工作犬H3N2 亞型犬流感血清學(xué)調(diào)查分析

秦海斌 包喜軍 李金峰 賀星亮 朱 騫 陳 舒

21世紀(jì)以來，新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）、甲型H1N1 流感、甲型H7N9 流感、埃博拉病毒、寨卡病毒等新病毒導(dǎo)致的人類重大疫情接連發(fā)生，對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重挑戰(zhàn)，不斷提醒科學(xué)界對具備人際傳播能力的動物源病毒要加倍關(guān)注。甲型流感病毒作為人和動物間交叉?zhèn)鞑サ拇?，極易在病毒變異進程獲得人際傳播能力，導(dǎo)致人際間流行和人類疫病的暴發(fā)，這種跨越物種間感染障礙的變異往往通過哺乳動物作為中間宿主來實現(xiàn)，歷史上多次流感病毒大流行都經(jīng)歷了禽流感、豬流感與人流感病毒的基因重組過程，從而獲得了適應(yīng)人類性突變，豬被認(rèn)為是甲型流感病毒變異的典型中間宿主。通常一種新的中間宿主的出現(xiàn)，預(yù)示著病毒與人類感染相關(guān)的氨基酸突變已經(jīng)積累到一定程度，也預(yù)示著新的疫情的暴發(fā)。

令人擔(dān)憂的是，另一個可能的甲型流感病毒新的中間宿主在過去十年間正在悄然出現(xiàn)。研究證實，犬易受禽源流感病毒（H3N2 和H5N1）、馬源流感病毒（H3N8）或人類流感病毒（pdmH1N1 和H3N2）的感染，而且發(fā)生了不同宿主來源的犬流感病毒重組事件，如犬H3N2 和人類H1N1、犬H3N2 和豬流感病毒的重組，犬作為流感病毒基因“混合器”的作用日益明顯。犬能夠成為異源病毒中間宿主，是因為其呼吸道中同時具有動物源流感病毒和人源流感病毒的感染受體：α2,3-半乳糖苷受體和α2,6-半乳糖苷受體?，F(xiàn)在，禽源流感病毒H3N2 和馬源流感病毒H3N8 完全跨越了禽和馬的物種屏障，在犬中形成了廣泛傳播的新的病毒譜系，被命名為犬流感病毒（Canine influenza virus，CIV），這加劇了科學(xué)界對犬流感病毒的擔(dān)憂，因為犬作為人類重要的伴侶動物，其種群數(shù)量在全世界已經(jīng)達到9 億多頭，而且犬與人的生命活動高度融合，一旦病毒在犬中發(fā)生適應(yīng)人類性突變，病毒的人際傳播將更加猛烈，因此，犬流感病毒在人類公共衛(wèi)生領(lǐng)域受到高度重視。

在工作犬領(lǐng)域，犬流感的流行已成為常態(tài)，在日常訓(xùn)練和大型活動安保警犬集結(jié)的過程中發(fā)病率很高，工作犬在公共安全領(lǐng)域能夠發(fā)揮其重要作用是基于其靈敏嗅覺，而CIV 引起的流感樣癥候群不僅導(dǎo)致犬在病期內(nèi)嗅覺喪失，即便疾病結(jié)束，依然有一定比例的犬發(fā)生嗅覺長期減退，但目前工作犬領(lǐng)域內(nèi)對此類情況的研究數(shù)據(jù)較少，極大地限制了工作犬犬流感的疫情防控。為獲得工作犬犬流感的流行數(shù)據(jù)，本文以H3N2 亞型犬流感為調(diào)查對象，對實驗室在2017 年至2019 年間采集自全國各地的1300 多份血清進行了調(diào)查，獲得了工作犬犬流感的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)，并對犬流感的流行現(xiàn)狀進行了分析，旨在為我國工作犬的犬流感防控提供技術(shù)支持。

一、樣本來源

本次血清調(diào)查樣本主要來源于工作犬技術(shù)培訓(xùn)過程中的訓(xùn)練犬，犬種包括拉布拉多犬、史賓格犬、德國牧羊犬、馬里努阿犬及少量其他犬種，年齡6 個月至3 歲，工作犬血清樣本共計1317 份（見表1），同時采集寵物犬樣本373 例作為對照（見表2）。

表2 寵物犬血清流行病學(xué)調(diào)查采樣情況及CIV 陽性率

二、血清檢測

血清采集后，以商品化的間接ELISA 檢測試劑盒進行測定，同時以HA/HI 實驗進行符合率驗證，記錄ELISA 檢測結(jié)果，對地區(qū)、犬齡因素與CIV 感染的關(guān)系進行統(tǒng)計分析。工作犬CIV 檢測情況見表1，寵物犬CIV 檢測情況見表2，不同犬齡的CIV 感染情況見表3。

表3 不同犬齡段工作犬的CIV 陽性率

三、調(diào)查結(jié)果

在本次調(diào)查的樣本中，工作犬H3N2 的陽性率為8.43%，寵物犬的陽性率為12.06%，CIV 陽性率工作犬顯著低于寵物犬；采樣地之間的陽性率存在較大差異，從2%至17.24%不等；進口犬在檢疫期內(nèi)的陽性率為0，提示我國工作犬的CIV感染源主要來自國內(nèi)毒株。

有年齡記錄的血清樣本共計368 份，其中陽性38 份，陽性率為10.33%，H3N2 陽性率與年齡相關(guān)，5 ～7 歲犬的陽性率最高，占總體陽性總數(shù)的14.81%，見表3。

四、討論分析

犬對多種流感病毒呈現(xiàn)易感性，但迄今為止只有馬源H3N8 和禽源H3N2 病毒在犬群中形成穩(wěn)定譜系并在世界范圍內(nèi)流行，因此當(dāng)前犬流感病毒僅有H3N8、H3N2 兩個亞型。犬流感H3N8 亞型最早于2004 年報道于美國，發(fā)病起始于賽犬，目前流行于北美地區(qū)，我國尚未出現(xiàn)H3N8 流行的報道。與H3N8 CIV 相比，H3N2 CIV 的宿主范圍更廣，可感染多種哺乳動物，包括雪貂、豚鼠、小鼠和貓；H3N2 亞型于2006 年首次在中國廣東被分離出來，與韓國水禽H3N2 禽流感病毒基因關(guān)系最密切，此后H3N2 CIV 在中國、韓國、東南亞迅速傳播并成為優(yōu)勢亞型；H3N2 CIV 自2015 年開始在美國流行，但流行頻率和區(qū)域遠遠小于H3N8 亞型，因此在美國和歐洲地區(qū)的犬流感主要為H3N8亞型。

國內(nèi)有研究團隊自2012 至2019 年從中國9 個省市采集了4174份有呼吸道癥狀的犬的鼻咽拭子，開展H3N2 亞型犬流感的病原學(xué)調(diào)查，病毒分離實驗顯示其中235 份為H3N2 犬流感病毒（CIV）陽性，分離率由2012 年1.98%上升至2019 年10.85%，禽源H3N2 CIV 對犬的適應(yīng)性顯著提高；在上述研究中10.85%的病毒分離率與本文血清學(xué)調(diào)查中寵物犬的12.06%的血清陽性率相比，陽性率略低，但從技術(shù)角度分析，這兩個調(diào)查結(jié)果的數(shù)據(jù)是一致的，因為病毒分離技術(shù)只在病毒活力和滴度高于檢測閾值時才會呈現(xiàn)陽性，靈敏度略低，而血清學(xué)檢測的靈敏度較高，結(jié)果較為客觀準(zhǔn)確。

在血清學(xué)回顧調(diào)查方面，一項2019 至2020 年上海市犬流感流行情況及傳播風(fēng)險評估報告顯示，803 份流浪犬血清和790 份寵物犬血清中，流浪犬陽性率18.3%，寵物犬陽性率為7.2%；對2013 廣東省內(nèi)6地市的1440 份犬血清樣品進行抗體檢測，犬流感抗體平均陽性率為7.9%，這說明流浪犬的感染率遠高于伴侶犬和工作犬；寵物犬與工作犬的H3N2 CIV 感染率與地域相關(guān)，沒有嚴(yán)格的高低界限，在北方某些地區(qū)的感染率甚至超過30%。

對過去10 年間全球主要H3N2 CIV 流行毒株進行全基因組測序和遺傳演化分析，發(fā)現(xiàn)犬H3N2 CIV具備了人型受體結(jié)合能力，病毒在原代人支氣管上皮細胞（NHBE）中的復(fù)制能力也逐漸增加，在雪貂模型中還獲得了100%的呼吸道飛沫傳播率；在人的抗感染免疫方面，人類對H3N2 CIV 缺乏群體免疫力，從季節(jié)性流感病毒中獲得的被動免疫力也不能對H3N2 CIV提供保護。筆者團隊對工作犬體內(nèi)H3N2 CIV 受體的相關(guān)研究也證實，英國史賓格犬體內(nèi)有20 多個組織器官中同時存在2 種類型的流感病毒受體，尤其在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)的組織中2 種流感病毒受體的表達量最為豐富，這提示工作犬同樣是流感病毒“基因混合”的重要潛在宿主。因此，H3N2 CIV 對犬的健康及公共衛(wèi)生安全威脅性日益增強，但值得慶幸的是，迄今為止H3N2 CIV 直接感染人尚缺乏直接證據(jù)和病例報道。

綜上，本文完成了工作犬H3N2 CIV 的血清學(xué)調(diào)查，初步證實了H3N2 亞型犬流感病毒在我國的工作犬中的廣泛流行。因此，基于工作犬對公共安全的重要作用和犬流感病毒對公共衛(wèi)生的潛在威脅這雙重因素考慮，犬流感的診斷、治療和預(yù)防體系急需進一步建設(shè)完善，工作犬的犬流感防控值得加倍重視。