HCST作為1型糖尿病潛在分子標(biāo)志物的篩選和機(jī)制探究①

侯永旺 楊志聰 史 麗（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，張家口 075000）

1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）是兒童最常見的慢性病之一，最常見的發(fā)病年齡為4～6歲和青春期早期（10～14歲）。T1DM的發(fā)病率和患病率一直穩(wěn)步上升，占糖尿病患者的5%～10%。在世界范圍內(nèi)，發(fā)病率也存在相當(dāng)大的地域差異。據(jù)報(bào)道，發(fā)病率最高的是芬蘭和其他北歐國(guó)家，其發(fā)病率約是報(bào)告發(fā)病率最低的中國(guó)和委內(nèi)瑞拉的400倍［1-3］。在T1DM中，胰島中的β細(xì)胞在數(shù)月或數(shù)年內(nèi)被免疫破壞，導(dǎo)致胰島素絕對(duì)缺乏。目前研究人員認(rèn)為該病存在遺傳傾向，與特定HLA（DR 和DQ）等位基因密切相關(guān)，且T1DM 具有家族遺傳傾向［4-8］。目前公認(rèn)的T1DM 與自身免疫應(yīng)答密切相關(guān)，最近有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-150 缺失通過細(xì)胞免疫應(yīng)答促進(jìn)T1DM 發(fā)生，TNFSF14在STZ 誘導(dǎo)的T1DM 中發(fā)揮重要作用，其可能通過下調(diào)CD4+FoxP3+Treg 分化介導(dǎo)T1DM 發(fā)生，這些研究說明免疫應(yīng)答異常與T1DM 密切相關(guān)［9-10］。現(xiàn)有的預(yù)測(cè)T1DM 的主要血清標(biāo)志物包括抗β細(xì)胞自身抗體、抗胰島素的自身抗體（IAA）、抗胰島素瘤相關(guān)抗原-2 的自身抗體（IA-2）、抗谷氨酸脫羧酶的自身抗體（GAD）、抗鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白8的自身抗體（ZnT8）和胰島細(xì)胞抗體（ICA），但有些抗體的陽性率不是很高［11-13］。因此探尋新的分子標(biāo)志物對(duì)于T1DM的預(yù)測(cè)和診斷治療具有重要意義。

本文主要通過生物信息學(xué)手段篩選出T1DM 患者中的71 個(gè)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），最終確定免疫相關(guān)基因造血細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子（hematopoietic cell signal transducer，HCST）為T1DM 的關(guān)鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)HCST 可以編碼跨膜信號(hào)適配器，并與C型凝集素樣受體NKG2D 形成免疫識(shí)別受體復(fù)合物，該復(fù)合物可能通過激活樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）、自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞和T 細(xì)胞在細(xì)胞的存活和增殖中發(fā)揮作用［14-15］。因此，HCST 可能是T1DM 的有效分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 資料 從GEO 數(shù)據(jù)庫搜索T1DM 和健康人群的外周血單個(gè)核細(xì)胞微陣列表達(dá)數(shù)據(jù)。通過篩選得到GPL570 平臺(tái)的GSE55098 數(shù)據(jù)集。該數(shù)據(jù)集中各包含10例健康人群和12例T1DM。

1.2 方法

1.2.1 篩選DEGs 從GEO 數(shù)據(jù)庫下載矩陣文件，借 助GEO2R 分 析DEGs（P<0.05，log2|FC| ≥1）。RStudio 軟件加載“gplots”“heatmap”“ggplot2”做熱圖和火山圖可視化分析。

1.2.2 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因篩選 利用String（https：//string-db.org/）對(duì)DEGs 進(jìn)行PPI 分析，設(shè)置combined sore>0.4對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行篩選，并利用Cytoscape 軟件（v3.8.0）進(jìn)行可視化。采用MCODE 插件對(duì)PPI 進(jìn)行加權(quán)網(wǎng)絡(luò)分析，篩選關(guān)鍵的子網(wǎng)絡(luò)和基因，并對(duì)子網(wǎng)絡(luò)做富集分析。利用cytoHubba 插件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行關(guān)鍵基因篩選，對(duì)4 種計(jì)算方式［MCC（maximun clique centrality）、DMNC（maximum neighborhood component）、MNC（maximun neighborhood component）和Degree］得到的前5 個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行Venn分析，確定最終的關(guān)鍵基因。

1.2.3 富集分析 借助DAVID 在線分析工具對(duì)PPI子網(wǎng)絡(luò)基因進(jìn)行GO（gene ontology）分析［包括生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）］和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。富集分析的結(jié)果通過在線網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn）進(jìn)行可視化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prims 9 軟件對(duì)兩組關(guān)鍵基因表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選DEGs 通過P<0.05 和log2|FC|≥1 的條件對(duì)GSE55098 數(shù)據(jù)集進(jìn)行篩選，T1DM 與對(duì)照組相比共得到71 個(gè)DEGs，其中有上調(diào)基因22 個(gè)，下調(diào)基因49個(gè)（圖1）。

圖1 DEGs的篩選Fig.1 Screen of DEGs

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及子網(wǎng)絡(luò)功能富集 PPI 分析結(jié)果顯示，String 設(shè)置0.4 的PPI 信任值，且僅顯示27 個(gè)節(jié)點(diǎn)，58 個(gè)互作關(guān)系（圖2A）。利用MCODE 插件篩選1 個(gè)關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，得分7.5，共有9 個(gè)節(jié)點(diǎn)和30 個(gè)互作關(guān)系（圖2B）。通過對(duì)子網(wǎng)絡(luò)的9 個(gè)基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，這9 個(gè)基因主要參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細(xì)胞的防御反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細(xì)胞溶解的生物過程，涉及的主要信號(hào)通路是NK 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用的信號(hào)通路（圖2C、表1）。

表1 GO和KEGG富集分析Tab.1 GO and KEGG enrichment analysis

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及子網(wǎng)絡(luò)功能富集Fig.2 PPI network construction and subnetwork function enrichment

2.3 關(guān)鍵基因篩選 MCC 算法得到前5 個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)橛蠵RF1、CCL4、KLRD1、HCST 和GNLY；DMNC算法得到的前5 個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)镠CST、GNLY、GZMH、NKG7 和NCAM1；MNC 算法得到的前5 個(gè)關(guān)鍵基因PRF1、KLRD1、CCL4、NKG7 和HCST；Degree算法得到的前5 個(gè)關(guān)鍵基因?yàn)镻RF1、CCL4、KLRD1、NKG7 和HCST（圖3A）。4 種算法得到的關(guān)鍵基因通過Venn 分析最終篩選出1 個(gè)關(guān)鍵基因，即HCST（圖3B）。

圖3 關(guān)鍵基因篩選Fig.3 Screen of hub genes

2.4 HCST 在T1DM 中的表達(dá)量及ROC 曲線 對(duì)GSE55098 數(shù)據(jù)集中10 例健康人群和12 例T1MD 患者的HCST 表達(dá)量進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示HCST 在T1DM 組的表達(dá)量明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4A）。HCST 的ROC 曲線分析結(jié)果顯示曲線下面積為0.983 3，P=0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4B）。

3 討論

T1MD 是由胰腺β 細(xì)胞與免疫系統(tǒng)間的復(fù)雜相互作用所引起。但是機(jī)體中針對(duì)β細(xì)胞的免疫反應(yīng)是隨機(jī)的還是存在誘發(fā)因素尚存在爭(zhēng)議［16-17］。一種長(zhǎng)期存在的假說認(rèn)為，病毒感染是T1DM 自身免疫反應(yīng)的潛在觸發(fā)因素。在病毒中，腸道病毒是研究最多的。糖尿病預(yù)測(cè)與預(yù)防研究證實(shí)了腸道病毒感染與第1個(gè)自身抗體出現(xiàn)間的關(guān)系［18］。但目前大多數(shù)對(duì)于T1DM 免疫功能障礙的研究集中在下游T細(xì)胞和B 細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)，而忽視了上游先天參與者如NK細(xì)胞的作用。研究發(fā)現(xiàn)，與T1DM 有關(guān)的許多病毒是慢性潛伏或溶原性感染，它們通過類似于妊娠耐受的機(jī)制降低NK細(xì)胞的反應(yīng)和數(shù)量。NK細(xì)胞對(duì)感染的抑制反應(yīng)導(dǎo)致不正確的信號(hào)傳導(dǎo)，這種不適當(dāng)?shù)目乖蔬f導(dǎo)致了CD8+淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒性［19-20］。

NK 細(xì)胞對(duì)病原體做出反應(yīng)并直接將其殺死，此外，NK 細(xì)胞還參與了適應(yīng)性免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和精細(xì)控制。最近的研究表明，NK 細(xì)胞控制下游反應(yīng)的效應(yīng)和抑制活性，包括激活或殺死抗原提呈細(xì)胞和Treg、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTLs）、T 輔助細(xì)胞（Th）和B 細(xì)胞［21-23］。NK 細(xì)胞的作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞毒性CD8+T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)，從而控制異?；蚵匝装Y反應(yīng)，避免未識(shí)別的細(xì)胞和組織遭到破壞［24］。EB病毒被證明能有效抑制NK 細(xì)胞，從而抑制NK 細(xì)胞對(duì)細(xì)胞毒性CD8+T 淋巴細(xì)胞反應(yīng)的調(diào)節(jié)［25-26］。研究發(fā)現(xiàn)，在NOD 模型中，NK 細(xì)胞介導(dǎo)CD8+細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的破壞可改善自身免疫性糖尿病［27］。

本文通過篩選GSE55098 數(shù)據(jù)集中T1DM 的差異基因并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，借助MCODE 插件篩選關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，通過對(duì)子網(wǎng)絡(luò)基因功能富集分析發(fā)現(xiàn)HCST及相關(guān)基因主要富集在NK 細(xì)胞導(dǎo)致的細(xì)胞毒信號(hào)途徑，并參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、細(xì)胞的防御反應(yīng)、免疫應(yīng)答及細(xì)胞溶解的生物過程。同時(shí)，本研究結(jié)果表明HCST 在T1DM 中表達(dá)量顯著降低。因此課題組認(rèn)為HCST 基因的降低引起了NK 細(xì)胞參與的固有免疫及相關(guān)信號(hào)通路的功能發(fā)生紊亂，這使得在發(fā)生病毒感染或存在其他誘導(dǎo)因素的情況下，NK 細(xì)胞的錯(cuò)誤遞呈作用導(dǎo)致了異常的細(xì)胞毒作用，最終胰島β 細(xì)胞遭到慢性損傷并導(dǎo)致T1DM 發(fā)生。這些結(jié)果與BAYER 等［19］的觀點(diǎn)相似，進(jìn)一步證實(shí)了本研究結(jié)果。ROC 曲線結(jié)果表明，HCST 可以成為診斷T1DM的潛在分子標(biāo)志物。

綜上所述，HCST 在T1DM 中表達(dá)量降低，或可成為診斷T1DM 的潛在分子標(biāo)志物。此外，HCST 引起了NK 細(xì)胞參與的固有免疫及相關(guān)信號(hào)通路的功能紊亂，導(dǎo)致T1DM 發(fā)生，因此HCST 可能成為治療T1DM的潛在靶點(diǎn)。