沖和膏促進腫瘍消散的體內(nèi)外機制研究Δ

楊麗萍 ，周 帥 ，賈 晴 ，劉善釗 ，劉 鈺 ，2#（.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長沙 40208）

腫瘍指體表外科疾病尚未破潰的腫塊，本病相當于西醫(yī)所指的發(fā)生在體表軟組織的感染化膿性疾病[1]。體表軟組織感染是外科常見病，多由金黃色葡萄球菌感染所致，主要表現(xiàn)為紅腫熱痛，若治療不及時不僅能夠?qū)е陆M織壞死，而且可通過血液擴散而導(dǎo)致肺部感染，甚至可能引發(fā)敗血癥、感染性休克而危及患者生命[2]。腫瘍的傳統(tǒng)治療以抗生素為主，但由于抗生素的濫用導(dǎo)致細菌敏感性降低[3]，致使治療效果欠佳。

箍圍藥作為中醫(yī)外治藥物的一種，具有直達病所、快速改善癥狀的特點[1]。箍圍藥代表方?jīng)_和膏出自《外科正宗》，由石菖蒲、白芷、獨活、赤芍、紫荊皮5 味藥組成，具有活血化瘀、軟堅消腫的功效[4]，臨床治療乳腺炎、皮下血腫等癥的效果良好[5―6]，但其作用機制尚不明確?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲、白芷、獨活、赤芍、紫荊皮均具有一定的抑菌效果[7―11]?；诖?，本研究先通過體外抑菌實驗觀察沖和膏的抑菌作用，再采用皮下注射金黃色葡萄球菌的方法建立大鼠皮下軟組織感染模型，探究該方促進腫瘍消散的作用機制，旨在為沖和膏的深入研究和應(yīng)用提供理論依據(jù)，也為抗感染替代或輔助治療中藥方案的研發(fā)提供方向。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Nikon Eclipse E100 型正置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon 公司），JJ-12J 型脫水機、JBP5型包埋機（武漢俊杰電子有限公司），RM2016型病理切片機（上海徠卡儀器有限公司），SW-CJ-2D 型超凈工作臺（上海蘇凈實業(yè)有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

石菖蒲、白芷、獨活、赤芍飲片（批號分別為180401、180401、180101、171101）均購自內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，紫荊皮飲片（批號20190101）購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，上述飲片經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院師建平教授鑒定均為真品。復(fù)方多黏菌素B 軟膏（批號H20061269，規(guī)格20 g）購自浙江孚諾醫(yī)藥股份有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染液、中性樹膠（批號分別為G1005、G1403）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；Masson染色試劑盒（批號BP-DL021）購自南京森貝伽生物科技有限公司；轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）試劑盒、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）試劑盒（批號分別為L190828365、L190917690）均購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司；兔源Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原單克隆抗體（批號分別為ab270993、ab184993）均購自英國Abcam公司；鼠源基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、MMP-9單克隆抗體（貨號分別為sc-13594、sc-393859）均購自美國Santa Cruz 公司；鼠源β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體（貨號AA128）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號PC0020）購自北京索萊寶科技有限公司；二甲苯、無水乙醇（批號分別為10023418、100092683）均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實驗菌株與動物

本研究所用的金黃色葡萄球菌菌株（編號CMCC26112-10）、大腸埃希菌菌株[編號CMCC（B）44102]、銅綠假單胞菌菌株[編號CMCC（B）10104]、白色葡萄球菌菌株（批號26112-10）、肺炎鏈球菌菌株（批號31001-qa1）均來自中國食品藥品檢定研究院。

SPF 級雄性Wistar 大鼠120 只，6 周齡，體重（200±10）g，購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK（蒙）2020-0001。所有大鼠均飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房（12 h光暗交替，相對濕度40%～60%，溫度22～25 ℃）內(nèi)，自由攝食、飲水，適應(yīng)環(huán)境5 d后用于實驗。本研究方案經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審查（編號YKD202201104）。

2 方法

2.1 沖和膏藥膏的制備

將紫荊皮、獨活、赤芍、石菖蒲、白芷飲片粉碎，過40目篩，粉末于干燥環(huán)境下常溫保存。按照沖和膏原方比例稱取紫荊皮、獨活、赤芍、石菖蒲、白芷飲片粉末（質(zhì)量比為5∶3∶2∶1.5∶1），共50 g，置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入400 mL的雙蒸水，加熱回流提取1 h，過濾，收集藥液；再加入400 mL 的95%乙醇提取1 h，過濾，收集藥液；將上述藥液混合，減壓蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得到?jīng)_和膏凍干粉（得率40%）。將凍干粉與蒸餾水按照3∶7的質(zhì)量-體積比混合，制成沖和膏藥膏，待用。

2.2 體外實驗

采取打孔法檢測沖和膏藥膏對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色葡萄球菌、肺炎鏈球菌5種常見細菌的抑菌作用。使用6 mm的打孔器在MH培養(yǎng)基上均勻打6個孔，用移液槍吸取200 μL菌懸液滴于培養(yǎng)基中央，用滅菌后的三角玻璃棒均勻涂布，按照順時針方向在每個孔中依次加入生理鹽水和25、50、100、200、400 mg/mL的沖和膏藥液（由沖和膏凍干粉和生理鹽水按不同比例配成）各50 μL，在培養(yǎng)基外緣做好標記，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，拍照后使用Image J 軟件測量抑菌圈直徑。每個類型的菌株重復(fù)操作5次，結(jié)果取平均值。

2.3 體內(nèi)實驗

2.3.1 分組、造模與給藥

將120 只大鼠隨機分為正常組、模型組、沖和膏組、西藥組（復(fù)方多黏菌素B 軟膏，陽性對照），每組30 只。正常組大鼠不予處理，其余3組大鼠按下法建立皮下軟組織感染模型：大鼠背部脫毛，于脫毛區(qū)域（3 cm×3 cm）正中皮下注射金黃色葡萄球菌混懸液（用生理鹽水配制，密度為1.0×1011cfu/mL）0.5 mL，每天1 次，連續(xù)3 d。3 d后，若注射部位出現(xiàn)明顯紅腫、觸痛，觸之有明顯波動感即造模成功[12]。造模成功后，分別于沖和膏組和西藥組大鼠腫瘍周圍部位敷以相應(yīng)藥物（但中間留一個半徑為1 cm 的圓孔不敷藥物），每天1 次，連續(xù)給藥14 d；模型組大鼠不予任何干預(yù)。根據(jù)人與動物體表面積折算的等效劑量比值表進行劑量換算，確定沖和膏（以凍干粉質(zhì)量計）、復(fù)方多黏菌素B 軟膏的劑量均為0.43 g/d。

2.3.2 標本采集與處理

分別于給藥第3、7、14天，隨機取模型組、沖和膏組、西藥組大鼠6只，分離背部膿腫組織，一分為二，一份用10%中性福爾馬林溶液固定，于4 ℃下保存；另一份于－80 ℃下保存。分別于給藥第1、3、5、7、14 天，隨機取模型組、沖和膏組、西藥組大鼠6只，于腹主動脈取血，靜置離心后取血清于－80 ℃下保存。

2.3.3 皮下軟組織病理學(xué)觀察

取固定于中性福爾馬林溶液中的大鼠膿腫皮膚組織，包埋后切片，分別進行HE和Masson染色，觀察染色情況。

2.3.4 皮下軟組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2 和MMP-9蛋白表達的檢測

取凍存的大鼠膿腫皮膚組織80 mg，加入裂解液和蛋白抑制酶，于液氮環(huán)境下研磨后提取總蛋白，檢測其中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2 和MMP-9 蛋白的表達，以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參進行蛋白定量分析。

2.3.5 血清中bFGF、TGF-β含量的檢測

取凍存的大鼠血清，按試劑盒說明書方法操作，檢測血清中bFGF、TGF-β含量。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用或±s表示，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗（方差齊）或Dunnett’sT3 檢驗（方差不齊）；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則用非參數(shù)檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 體外抑菌實驗結(jié)果

如圖1所示，與生理鹽水相比，當沖和膏質(zhì)量濃度為25 mg/mL 時，沖和膏只對金黃色葡萄球菌有抑菌作用（P＜0.05），對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色葡萄球菌、肺炎鏈球菌的抑菌效果不明顯（P＞0.05）；當沖和膏質(zhì)量濃度為400 mg/mL 時，沖和膏對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色葡萄球菌的抑菌效果較好（P＜0.05），對肺炎鏈球菌的抑菌效果不明顯（P＞0.05）。

圖1 不同質(zhì)量濃度沖和膏和生理鹽水對5種常見細菌的抑菌作用比較（n＝5）

3.2 體內(nèi)實驗結(jié)果

3.2.1 沖和膏對大鼠皮下軟組織病理學(xué)的影響

HE染色結(jié)果（圖2）顯示，給藥第3天，模型組、沖和膏組、西藥組大鼠皮下軟組織可見明顯膿腫灶，灶內(nèi)充滿大量細胞碎片，真皮結(jié)構(gòu)遭到破壞，3 組皆有大量炎癥細胞浸潤。給藥第7 天，與模型組相比，沖和膏組和西藥組大鼠的膿腫組織逐漸消失，纖維細胞逐漸增多并形成結(jié)締組織，將膿液包裹，其中沖和膏組效果更明顯。給藥第14 天，與模型組相比，西藥組和沖和膏組大鼠的膿腫組織減少更為明顯，其中沖和膏組大鼠膿腫組織減少最明顯，且真皮下各附屬器逐漸形成，細胞排列有序。

圖2 各組大鼠皮下軟組織的HE染色顯微圖

Masson染色結(jié)果（圖3）顯示，給藥第3天，模型組大鼠皮下軟組織中膠原纖維斷裂，排列散亂無章；與模型組相比，沖和膏組和西藥組大鼠的纖維排列較為整齊，其中沖和膏組效果更為明顯；3 組均可見膠原沉積。給藥第7天，模型組大鼠的膠原纖維分布稀疏，排列紊亂；與模型組相比，沖和膏組和西藥組大鼠的膠原纖維形成較多且較粗壯，包繞肌纖維，其中沖和膏組大鼠的膠原纖維排列更為緊密有序，膠原沉積區(qū)域更大。給藥第14天，與模型組相比，沖和膏組和西藥組大鼠的膠原纖維排列有序，膠原沉積明顯，其中沖和膏組的修復(fù)最好，基本完成再上皮化。

圖3 各組大鼠皮下軟組織的Masson染色顯微圖

3.2.2 沖和膏對大鼠皮下軟組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2和MMP-9蛋白表達量的影響

給藥第7天，與模型組相比，沖和膏組大鼠皮下軟組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白的表達量均顯著升高，MMP-2、MMP-9 蛋白的表達量均顯著降低（P＜0.05）；西藥組大鼠皮下軟組織中MMP-2蛋白的表達量顯著降低（P＜0.05）。給藥第14天，與模型組相比，沖和膏組和西藥組大鼠皮下軟組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原（西藥組除外）蛋白的表達量均顯著降低，MMP-2 和MMP-9（西藥組除外）蛋白的表達量均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 各組大鼠皮下軟組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2和MMP-9蛋白表達的電泳圖

圖5 各組大鼠皮下軟組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、MMP-2和MMP-9蛋白表達量比較（±s，n＝6）

3.2.3 沖和膏對大鼠血清bFGF、TGF-β含量的影響

各藥物組大鼠血清bFGF、TGF-β 含量在實驗過程中均呈先增后減的趨勢，并在第7天達峰值。與模型組相比，沖和膏組和西藥組大鼠給藥第5、7 天的血清中bFGF（第5 天西藥組除外）、TGF-β 含量均顯著升高，給藥第14 天的血清bFGF、TGF-β 含量均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖6。

圖6 各組大鼠血清中bFGF、TGF-β含量比較（n＝6）

4 討論

腫瘍?yōu)榀彲兂跗陔A段[1]，《外科發(fā)揮》曰：“腫瘍，謂瘡未出膿者”，表現(xiàn)為局部“陽熱腫痛”之證，進而發(fā)展至“熱盛肉腐，肉腐成膿”階段[13]。腫瘍與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的感染化膿性疾病類似，多由金黃色葡萄球菌感染所致。

中醫(yī)認為，腫瘍病機為氣血凝滯[14]，常采用“箍圍”治法[15]，就是將藥物敷在腫瘍周圍部位而中間留一個半徑為1寸的圓孔（不敷藥物），從而使病邪有所出，同時使患處受限，截斷疾病的傳變和蔓延?！跋劝参词苄爸亍?，防止邪毒擴散，以縮短病程[16]。沖和膏作為箍圍藥的代表方，其君藥紫荊皮能破氣逐血，消腫；臣藥獨活能祛風(fēng)除濕、止痛；佐藥石菖蒲可行氣、消腫、止痛；佐藥赤芍可清熱涼血、散瘀止痛；使藥白芷可活血化瘀、消腫排膿[5]。全方不含純補之藥，亦不含純泄之藥，以疏通為主，共奏行氣疏風(fēng)、活血定痛、散瘀消腫之功效[4，17]。方中紫荊皮性平，余下4味藥中獨活、石菖蒲、白芷為溫性藥，赤芍為微寒性藥，寒溫兼顧以溫為主，以助氣血運行通暢[4]，從而促進腫瘍消散。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，細菌感染時產(chǎn)生的毒素能夠使局部組織壞死，同時能刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，誘發(fā)白細胞吞噬細菌，而白細胞在吞噬一定量的細菌后就會死亡，死亡的白細胞、細菌、壞死組織等形成膿液[18]。抑菌實驗結(jié)果表明，沖和膏對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，且隨著濃度的增加，抑菌作用有增強的趨勢。這4種菌株中，金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，銅綠假單胞菌、大腸埃希菌為革蘭氏陰性桿菌。從這點初步分析可知，沖和膏對于細菌具有廣譜的抗菌作用，能夠有效殺滅金黃色葡萄球菌等細菌，從而減少白細胞的死亡，減少膿液的產(chǎn)生，限制腫瘍進一步發(fā)展，縮短疾病病程。

組織發(fā)生液化壞死后形成含有膿液的空腔，感染部位由損傷階段進入修復(fù)階段。成纖維細胞在組織修復(fù)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其能執(zhí)行包括細胞遷移和增殖、細胞外基質(zhì)分泌和降解、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)在內(nèi)的多種生物功能[19]。bFGF是成纖維細胞生長因子家族成員之一，能夠促進膠原纖維的合成[20]；TGF-β 被認為是傷口細胞外基質(zhì)聚集、收縮和異常修復(fù)的關(guān)鍵調(diào)控因素[21]。bFGF、TGF-β對成纖維細胞有很強的促分裂及刺激增生、趨化移行的作用。本研究結(jié)果顯示，沖和膏在組織修復(fù)早期可以促進膿腫組織中bFGF、TGF-β的分泌，進而激活成纖維細胞，促進組織修復(fù)。被激活的成纖維細胞可合成和分泌膠原[22]。膠原作為構(gòu)成修復(fù)組織的主要細胞外基質(zhì)成分，類型很多，其中含量較豐富的是Ⅰ型和Ⅲ型膠原[23]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)沖和膏干預(yù)后，大鼠皮下組織中膠原纖維形成增加，其排列分布由紊亂逐漸變?yōu)檎R。隨著組織修復(fù)進程的推進，膠原將進行重塑，這主要是由MMP 蛋白家族介導(dǎo)的[24]。MMP-2、MMP-9 蛋白是組織損傷后重建的主要酶種，能夠降解基底膜和細胞外基質(zhì)，對膠原的重塑具有重要作用[25]。本研究結(jié)果顯示，沖和膏可通過調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9蛋白的表達來促進膠原重塑、肉芽組織生成，進而填充膿腔、修復(fù)缺損，最終達到促進組織修復(fù)的目的。

綜上所述，沖和膏具有抑菌作用，可能通過調(diào)控膠原蛋白的合成與降解，增加膿腫組織中bFGF、TGF-β的分泌，從而起到促進腫瘍消散的作用。然而本研究只是初步探明了沖和膏促進腫瘍消散的機制，該方各有效成分對腫瘍愈合的具體影響尚有待進一步研究。