IL-33及其受體ST2L在銀屑病患者外周血T細(xì)胞及皮損組織中的表達(dá)①

張麗麗 劉霄霄 孫瑞雪 王 菲 杜紅陽（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，錦州 121012）

銀屑病是一種由遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)的免疫介導(dǎo)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病。對患者的皮膚、心理健康甚至全身器官均可造成損害。目前其確切病因尚不清楚，但Th17 細(xì)胞及IL-23/IL-17軸在銀屑病發(fā)病機(jī)制中可能處于關(guān)鍵地位，并且針對IL-17A、IL-23、TNF-α 治療靶點(diǎn)的生物制劑已在臨床治療中廣泛應(yīng)用。IL-33 是IL-1 細(xì)胞因子超家族成員，組成性地表達(dá)于多種人類組織細(xì)胞上，在皮膚組織細(xì)胞上呈現(xiàn)一定表達(dá)。其受體ST2 基因在結(jié)構(gòu)上與其他IL-1 受體（IL-1R）相似，而ST2L是IL-33的跨模型受體。IL-33與ST2L結(jié)合，并與IL-1 受體輔助蛋白（IL-1RAcP）形成復(fù)合物結(jié)合后發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。但目前IL-33 及其受體ST2L 在銀屑病患者和正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、外周血T 細(xì)胞中的表達(dá)水平尚不清楚。因此，本研究分析了尋常型銀屑病和膿皰型銀屑病患者血清和皮損組織中IL-33 及其受體ST2L 的表達(dá)水平，旨在說明這些分子可能與銀屑病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，為未來尋找銀屑病的潛在治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選擇2022 年1 月至2022 年8 月在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院初次就診的尋常型銀屑病（PV組）患者20例和膿皰型銀屑?。≒P組）患者20 例，同時收集20 例行體表色素痣切除者作為對照組（CON 組）。各組在年齡、性別上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。PV 組和PP 組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《銀屑病診療指南》尋常型銀屑病和膿皰型銀屑病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，部分臨床表現(xiàn)不典型者行病理檢查，根據(jù)銀屑病典型組織病理改變進(jìn)行確診；②近3 個月來未經(jīng)任何系統(tǒng)和局部治療；③排除其他皮膚疾病、合并其他自身免疫性疾病或其他系統(tǒng)性疾病等。CON 組納入標(biāo)準(zhǔn)：無全身各系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會同意，患者簽署知情告知書，倫理審批號：2022015。

1.1.2 主要試劑 人Jurkat T 細(xì)胞株（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所）；HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞（空軍總醫(yī)院中心實驗室）；兔抗人ST2L 抗體（Bioreagents公司）。

1.2 方法

1.2.1 皮損組織提取及處理 在銀屑病患者皮損區(qū)常規(guī)消毒后，用手術(shù)刀切取梭形皮膚組織，大小約1.5 cm×0.5 cm，取材深度0.2 cm～0.4 cm，縫合切口，對照組非皮損區(qū)按照同樣方法進(jìn)行取材。將獲取的組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋制作石蠟切片。采用免疫組織化學(xué)Envision 2步法，操作方法按說明書進(jìn)行。IL-33 和ST2L 抗體稀釋倍數(shù)均為1∶100，一抗4 ℃過夜。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。

1.2.2 Jurkat T 細(xì)胞和HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)

Jurkat T 細(xì)胞置于T 細(xì)胞的培養(yǎng)液（RPMI 1640，15% 小牛血清、2%Na2CO3、1%HEPES、青霉素100 U/ml、慶大霉素100 U/ml），5%CO2、37 ℃、30%濕度條件下培養(yǎng)。HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞在含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的改良DMEM 培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞單層鋪滿培養(yǎng)瓶后，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗1 次，加0.25%胰蛋白酶消化液，待鏡下細(xì)胞圓縮時，DMEM 培養(yǎng)液終止消化，細(xì)胞收集于離心管中，600 g 離心5 min，棄上清，將細(xì)胞懸液分別移至冷凍管中，每管1.5 ml，將凍存管先置于4 ℃冰箱2 h，再移至-80 ℃低溫冰箱24 h，置于-196 ℃液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 外周血T 細(xì)胞的分離 圓底試管中放入淋巴細(xì)胞分離液2 ml。在另一試管中加靜脈抗凝血（每毫升血液加20 單位肝素）2 ml，再加入同等量的Hanks 液使血液稀釋。用毛細(xì)吸管將抗凝稀釋的血液沿管壁滴入分離液試管中。放入離心機(jī)中，20 ℃條件下2 000 r/min 離心20 min。取出試管，將一毛細(xì)吸管伸入界面白色細(xì)胞層，將細(xì)胞吸出后移到另一試管中，加入1 ml Hanks液，懸浮細(xì)胞。

1.2.4 純化T 細(xì)胞 將全血加入1 個離心管中，加入抗凝劑，在800 g、4 ℃下離心15 min，將血漿吸取至另一個潔凈的離心管中，在56 ℃滅火30 min，再以相同的條件離心30 min，去除沉淀物，收集上清液完成分離。在一個潔凈的試管中，用0.9%NaCl 溶液稀釋全血，使其混合均勻，然后將上清液抽取到另一潔凈的離心管中，加入分離液，將稀釋過的全血鋪在分離液液面上部，在300～500 g、20 ℃下離心30 min，直到形成白膜層，將白膜層抽取至一離心管中，加入0.9%NaCl注射液稀釋至適當(dāng)濃度，混合均勻后在400～500 g、20 ℃下離心10 min，棄上清液，再重復(fù)此過程，以清洗淋巴細(xì)胞；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，加入磁珠分離液重懸，根據(jù)每1×107個細(xì)胞對應(yīng)2～20 μl CD3 reagent 的比例加入所需CD3 Reagent，混合均勻，在4 ℃下靜置15 min，取出混勻后，在 300 g、20 ℃下離心10 min，棄上清液，加入磁珠分離液重懸，以此純化T 細(xì)胞，采用層析柱分離出來，完成T淋巴細(xì)胞的純化。

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測經(jīng)IL-17A 誘導(dǎo)后Jurkat T 細(xì)胞、HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞、T細(xì)胞中IL-33、ST2L 蛋白表達(dá)水平 配制上層和下層膠并插入梳子，待膠凝固后加入5 μl 蛋白樣品和Marker 進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠，剪相應(yīng)大小的PVDF 膜，加入電轉(zhuǎn)液中進(jìn)行電轉(zhuǎn)，牛奶封閉，加入IL-33（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后分別加入二抗（1∶1 000）孵育1 h，采用化學(xué)發(fā)光法檢測目的條帶的灰度值，以目的蛋白與β-actin 灰度值比值作為蛋白表達(dá)水平。所有實驗重復(fù)3次。

1.2.6 RT-PCR 測定經(jīng)IL-17A、IL-33 誘導(dǎo)后Jurkat T 細(xì)胞、HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-33 mRNA 表達(dá)

提取培養(yǎng)48 h 后Jurkat T 細(xì)胞、HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞和各組T 細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，目的基因IL-33正向引物：5′-AATCAGGTGACGGTGTTG-3′，反向引物：5′-TGAAACACAGTTGGAGTGC-3′；ST2L正向引物：5′-CCCACATTCAATAGGACTG-3′，反向引物：5′-AAGAGGTGCTGTCCAGTTG-3′；GAPDH 正向引物：5′-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3′，反向引物：5′-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3′。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR 反應(yīng)體系為25 μl，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 預(yù)變性 30 s，循環(huán)1 次；95 ℃ 變性5 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，95 ℃30 s，循環(huán)40 次。熔解曲線分析：將樣品放置在67 ℃中保溫15 s，接著以1 ℃/5 s 速度升溫至95 ℃。利用EASY Dilution 將cDNA 溶液按10、100、1 000、10 000、100 000 梯度稀釋（10 倍濃度稀釋）后，各取2 μl 進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng)。20 μl PCR 反應(yīng)液中cDNA添加量分別相當(dāng)于重100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg 的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 量。通過使用實時定量PCR 對各組細(xì)胞中IL-33、ST2L 和GAPDH基因表達(dá)進(jìn)行實時定量分析，采用雙標(biāo)曲線法來評估相互關(guān)系。采用GAPDH 作為內(nèi)參，各個樣品的同一個基因經(jīng)過3 次重復(fù)實驗，并使用去離子水取代模板作陰性對照。計算出目的基因的相對表達(dá)量，采用2-ΔΔCt表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS25.0 和GraphPad Prism 6 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并制圖。采用Image J 軟件計算免疫組化圖片的光密度值和各種染色圖片中陽性細(xì)胞數(shù)，計量資料以表示。當(dāng)某一組樣本量<5時，采用Fisher檢驗，結(jié)果方差齊兩樣本間比較采用t檢驗，多組間比較以方差分析q檢驗，相關(guān)分析采用Pearson 檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 在CON 組皮損組織中，IL-33蛋白僅少量表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞核中，表皮層中的角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)無陽性表達(dá)，且ST2L 蛋白在CON 組的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞膜上無陽性表達(dá)，在真皮浸潤的細(xì)胞膜上有極少量表達(dá)；在PV組和PP組患者的皮損中，IL-33及其受體ST2L蛋白在表皮和真皮細(xì)胞中均有不同密度的陽性染色，見圖1。免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，IL-33 蛋白主要在HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核和部分胞質(zhì)有表達(dá)，見圖2。

圖1 免疫組織化學(xué)染色檢測各組皮損組織中IL-33及其受體ST2L表達(dá)Fig.1 Expressions of IL-33 and its receptor ST2L in each groups of skin lesions were detected by immunohistochemical staining

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測HaCat角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-33的表達(dá)（×40）Fig.2 Expression of IL-33 in HaCat keratinocytes was detected by immunocytochemistry（×40）

2.2 Western blot 法檢測經(jīng)IL-17A 誘導(dǎo)Jurkat T 細(xì)胞中IL-33 蛋白表達(dá) 不同濃度IL-17A 誘導(dǎo)Jurkat T 細(xì)胞表達(dá)IL-33 蛋白量不同，呈劑量依賴性，見圖3A；IL-17A（200 ng/ml）誘導(dǎo)Jurkat T 細(xì)胞表達(dá)IL-33蛋白量在24 h為最高，見圖3B。

圖3 Western blot 法檢測經(jīng)IL-17A 誘導(dǎo)Jurkat T 細(xì) 胞中IL-33蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of IL-33 protein in Jurkat T cells induced by IL-17A was detected by Western blot

2.3 Western blot 法檢測IL-17A 誘導(dǎo)HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞IL-33 蛋白表達(dá)情況 不同濃度IL-17A 誘導(dǎo)HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)IL-33 蛋白量不同，呈劑量依賴性，結(jié)果見圖4A。不同濃度IL-17A 誘導(dǎo)HaCat角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá)IL-33 蛋白量呈濃度依賴性，結(jié)果見圖4B。

2.4 Western blot法檢測各組T細(xì)胞中IL-33蛋白表達(dá)量 與CON 組比較，PV 組、PP 組T 細(xì)胞中IL-33蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），其中PP組表達(dá)量明顯高于PV組，結(jié)果見圖5。

圖5 Western blot 法檢測各組和CON 組T 細(xì)胞中IL-33蛋白表達(dá)量Fig.5 Expression of IL-33 protein in T cells in each group was detected by Western blot

2.5 Western blot 法檢測IL-33 誘導(dǎo)Jurkat T 細(xì)胞后各組T 細(xì)胞中ST2L 蛋白表達(dá)情況 IL-33 誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞后PV 組和PP組患者T細(xì)胞均可表達(dá)一定量ST2L 蛋白，呈劑量依賴性，見圖6；PV 組和PP 組中ST2L 蛋白表達(dá)高于CON 組在同一濃度IL-33 誘導(dǎo)產(chǎn)生的ST2L 水平；其中PP 組在IL-33（100 ng/ml）和IL-33（200 ng/ml）濃度誘導(dǎo)下產(chǎn)生的ST2L 水平均高于PV組。

圖6 Western blot 法檢測IL-33 誘導(dǎo)Jurkat T 細(xì)胞后各組T細(xì)胞ST2L蛋白表達(dá)量Fig.6 Expression of ST2L protein in Jurkat T cells after IL-33 induction was detected by Western blot

2.6 RT-PCR 檢 測IL-17A 誘 導(dǎo)Jurkat T 細(xì)胞后IL-33 mRNA 表達(dá)量 不同濃度IL-17A 誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞后IL-33 mRNA 表達(dá)量不同，呈劑量依賴性，見圖7A；IL-17A（200 ng/ml）誘導(dǎo)Jurkat T 細(xì)胞后在24 h時IL-33 mRNA表達(dá)量最高，見圖7B。

圖7 RT-PCR 檢測IL-17A 誘導(dǎo)Jurkat T 細(xì)胞后IL-33 mRNA表達(dá)Fig.7 Expression of IL-33 mRNA in Jurkat T cells induced by IL-17A was detected by RT-PCR

2.7 RT-PCR檢測IL-17A誘導(dǎo)后HaCat角質(zhì)形成細(xì)胞中IL-33 mRNA 表達(dá)量 不同濃度IL-17A 誘導(dǎo)HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞后IL-33 mRNA 表達(dá)量不同，且呈劑量依賴性，見圖8。

圖8 RT-PCR 檢測IL-17A 誘導(dǎo)HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞IL-33 mRNA表達(dá)量Fig.8 IL-33 mRNA expression in HaCat keratinocytes induced by IL-17A was detected by RT-PCR

2.8 RT-PCR 檢測各組T 細(xì)胞中IL-33 表達(dá)情況PV組和PP組中IL-33 mRNA有明顯表達(dá)，PP組表達(dá)量高于PV組，且均高于CON組，見圖9。

圖9 RT-PCR檢測各組T細(xì)胞中IL-33表達(dá)量Fig.9 RT-PCR detected expression of IL-33 in T cells in each group

2.9 RT-PCR 檢測IL-33 誘導(dǎo)Jurkat T 細(xì)胞后各組T細(xì)胞中ST2L mRNA 表達(dá)情況 不同濃度IL-33誘導(dǎo)Jurkat T 細(xì)胞后PV 組和PP 組患者的T 細(xì)胞均可表達(dá)一定量ST2L mRNA，呈劑量依賴性，PV組和PP組中ST2L mRNA 表達(dá)高于在同一濃度CON 組IL-33誘導(dǎo)產(chǎn)生的ST2L mRNA 水平，見圖10A；以50 ng/ml終濃度IL-33 誘導(dǎo)各組細(xì)胞，從0 h 至12 h 各組細(xì)胞表達(dá)ST2L mRNA 呈上升趨勢，12 h 至24 h 呈下降趨勢，其中PV 組和PP 組表達(dá)ST2L mRNA 顯著高于同一時間點(diǎn)CON組水平，見圖10B。

圖10 RT-PCR檢測IL-33誘導(dǎo)Jurkat T細(xì)胞后各組T細(xì)胞中ST2L mRNA表達(dá)Fig.10 Expression of ST2L mRNA in Jurkat T cells after IL-33 induction was detected by RT-PCR

3 討論

銀屑病的確切病因尚未清楚，目前認(rèn)為遺傳因素與環(huán)境因素相互作用，從而導(dǎo)致銀屑病發(fā)生或加重。TNF-α 和 IFN-γ 已被證實是銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵因子，與疾病的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性［1-2］。目前臨床上應(yīng)用的生物制劑主要針對炎癥因子包括TNF-α、IL-12/23和IL-17A 等。為了發(fā)現(xiàn)更多的銀屑病治療靶點(diǎn)，本研究對IL-33/ST2L 在銀屑病發(fā)病機(jī)制的作用進(jìn)行討論。

IL-33 是IL-1 家族的新成員，研究表明IL-33 在體內(nèi)多種細(xì)胞中均可表達(dá)，其在皮膚組織細(xì)胞中高表達(dá)的特性受到關(guān)注；同時IL-33 在多種自身免疫性疾病的發(fā)病中起重要的作用，包括銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、特應(yīng)性皮炎和系統(tǒng)性硬化癥等［3］。本研究結(jié)果表明，在PV 組和PP 組皮損中，IL-33 及其受體ST2L 蛋白在表皮和真皮細(xì)胞中有不同密度的陽性染色，與ZENG 等［4］、DONG 等［5］的研究結(jié)果一致。IL-33 通過與其受體ST2L 結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)信號于細(xì)胞內(nèi)，其后通過下游的NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞的增殖和分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［6］。Th17 作為CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，可以分泌IL-17A、IL-17F、IL-22等，研究發(fā)現(xiàn)IL-17A 是銀屑病生理發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，IL-17A具有誘導(dǎo)趨化、抑制中性粒細(xì)胞凋亡、促進(jìn)新生血管形成、促進(jìn)活化的角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生更多趨化因子、促進(jìn)其他細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-8）生成等作用［7］。IL-17A 能夠誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞合成分泌IL-6、IL-8 等炎癥因子。角質(zhì)形成細(xì)胞核中表達(dá)IL-33 受到IL-17A 刺激后可以通過一定的調(diào)節(jié)機(jī)制，發(fā)揮減弱免疫反應(yīng)的作用［8］。Jurkat T細(xì)胞是來源于T 淋巴細(xì)胞和急性T 細(xì)胞白血病的細(xì)胞株，在血液病研究、基礎(chǔ)免疫研究以及藥理學(xué)研究方面有重要的作用［9］。人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）的增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)與銀屑病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［10-11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Jurkat T 細(xì)胞、HaCat 角質(zhì)形成細(xì)胞在IL-17A 誘導(dǎo)下IL-33 蛋白和IL-33 mRNA 呈高表達(dá)。IL-33 被認(rèn)為具有抗炎和促炎作用，IL-33/ST2 軸在自身免疫性疾病中可以促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的釋放，但在糖尿病等一些代謝性疾病中，IL-33 可被認(rèn)為其發(fā)揮了抗炎細(xì)胞因子的作用［12］。本研究中Jurkat T細(xì)胞、PV組、PP組T細(xì)胞在IL-33 誘導(dǎo)下ST2L 蛋白和ST2L mRNA 呈高表達(dá)，與DONG 等［5］的研究結(jié)果一致。這些結(jié)果說明IL-33及其受體ST2L 在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮了重要作用。

目前生物制劑治療銀屑病已取得良好的療效，但在生物制劑治療銀屑病的過程中，患者發(fā)生濕疹樣改變的情況也常有報道，其機(jī)制可能與免疫漂移、微生物定植、皮膚屏障破壞及遺傳因素有關(guān)［13］。既往研究顯示IL-33 及其受體ST2L 在AD 的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，并且其在銀屑病中也起重要作用，但是否是生物制劑引起免疫漂移的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究［14］。本研究初步證實了IL-33 及其受體ST2L表達(dá)與銀屑病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但在本研究中由于病例數(shù)量較少，尚未對關(guān)節(jié)病型銀屑病和紅皮病型銀屑病患者外周血T細(xì)胞和皮損進(jìn)行相關(guān)檢測，故結(jié)果可能存在一定局限性，未來需要擴(kuò)大樣本量，并且對各種類型銀屑病及其嚴(yán)重程度與IL-33/ST2L的相關(guān)性進(jìn)行更加深入的研究。從而進(jìn)一步明確IL-33/ST2L 受體與銀屑病的發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，探討其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為治療銀屑病尋找新的靶點(diǎn)。