小鼠進(jìn)行組織分離并暴露氣管，用0.5 mL預(yù)冷的PBS沖洗左肺，收集支氣管肺泡灌洗液，在4 ℃下以1 500 r/min 離心10 min，收集上清液儲存在－80 °C下備用；分離右肺組織，部分固定在4%甲醛溶液中，用于病理學(xué)檢測，另一部分儲存在－80 °C下備用。

2.4 小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平的檢測

取“2.3”項下血清樣本，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，利用多功能酶標(biāo)儀檢測吸光度值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平。

2.5 小鼠支氣管肺泡灌洗液中炎癥細(xì)胞的檢測

取“2.3”項下支氣管肺泡灌洗液上清液，以PBS 重懸，在細(xì)胞沉降前將細(xì)胞懸液移入離心管中，并進(jìn)行瑞氏染色，將混合物孵育5 min，采用全自動細(xì)胞計數(shù)器對炎癥細(xì)胞[嗜酸性粒細(xì)胞（eosinophil，EOS）、淋巴細(xì)胞（lymphocyte，LYM）和中性粒細(xì)胞（neutrophil，NEU）]進(jìn)行分類計數(shù)。

2.6 小鼠肺組織病理學(xué)變化及炎癥細(xì)胞浸潤評分的檢測

取“2.3”項下固定在4%甲醛溶液的小鼠肺組織，經(jīng)石蠟包埋、切片（5 μm）后用HE 染色。使用光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)變化，參照文獻(xiàn)方法[11]評估炎癥細(xì)胞浸潤評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無炎癥細(xì)胞浸潤；1分，少量炎癥細(xì)胞浸潤；2 分，層厚為1 個細(xì)胞，炎癥細(xì)胞構(gòu)成環(huán)狀；3分，層厚為2～4個細(xì)胞，炎癥細(xì)胞構(gòu)成環(huán)狀；4分，層厚大于4個細(xì)胞，炎癥細(xì)胞構(gòu)成環(huán)狀。

2.7 小鼠肺組織中MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平的檢測

取“2.3”項下凍存的小鼠右肺組織，加入RIPA 緩沖液研磨后于冰上裂解，離心后（4 ℃，3 000 r/min，15 min）取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度，沸水煮10 min使蛋白變性；每個樣品取40 μg變性蛋白，經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離（電壓90 V），并在冰上轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，加入5%脫脂奶粉，室溫下封閉2 h；將封閉液稀釋的MCP-1、CCR2、GAPDH 一抗（稀釋比均為1∶500）加至聚偏二氟乙烯膜上，搖床孵育30 min，4 ℃靜置過夜；以TBST緩沖液洗膜，室溫下加入二抗（稀釋比為1∶1 000），搖床孵育2 h；TBST 緩沖液洗膜，將膜浸泡在ECL 化學(xué)發(fā)光液中進(jìn)行顯色、成像。使用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行量化，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）條帶的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 27.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并以GraphPad Prism 8.0 軟件作圖。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 IRN對小鼠Penh值的影響

小鼠分別用3.125、6.25、12.5 mg/mL 乙酰甲膽堿激發(fā)后，與空白對照組比較，哮喘組小鼠Penh 值均顯著增加（P＜0.05）；與哮喘組比較，IRN-L 組、IRN-H 組、陽性對照組小鼠Penh 值均顯著降低（P＜0.05）；與IRN-L 組比較，IRN-H 組、陽性對照組小鼠Penh 值均顯著降低（P＜0.05）；IRN-H 組與陽性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與IRN-H 組比較，IRN-H+CCL2 組小鼠Penh值均顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠氣道高反應(yīng)指標(biāo)Penh 值的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表1 各組小鼠氣道高反應(yīng)指標(biāo)Penh 值的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與哮喘組比較，P＜0.05；c：與IRN-L組比較，P＜0.05；d：與IRN-H組比較，P＜0.05。

組別空白對照組哮喘組IRN-L組IRN-H組IRN-H+CCL2組陽性對照組3.125 mg/mL劑量下Penh值0.11±0.01 0.65±0.07a 0.45±0.05b 0.21±0.03bc 0.52±0.06d 0.18±0.02bc 6.25 mg/mL劑量下Penh值0.86±0.09 2.14±0.22a 1.57±0.16b 1.02±0.11bc 1.66±0.17d 0.92±0.10bc 12.5 mg/mL劑量下Penh值2.07±0.21 6.54±0.66a 3.85±0.39b 2.27±0.23bc 4.48±0.45d 2.11±0.22bc

3.2 IRN對小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平的影響

與空白對照組比較，哮喘組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與哮喘組比較，IRNL 組、IRN-H 組、陽性對照組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α 水平均顯著降低（P＜0.05）；與IRN-L 組比較，IRN-H組、陽性對照組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）；IRN-H 組與陽性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與IRN-H組比較，IRNH+CCL2 組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α 水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α 水平的檢測結(jié)果（±s，n＝10，pg/mL）

表2 各組小鼠血清中IL-4、IL-13、TNF-α 水平的檢測結(jié)果（±s，n＝10，pg/mL）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與哮喘組比較，P＜0.05；c：與IRN-L組比較，P＜0.05；d：與IRN-H組比較，P＜0.05。

IL-4 10.27±1.05 58.61±5.88a 34.58±3.47b 19.77±1.99bc 38.59±3.88d 16.53±1.68bc組別空白對照組哮喘組IRN-L組IRN-H組IRN-H+CCL2組陽性對照組TNF-α 21.85±2.19 75.64±7.58a 53.21±5.36b 29.52±2.97bc 62.34±6.24d 24.25±2.44bc IL-13 52.34±5.27 162.04±16.24a 104.28±12.46b 75.62±7.66bc 128.53±12.86d 60.27±6.11bc

3.3 IRN 對小鼠支氣管肺泡灌洗液中EOS、LYM 和NEU數(shù)量的影響

與空白對照組比較，哮喘組小鼠支氣管肺泡灌洗液中EOS、LYM、NEU 數(shù)量均顯著增加（P＜0.05）；與哮喘組比較，IRN-L 組、IRN-H 組、陽性對照組小鼠支氣管肺泡灌洗液中EOS、LYM、NEU 數(shù)量均顯著降低（P＜0.05）；與IRN-L組比較，IRN-H組、陽性對照組小鼠支氣管肺泡灌洗液中EOS、LYM、NEU數(shù)量均顯著降低（P＜0.05）；IRN-H 組與陽性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與IRN-H 組比較，IRN-H+CCL2 組小鼠支氣管肺泡灌洗液中EOS、LYM、NEU 數(shù)量均顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠炎癥細(xì)胞數(shù)量的檢測結(jié)果（±s，n＝10，×104 mL－1）

表3 各組小鼠炎癥細(xì)胞數(shù)量的檢測結(jié)果（±s，n＝10，×104 mL－1）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與哮喘組比較，P＜0.05；c：與IRN-L組比較，P＜0.05；d：與IRN-H組比較，P＜0.05。

NEU 0.78±0.08 2.88±0.29a 2.17±0.23b 1.27±0.13bc 2.26±0.23d 1.14±0.12bc組別空白對照組哮喘組IRN-L組IRN-H組IRN-H+CCL2組陽性對照組EOS 0.55±0.06 2.08±0.21a 1.53±0.16b 0.81±0.09bc 1.66±0.17d 0.72±0.08bc LYM 2.55±0.27 6.85±0.69a 3.86±0.39b 2.89±0.29bc 4.55±0.46d 2.75±0.28bc

3.4 IRN 對小鼠肺組織病理學(xué)變化及炎癥細(xì)胞浸潤評分的影響

與空白對照組（炎癥細(xì)胞浸潤評分為0.78±0.08）比較，哮喘組小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤較明顯，并有細(xì)胞腫脹、脫落現(xiàn)象發(fā)生，炎癥細(xì)胞浸潤評分（3.37±0.35）顯著升高（P＜0.05）；與哮喘組比較，IRN-L 組、IRN-H 組、陽性對照組小鼠氣道及支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤減少，病理損傷得到改善，炎癥細(xì)胞浸潤評分（2.27±0.13、1.07±0.11、0.86±0.09）均顯著降低（P＜0.05）；與IRN-L組比較，IRN-H 組、陽性對照組小鼠病理損傷進(jìn)一步得到改善，炎癥細(xì)胞浸潤評分均顯著降低（P＜0.05）；IRNH 組與陽性對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與IRN-H 組比較，IRN-H+CCL2 組小鼠病理損傷加重，出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、脫落現(xiàn)象，炎癥細(xì)胞浸潤評分（2.46±0.25）顯著增加（P＜0.05）。具體顯微圖見圖1。

3.5 IRN對小鼠肺組織中MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平的影響

與空白對照組比較，哮喘組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與哮喘組比較，IRN-L組、IRN-H組、陽性對照組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；與IRN-L組比較，IRN-H 組、陽性對照組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）；IRN-H 組與陽性對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與IRN-H 組比較，IRN-H+CCL2 組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2、表4。

圖2 各組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達(dá)的電泳圖

表4 各組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

表4 各組小鼠肺組織中MCP-1、CCR2 蛋白表達(dá)水平的檢測結(jié)果（±s，n＝10）

a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與哮喘組比較，P＜0.05；c：與IRN-L組比較，P＜0.05；d：與IRN-H組比較，P＜0.05。

CCR2/GAPDH 0.34±0.04 1.18±0.12a 0.75±0.08b 0.42±0.05bc 0.88±0.09d 0.38±0.04bc組別空白對照組哮喘組IRN-L組IRN-H組IRN-H+CCL2組陽性對照組MCP-1/GAPDH 0.21±0.03 0.86±0.19a 0.55±0.06b 0.24±0.03bc 0.66±0.07d 0.23±0.03bc

4 討論

本研究通過注射和吸入卵清蛋白的方法建立哮喘小鼠模型，當(dāng)小鼠出現(xiàn)煩躁不安、脾氣躁動、張口喘息并伴有飲水、噴嚏增多等現(xiàn)象，標(biāo)志著哮喘小鼠模型建立成功，可進(jìn)入下一步研究。IRN是一種四環(huán)氧吲哚生物堿，具有抗炎、神經(jīng)保護(hù)及抗氧化作用[9]。IRN可以減輕吸入二氧化硅導(dǎo)致的肺部炎癥反應(yīng)和纖維化[12]。此外，Li 等[13]通過體內(nèi)外實驗研究發(fā)現(xiàn)，IRN 可能通過抑制自噬來減輕哮喘癥狀，可成為治療哮喘的潛在藥物?；谝陨险{(diào)研，筆者推測IRN可能具有改善哮喘的作用。本研究結(jié)果顯示，哮喘小鼠經(jīng)IRN 干預(yù)后，病理損傷得到改善；炎癥細(xì)胞浸潤評分，Penh值，IL-4、IL-13、TNF-α水平以及EOS、NEU、LYM數(shù)量均明顯降低；且IRN高劑量干預(yù)效果與陽性對照藥相當(dāng)。這表明IRN 可通過抑制氣道炎癥反應(yīng)來發(fā)揮改善哮喘的作用，與文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果基本吻合，但其作用機(jī)制仍需深入探索。

趨化因子是一類能誘導(dǎo)反應(yīng)細(xì)胞定向趨化的細(xì)胞因子，能引導(dǎo)表達(dá)趨化因子受體的細(xì)胞遷移到局部趨化因子配體濃度高的位點，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。作為趨化因子家族的成員，MCP-1（又稱CCL2）與其受體CCR2參與了多種炎癥和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[14]。研究表明，CCL2 與哮喘兒童的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，研究其相關(guān)機(jī)制可為兒童特應(yīng)性哮喘的診斷標(biāo)志物挖掘提供方向[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，哮喘小鼠肺組織中MCP-1、CCR2蛋白表達(dá)水平均顯著升高，提示哮喘發(fā)生可能與MCP-1/CCR2信號通路激活有關(guān)；經(jīng)IRN 干預(yù)后，MCP-1、CCR2 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，哮喘小鼠的炎癥反應(yīng)也顯著減弱，病理損傷也得到改善，推測IRN 可能通過抑制MCP-1/CCR2信號通路的激活來減輕哮喘小鼠的氣道炎癥。為證明上述推測，本研究以MCP-1/CCR2信號通路激活劑CCL2 進(jìn)行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCL2 逆轉(zhuǎn)了高劑量IRN 對哮喘小鼠的保護(hù)作用，表明IRN對哮喘小鼠的氣道炎癥具有抑制作用，可能與抑制MCP-1/CCR2信號通路的激活有關(guān)。

綜上所述，IRN 可能通過抑制MCP-1/CCR2 信號通路的激活來減少哮喘小鼠氣道炎癥因子的釋放，從而達(dá)到改善哮喘的目的；但由于哮喘發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，后續(xù)將進(jìn)一步深入研究。